CC BY
4©Коллектив авторов, 2017 Вопросы онкологии, 2017. Том 63, № 1
УДК 616.33-006.615.28
А.р. галембикова1, С.В. Бойчук1, С.С.Зыкова2, р.р. Хуснутдинов1, П.д. дунаев1
пивалоил-замещенные 2-пирролоны индуцируют гибель гастроинтестинальных стромальных опухолей, резистентных к иматинибу и химиопрепаратам
1ФгБОу ВпО «казанский государственный медицинский университет», казань; 2Фгоу ВпО «пермская государственная фармацевтическая академия», пермь
представлены результаты исследований по оценке чувствительности клеток гастроинтестинальных стромальных опухолей (гисо) к некоторым химиопрепаратам (ингибиторы топоизомераз II типа, таксаны, винкаалка-лоиды), а также пивалоил-замещенным пир-рол-содержащим гетероциклическим соединениям (пЗпг). показан цитотоксический эффект вышеуказанных химиопрепаратов в отношение клеток гисо, чувствительных к иматинибу (иМ). Эффект пЗпг был выявлен как в отношении иМ-чувствительных, так и резистентных к иМ клеток гисо. пЗпг были также способны оказывать цитотокси-ческий эффект в отношении клеток гисо, резистентных к вышеуказанным химиопре-паратам. преимущественным механизмом гибели опухолевых клеток под действием пЗпг является апоптоз, что может быть следствием нарушений в М-фазе клеточного цикла и развитием митотической катастрофы.
ключевые слова: гастроинтестинальные стромальные опухоли (гисо), химиопре-параты, пивалоил-замещенные пиррол-со-держащие гетероциклические соединения (пЗпг), апоптоз
Открытие активирующих мутаций протоон-когена с-KIT в клетках гастроинтестинальных стромальных опухолей (ГИСО) явилось ключевым событием как с точки зрения диагностики данных злокачественных новообразований, так и с точки зрения наиболее ярких примеров последующего успешного использования таргетных препаратов в лечении онкологических больных [7, 10]. Обнаружение различных активирующих мутаций в генах с-KIT, а также PDGFRA позволили в дальнейшем разработать молекулярную классификацию ГИСО, определить прогностическое значение данных мутаций и степень чувствительности ГИСО к иматинибу и другим таргетным препаратам [4, 9]. На сегодняшний день проведение таргетной терапии иматинибом (Гливеком) является общепризнанным стандартом в лечении больных с рецидивными и дис-
семинированными формами ГИСО, позволяющим достичь почти 4-х кратного увеличения продолжительности жизни больных с данными формами заболевания. Несмотря на впечатляющие результаты от проведения таргетной терапии иматинибом (ИМ), более чем у половины пациентов с ГИСО в течение 2-х лет после начала терапии Им развивается резистентность к данному препарату, обусловленная развитием вторичных мутаций, в том числе, в 13, 14 и 17 экзонах гена с-KIT [9, 15]. Данный факт явился предпосылкой для разработки и внедрения в практическую онкологию таргетных препаратов второго и третьего поколения (сунитиниба и ре-горафениба, соответственно), что позволило добиться определенных успехов в лечении больных ГИСО, резистентных к ИМ [11].
В настоящее время проведение химиотерапии больным ГИСО считается малоперспективным, уровень ответа на химиотерапию, по данным разных авторов, варьирует от 0 до 27%, а медиана выживаемости пациентов, получавших системную химиотерапию, составляет от 14 до 18 месяцев. Тем не менее, данная точка зрения в настоящее время подвергается пересмотру. например, сравнительно недавно были опубликованы результаты, свидетельствующие о чувствительности опухолевых клеток ГИСО к отдельным цитостатическим химиопрепаратам как in vitro, так и in vivo [3, 6, 13, 14].
Исходя из вышеизложенного, целью настоящего исследования явилось изучение химиочув-ствительности ИМ-чувствительных и резистентных клеточных линий ГИСО к химиопрепаратам различных групп. Принимая во внимание полученные нами ранее результаты, свидетельствующие о высокой цитотоксической активности некоторых пивалоил-замещенных пиррол-содер-жащих гетероциклических соединений (ПЗПГ) в отношении опухолевых клеточных линий, относящихся к группе сарком мягких тканей [5] был также проведен сравнительный анализ их цитотоксических свойств в отношении клеточных линий ГИСО, в том числе, резистентных к ИМ и некоторым химиопрепаратам.
Материалы и методы исследования
Исследования проводились на клеточных линиях ГИСО, чувствительных и резистентных к ИМ (T-1 и 430, соответственно). В исследование был также включен полученный в нашей лаборатории клон опухолевых клеток линии ГИСО T-1 (T29-R), обладавший резистентностью к некоторым химиопрепаратам (паклитакселу, этопозиду, доксорубицину и др.). Клеточные линии ГИСО культивировали при 37оС и 5% СО2 в культуральной среде RPMI-1640 (ПАНЭКО, Россия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США), антибиотики (пенициллин и стрептомицин) и L-глутамин (ПАНЭКО, Россия). Клетки культивировали в присутствии Им, либо химио-препаратов доксорубицина, паклитаксела и винбластина (Sigma, США), этопозида (Calbiochem, США), а также 2-х соединений, относящихся к ПЗПГ, ранее проявивших цито-токсическую активность в отношении опухолевых клеток сарком мягких тканей [5].
Уровень экспрессии белков, являющихся маркерами нарушений М-фазы клеточного цикла, двунитевых разрывов ДНК и апоптоза оценивали методом иммуноблоттинга с использованием соответствующих моноклональных антител.
Для изучения цитотоксичности исследуемых химиопре-паратов в отношении клеточных линий ГИСО опухолевые клетки засевали в лунки плоскодонного 96-луночного куль-турального планшета (Сотг^, США). После достижения 70-80%-ной конфлюентности клеток в культуру клеток вносили ИМ или вышеуказанные химиопрепараты. Клетки культивировали с различными концентрациями хи-миопрепаратов в 3-х повторностях в течение 24-72 часа при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2. Пролиферативную способность клеток ГИСО определяли фотоколориметрически с помощью реагента CeUTiter 96® AQueous MTS Reagent Powder (Promega, США) с помощью планшетного анализатора Multiscan FC (Thermo Scientific, США) при длине волны 492 нм. Статистический анализ результатов проводили с помощью t-критерия Стьюдента в программе Microsoft Excel 2007.
Результаты и обсуждение
Было выявлено, что ингибиторы топоизоме-разы II типа (доксорубицин и этопозид), а также препараты, влияющие на динамическое состояние микротрубочек веретена деления (например, паклитаксел) оказывают дозо-зависимый цитотоксический эффект в отношении как ИМ-чувствительных, так и ИМ-резистентных опухолевых клеточных линий (T-1 и 430, соответственно). Примечательно, что ИМ-резистентная линия ГИСО 430 была значительно менее чувствительна к воздействию всех вышеуказанных химиопрепаратов (рис. 1 A, Б). Например, значения IC50 для доксорубицина составили 0.19±0.08 и 1.4±0.19 мг/мл в отношении клеточных линий T-1 и 430, соответственно.
В отличие от вышеуказанных химиопрепа-ратов, ПЗПГ оказывали выраженный дозо-за-висимый цитотоксический эффект in vitro как в отношение ИМ-чувствительных, так и ИМ-резистентных опухолевых клеток ГИСО. Например, значения IC50 для соединения № 1 составили 12,7 ± 0.08 и 14,1 ± 0.11 мкМ в отношении
клеточных линий Т-1 и 430, соответственно, а для соединения № 2 - 13,2 ± 0.21 и 16,5 ± 0.07 мкМ, соответственно.
Основным механизмом гибели клеток ГИСО под действием вышеназванных химиопрепара-тов, а также ПЗПГ, являлся апоптоз, о чем свидетельствовало значительное повышение уровней экспрессии расщепленных форм каспазы-3 и поли-(АДФ-рибоза)-полимеразы (ПАРП), являющихся общепризнанными маркерами апоптоза. Данный эффект был дозо-зависимым и коррелировал с описанными выше результатами исследований по изучению цитотоксичности. Например, для индукции апоптоза Им-резистентных ГИСО требовались более высокие концентрации доксорубицина и этопозида по сравнению с Им-чувствительными клетками ГИСО (рис. 2 Б и А, соответственно). Данная закономерность была также выявлена для химиопрепаратов, влияющих на динамическое состояние микротрубочек веретена деления (например, паклитаксела), а также для ПЗПГ (рис. 3).
Индукция апоптоза в клетках ГИСО под действием ингибиторов топоизомеразы II типа являлась следствием повреждений ДНК (двуни-тевых разрывов), о чем свидетельствовало повышение уровня экспрессии фосфорилированной по остаткам серина в положении 139 формы ги-стона 2А (у-Н2АХ) (рис. 2). Повышение уровня экспрессии у-Н2АХ под действием ПЗПГ также могло являться следствием нарушений регуляции клеточного цикла и накопления клеток ГИСО в М-фазе. В пользу данного положения свидетельствовали характерные для м-фазы морфологические изменения клеток ГИСО (накопление клеток округлой формы) спустя 24 часа их инкубации с вышеуказанными соединениями, а также изменение уровня экспрессии некоторых белков, селективно накапливающихся в М-фазе, в частности, фосфорилированной формы ро1о-подобной киназы-1 (PLK-1) (рис. 3).
Представленные данные коррелируют с полученными нами ранее результатами о способности ПЗПГ нарушать процессы полимеризации тубулина, повышать уровень экспрессии гистона Н3, фосфорилированного по остаткам серина в положении 10, и способствовать селективному накоплению опухолевых клеток различного происхождения в М-фазе клеточного цикла [5].
Для изучения способности ПЗПГ индуцировать гибель опухолевых клеток ГИСО, устойчивых к действию химиопрепаратов, было проведено исследование цитотоксических свойств данных соединений в отношении полученного нами ранее клона клеток ГИСО (T-29R), обладавшего генотипическими и фенотипическими признаками резистентности к доксорубицину, этопозиду и паклитакселу.
рис. 1. Цитотоксическая активность химиопрепаратов, а также соединений ПЗПГ в отношении клеток ПИСО, чувствительных и резистентных к иматинибу (А и Б, соответственно), а также резистентных к доксорубицину, этопозиду и паклитакселу (В). Цитотоксичность определяли по результатам М^-теста. Звездочка указывает достоверность отличия от контроля при р < 0.05
А.
у Этопозид Доке ^ | 10 20 40 110,25 0,5 1 мкМ мг/мл
ПАРП
каспаза 3
рН2АХ (ЭеМЗЭ)
Н2АХ Актин
Б' * #
^ Доке Этопозид | 1 2 4 || 40 80 160 мг/мл мкМ
_* ^^^^^
_ ...
111 мм
. , ^
**
___.
' в
Рис. 2. Ингибиторы топоизомеразы II типа (доксорубицин и этопозид) индуцируют апоптоз ИМ-чувствительных (А) и резистентных (Б) клеток ПИСО. Маркеры апоптоза - расщепленные формы ПАРП и каспазы-3, маркер двунитевых разрывов ДНК - повышение
уровня экспрессии §-Н2АХ
Рис. 3. ПЗПГ-1 и-2 дозо-зависимо индуцируют апоптоз ИМ-чувствительных (А) и резистентных (Б) клеток ПИСО. Маркеры апоптоза - расщепленные формы ПАРП и каспазы-3, маркеры М-фазы - повышение уровня экспрессии фосфорилированной формы PLK-1 и
§-Н2АХ. Концентрация ПЗПГ-1 и -2 указана в мкМ
рис. 4. ПЗПГ-1 и -2 дозо-зависимо индуцируют апоптоз клеток ГиСо Т29R, резистентных к химиопрепаратам. Маркеры апоптоза - расщепленные формы ПАРП и каспазы-3, маркеры М-фазы - повышение уровня экспрессии фосфорилированной формы PLK-1
и §-Н2АХ. Концентрация ПЗПГ-1 и -2 указана в мкМ.
Было обнаружено, что ПЗПГ также обладают выраженной цитотоксичностью в отношении клеток T-29R (рис. 1В), причем значения 1С50 для данных соединений достоверно не отличались от значений, полученных на «родительских» опухолевых клетках ГИСО Т-1. ПЗПГ индуцировали апоптоз резистентного к химиопрепаратам клона клеток ГИСО, а их про-апоптогенный эффект также сопровождался характерным повышением уровней экспрессии фосфорилированной формы PLK-1 и у-Н2АХ (рис. 4).
таким образом, результаты проведенных нами исследований свидетельствуют о чувствительности клеток ГИСО к действию ингибиторов топоизомеразы II типа - доксорубицину и этопозиду, а также препаратов и соединений, влияющих на динамическое содержание микротрубочек веретена деления. К последним относятся паклитаксел и синтезированные нами соединения, относящиеся к классу пивалоил-замещенных пиррол-содержащих гетероциклов (ПЗПГ). Примечательно, что цитотоксическая активность ПЗПГ была выявлена в одинаковой степени как в отношении ИМ-чувствительных, так и ИМ-резистентных клеток ГИСО. Более того, данные соединения обладали дозо-зави-симой цитотоксичностью в отношении клона
опухолевых клеток ГИСО T-29R, резистентного к вышеуказанным химиопрепаратам. Преимущественным механизмом гибели клеток ГИСО под действием ПЗПГ являлся апоптоз.
Вышеизложенное подчеркивает необходимость более углубленного изучения вопроса об эффективности химиотерапии в лечении больных с ГИСО. Особую практическую значимость имеют исследования по оценке химиочувстви-тельности больных с ГИСО с резистентностью к таргетным препаратам, в первую очередь, ИМ. Перспективным, на наш взгляд, является изучение возможности комбинированного использования таргетных препаратов и химиопрепаратов в лечении больных с ГИСО. Например, нами было обнаружено, что Им способен вызывать сенси-тизацию клеток ГИСО к химиопрепаратам, в частности, к ингибиторам топоизомеразы II типа [2]. Одним из молекулярных механизмов данного феномена является способность таргетного препарата подавлять процессы гомологичной рекомбинации повреждений ДНК, индуцируемых данными химиопрепаратами. Способность Им вызывать сенситизацию опухолевых клеток к доксорубицину и индуцировать в дальнейшем их апоптоз in vitro была также показана на опухолевых клеточных линиях саркомы Юинга
с гиперэкспрессией с-KIT [8]. Была также выявлена эффективность применения малых доз доксорубицина у больных с неоперабельными, метастатическими, а также резистентными к ИМ формами ГИСО [12].
исследования выполнены при финансовой поддержке российского научного фонда (грант № 14-15-00342)
ЛИТЕРАТУРА
1. Бойчук С.В., Галембикова А.Р., Зыкова С.С., Хуснутди-нов Р.Р. Нарушения регуляции клеточного цикла и репарации повреждений ДНК в опухолевых клетках под действием замещенного этилового эфира 2-амино-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - № 5. - С. 116.
2. Бойчук С.В., Галембикова А.Р., Рамазанов Б.Р., Ду-синг А. Иматиниб повышает чувствительность клеток гастроинтестинальных стромальных опухолей к ингибиторам топоизомераз II типа // Успехи молекулярной онкологии. - 2015. - № 1. - С. 76-81.
3. Галембикова А.Р., Дунаев П.Д., Бойчук С.В. Оценка чувствительности гастроинтестинальных стромальных опухолей (ГИСТ) к химиопрепаратам различных групп // Современные проблемы науки и образования. -
2015. - № 6. - С. 255.
4. Мазуренко Н.Н., Цыганова И.В. Молекулярно-генети-ческие особенности и маркеры гастроинтестинальных стромальных опухолей // Успехи молекулярной онкологии. - 2015. - № 2. - С. 29-40.
5. Boichuk S., Galembikova A., Zykova S, Ramazanov B. et al. Ethyl-2-amino-pyrrole-3-carboxylates are novel potent anticancer agents that affect tubulin polymerization, induce G2/M cell-cycle arrest, and effectively inhibit soft tissue cancer cell growth in vitro // Anti-Cancer Drugs. -
2016. - Vol. 27(7). - P. 620-634.
6. Boichuk S., Lee D.J., Mehalek KR, Makielski KR, et al. Unbiased compound screening identifies unexpected drug sensitivities and novel treatment options for gastrointestinal stromal tumors // Cancer Res. - 2014. -Vol. 74. - P. 1200-1213.
7. Demetri, G. D., M. von Mehren, C. D. Blanke, A. D. Van den Abele, B., et al. Efficacy and safety of imatinib mesylate in advanced gastrointestinal stromal tumors // The New Engl. J. Med. - 2002. - Vol.347. - P. 472-480.
8. Gonzalez I., Andreu E.J., Panizo A., Fontalba A. et al. Imatinib inhibits proliferation of Ewing tumor cells mediated by the stem cell factor/KIT receptor pathway, and sensitizes cells to vincristine and doxorubicin-induced apopto-sis // Clin. Cancer Res. - 2004. - Vol.10. - P 751-761.
9. Gramza A.W., Corless C.L., Heinrich M.C. Resistance to tyrosine kinase inhibitors in gastrointestinal stromal tumors // Clin Cancer Res. - 2009. - Vol.15. - P. 7510-7518.
10. Hirota S., K. Isozaki, Moriyama Y, Hashimoto K. et al. Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors // Science (New York, N.Y). - 1998.
- Vol. 279. - P. 577-580.
11. Hopkins TG, Marples M, Stark D. Sunitinib in the management of gastrointestinal stromal tumours (GISTs) // Eur J Surg Oncol. - 2008. - Vol. 34 (8). - P. 844-850.
12. Maurel J., Martins A.S., Poveda A., López-Guerrero J.A. et al. Imatinib plus low-dose doxorubicin in patients with advanced gastrointestinal stromal tumors refractory to high-dose imatinib: a phase I-II study by the Spanish Group for research on sarcomas // Cancer. - 2010. -Vol.116. - P. 3692-3701.
13. Pessetto Z.Y Weir S.J., Sethi G., Broward M.A. et al. Drug repurposing for gastrointestinal stromal tumor // Mol Cancer Ther. - 2013. - Vol. 12(7). - P. 1299-1309.
14. Pessetto, Z. Y, Ma Y, Hirst J. J., von Mehren M. et al. Drug repurposing identifies a synergistic combination therapy with imatinib mesylate for gastrointestinal stromal tumor. // Mol. Cancer Ther. - 2014. - Vol. 13. - P. 2276-2287.
15. Verweij J., Casali P.G., Zalcberg J., LeCesne A. et al. Progression-free survival in gastrointestinal stromal tumors with high-dose imatinib: randomized trial // Lancet.
- 2004. - Vol. 364. - P. 1127-1132.
Поступила в редакцию 05.08.2016 г.
А.R.Galembikova1, S.V.Boichuk1, S.S.Zykova2, R.R.Khusnutdinov1, P.D.Dunaev1
Pivaloyl-substituted 2-pyrrolones induce death of gastrointestinal stromal tumors resistant to imatinib and chemotherapy drugs
1Kazan State Medical University, Kazan 2Perm State Pharmaceutical Academy, Perm
There are presented data illustrating sensitivity of gastrointestinal stromal tumors (GISTs) to certain chemotherapeutic agents (topoisomerase type II inhibitors, taxanes, vinca alkaloids) and pivaloyl-containing heterocyclic pyrroles (PCHPs). The chemotherapeutic drugs indicated above provided the cy-totoxicity to IM-sensitive GIST cells. PCHPs were effective in both IM-sensitive, and resistant GISTs as well. Moreover PCHPs were also active against GISTs harboring the resistance to the chemotherapeutic agents indicated above. PCHPs-treated tumor cells underwent apoptosis due to the M-phase abnormalities and mitotic catastrophe.
Key words: gastrointestinal stromal tumors, chemothera-peutic drugs, pivaloyl-containing heterocyclic pyrroles, apop-tosis
