Пикосекундная флуоресцентная спектроскопия белков как новый подход к оценке эффективности терапии психических заболеваний Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ПИКОСЕКУНДНАЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ БЕЛКОВ КАК НОВЫЙ ПОДХОД К ОЦЕНКЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ ПСИХИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Сырейщикова Т.И.1 Грызунов Ю.А.2, Смолина Н.В.2, Добрецов Г.Е.2, Комар А.А1, Узбеков М.Г.3, Мисионжник Э.Ю.3, Молодецких А.В.3, Максимова Н.М.3

1 Физический институт им. П.Н.Лебедева РАН, Москва, Россия, syrej@ sci.lebedev.ru 2 ФГУ НИИ физико-химической медицины Росздрава, Москва, Россия,

3 ФГУ Московский НИИ психиатрии Росздрава

Конформационные изменения белков, участвующих в метаболических процессах в человеческом организме, могут свидетельствовать о наличии в нем серьезных патологических изменений. В данном докладе речь идет о выявлении расстройств человеческой психики посредством изучения изменений в конформации молекул сывороточного альбумина человека (САЧ) флуоресцентными методами. САЧ является важным транспортным белком плазмы крови, связывающим различные лиганды, образующиеся при метаболических процессах. Изменение структуры молекулы альбумина в данной работе отслеживалось путем измерения кинетики затухания флуоресцентного зонда К-35, встроенного в молекулу альбумина и выполняющего роль лиганда-репортера. Измерения были проведены на альбумине в составе сывороток крови пациентов разных групп психической паталогии (29 больных депрессией, 8 больных шизофрениий). Данные измерения в 7 сыворотках здоровых доноров использовались для контроля. Для данной выборки сывороток было показано, что примененный флуоресцентный метод позволяет достоверно различать средние значения параметров трех временных компонент затухания флуоресценции зонда у больных пациентов и здоровых доноров. Анализ изменения амплитуд функции затухания К-35 при объединении двух типов воздействий на альбумин: изменении ионной силы и добавлении анионов нитрата, позволил различить группы больных до начала терапии и после лечения. Набранная статистика измерений пока не достаточна для доказательства применимости метода для раннего динамического прогноза эффективности проводимой терапии. Это является задачей ближайших исследований.

Одной из наиболее тяжелых патологий являются психические расстройства и, в частности, депрессии. На сегодняшний день в медицинской практике не существует четких количественных характеристик для оценки степени тяжести состояния таких больных, равно как и эффективности проводимой терапии. В значительной мере все определяется опытом и наблюдательностью лечащих врачей. Поэтому поиск объективных количественных характеристик, своеобразных биомаркеров, которые были бы чувствительны к динамике депрессивных состояний и проводимой терапии, приобретает особую актуальность.

Конформационные изменения белков, участвующих в метаболических процессах в человеческом организме, могут свидетельствовать о наличии в нем серьезных патологических изменений. Сывороточный альбумин человека (САЧ) является важным транспортным белком плазмы крови, связывающим различные лиганды, образующиеся при метаболических процессах. Он переносит всевозможные метаболиты, ксенобиотики, токсиканты и лекарства из тканей тела к органам детоксикации. Нарушения этих процессов принимают участие в патогенезе многих болезней.

Впервые конформационные изменения молекулы альбумина для больных с психическими заболеваниями были обнаружены в Физическом институте им П.Н. Лебедева в 1997 г. с помощью флуоресцентной спектроскопии с наносекундным разрешением в пучке синхротронного излучения ускорителя С-60 при исследовании сыворотки больных шизофренией [1,2]. В настоящей работе используется та же флуоресцентная методика, но гораздо более усовершенствованная с использованием современного лазера и быстрого детектора фотонов с разрешающей способностью во времени около 50 пс. Производительность и чувствительность этой установки оказалась достаточно высокой, что позволяет существенно ускорить темп измерений и анализ получаемых данных. Целью настоящей работы является детальная разработка

метода регистрации изменений конформации молекулы САЧ применительно к задачам изучения психических заболеваний и, в частности, депрессии.

Как и ранее в исследованиях с синхротронным пучком, для изучения изменений в конформации молекулы САЧ использовался специальный флуоресцирующий краситель К-35. Этот краситель при добавлении в плазму крови специфически связывается с известными (лекарственными) связывающими центрами альбумина и флуоресцирует из них, причем другие белки плазмы практически не вносят вклад в эту флуоресценцию. Изменения конформации альбумина оказывают заметное воздействие на кинетику затухания флуоресценции зонда. Процессы высвечивания возбужденного зонда К-35 происходят на границе нано- и пикосекундной временных шкал.

Новая установка дополнительно оснащена термостатированной кюветой, вторичным монохроматором и поляризаторами излучения. При таком оснащении установка позволяет в полной мере исследовать как временные, так и спектральные характеристики флуоресцентного излучения зонда, связанного с белком.

1. Кинетика затухания флуоресценции зонда К-35, связанного с альбумином.

Затухание флуоресценции К-35 в присутствии альбумина представляет собой кривую, которую можно представить как сумму экспонент:

F(t)= А1*ехр(-1;/т1)+А2*ехр(-1;/т2)+Аз*ехр(-1;/тз)+А4 (1)

с амплитудами Аі и постоянными времени соответственно около 9, 3, 1 и 0 нс.

В этой гетерогенной ситуации только метод разрешенной во времени флуоресцентной спектроскопии дает возможность оценить концентрацию флуоресцирующих молекул зонда. При этом используется стандартный раствор с известной концентрацией зонда, в котором флуоресцируют все молекулы.

С целью выяснения происхождения трех компонент затухания флуоресценции К-35 в альбумине были измерены затухания зонда К-35 в альбумине для ряда образцов сыворотки крови здоровых доноров. Неравномерный рост амплитуд А1, А2, А3 по мере добавления зонда к сыворотке позволил сделать вывод, что три разных времени происходят от существования трех различных типов центров связывания зонда. Эти типы центров не только представлены в разном количестве, но имеют разные константы связывания в области 104-105 М. Таким образом, изменение флуоресценции зонда из этих центров может свидетельствовать об изменении конформации альбумина.

2. Локализация молекул К-35 в молекуле альбумина

В молекуле альбумина существуют 2 основных центра связывания лекарств: центр I находится в субдомене 11а, его маркером является анион фенилбутазона. Центр II находится в субдомене Ша и его маркером служит ибупрофен. Добавление фенилбутазона и ибупрофена в раствор альбумина с зондом показало, что большая часть долгоживущих молекул зонда (9нс) флуоресцирует из I центра, меньшая - из II центра. Флуоресценция зонда со временем 3 нс частично происходит из II центра. Ибупрофен конкурирует с зондом за связывание только долгоживущих молекул. При увеличении концентрации обоих маркеров наблюдалось увеличение числа короткоживущих молекул флуоресценции. Не исключено, что при этом альбумин может работать как кооперативный адсорбент, связывая лиганды по аллостерическому механизму: связывание каждой молекулы лиганда увеличивает количество и/или константу связывания новых, более слабых центров связывания.

3. Влияние жирных кислот (ЖК) на конформацию альбумина.

Согласно литературным данным, альбумин является главным переносчиком неэстерифицированных жирных кислот, которые оказывают также

аллостерическое влияние на молекулу альбумина, изменяя конформацию его молекулы. В данной работе к “обезжиренному” альбумину, выделенному из

сыворотки с последующим удалением из него ЖК, добавляли пальмитиновую кислоту. При связывании 4 молекул жирной кислоты с молекулой альбумина константа связывания зонда К-35 возрастает в 10 раз. При этом числа молекул зонда со средней (3 нс) и короткоживущей флуоресценцией возрастают в 2-3 раза. Это свидетельствует о том, что центр связывания К-35 испытывает значительные конформационные перестройки в результате присоединения молекулы ЖК.

4. Клинические исследования сывороток крови больных психическими заболеваниями.

Проведено изучение затухания флуоресценции зонда в 7 сыворотках здоровых доноров, в 29 сыворотках больных депрессией (из которых 6 сывороток -“первичные”-нелеченные депрессанты) и в 8 сыворотках больных шизофренией. Основная цель состояла в выяснении чувствительности параметров затухания флуоресценции К-35 в исследуемых сыворотках к разным состояниям больных и проводимой терапии. Исследование было организовано в соответствии со стандартами доказательной медицины. Было проведено нерандомизированное поперечное исследование, в которое были включены больные депрессией, поступившие на лечение в клинику МНИИ психиатрии Росздрава. Критерием включения в исследование было наличие признаков депрессивного расстройства (раздел F.3 МКБ-10) и преобладание в структуре депрессии тревожного аффекта. Показано, что для данной выборки сывороток метод позволяет достоверно различать средние значения параметров трех временных компонент затухания флуоресценции зонда для различных группах больных. Однако от метода требуется возможность следить за изменением состояния отдельного пациента в ходе проводимой терапии. Для этого необходимо повышать чувствительность метода. В настоящее время это осуществлено объединением двух типов воздействия на конформацию альбумина: изменение ионной силы раствора и добавление анионов нитрата. Эти воздействия по- разному влияют на функцию затухания К-35 в альбумине, в зависимости от того, до или уже в процессе лечения проводилось исследование. Первое воздействие оказывало максимальное влияние на амплитуду молекул зонда с большим ( 9 нс) временем затухания, а второе (анионы нитратов) - на амплитуды молекул с малым ( 1 нс) временем. Этот эффект был использован для «контрастирования» действия терапии на конформацию альбуминовой глобулы.

Задачей ближайших исследований является как увеличение числа исследуемых сывороток различных групп пациентов, так и увеличение чувствительности метода.

1. Gryzunov Yu.A., Syrejshchikova T.I., Komarova M.N.,Misionzhnik E.Yu., Molodetskich A.V., Uzbekov M.G., Yakimenko M.N., About the qualitative physical chemical changes of binding sites region of blood albumin in schizophrenic patients , Social Clinical Psychiatry, 1997, 7(2) , pp.55-60 (Russia)

2. Gryzunov Yu.A., Syrejshchikova T.I., Komarova M.N., Misionzhnik E. Yu., Uzbekov M.G., Molodetskich A.V.,. Dobretsov G.E., Yakimenko M.N. Serum albumin binding sites properties in donors and in schizophrenia patients: the study of fluorescence decay of the probe K-35 using S-60 synchrotron pulse excitation. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research (NIM), Section A, 2000, v.A-448, 478-482.

PICOSECOND FLUORESCENT SPECTROSCOPY OF PROTEINS AS A NEW APPROACH TO THE ESTIMATION OF EFFICIENCY OF THERAPY

OF MENTAL DISEASES

Syrejshchikova T.I1., Gryzunov Yu.A2., Smolina N.V2., Dobretsov G.E2., Komar A.A1., Uzbekov M.G3., Misionzhnik E.Yu3., Molodetskich A.V.3, Maximova N.M3 1 Lebedev Physical Institute of RAS, Moscow, Russia , syrej@ sci.lebedev.ru 2Research Institute for Physical Chemical Medicine, Moscow, Russia 3Research Institute of Psychiatry, Moscow, Russia

Conformational changes of the proteins participating in metabolic processes in human body may indicate the presence of serious pathological changes in it. The present work is devoted to evaluation of the state of patients with mental disorders by analyzing conformational changes of human serum albumin (HSA) by fluorescent methods. HSA is the important transport protein of blood plasma, binding various ligands, formed at metabolic processes. Changes in the structure of albumin molecule was detected by measuring of decay of fluorescent probe, K-35, bound to albumin globule and acting as a ligand-reporter. The measurements were carried out on serum albumin of the patients relating to different groups of mental pathology (29 patients with depression, 8 patients with schizophrenia). The data obtained while measuring serum albumin fluorescence for 7 healthy donors, were used as a control. It was shown, that the applied fluorescent method allowed us to distinguish statistically significantly average values of the parameters characterizing three time components of K-35 probe fluorescence decay for sick patients and healthy donors. The amplitude analysis of K-35 decay in fluorescence quenching (by nitrate anions) and ionic strength changes allowed us to differentiate the patients before and after treatment. Statistics of measurements collected so far is not sufficient to make early prognosis of the efficiency of therapy in the framework of the suggested fluorescent method. To prove the clinical significance of the obtained data the

further investigation is carried out.