CC BY
129
urinal sperm cryobanking. The study presents comparative analysis of urinal sperm indices of three species of palearctic brown frogs: common frog Rana temporaria, moor frog R. arvalis, and Iranian long-legged frog R. macrocnemis pseudodalmatina. It was demonstrated that a common frog differs reliably from moor and Iranian long-legged frogs on such parameters as: spermatozoa concentration in urinal sperm; total amount of spermatozoa in a
sperm sample and spermatozoa life span. As the success rate of cryopreservation of amphibian urinal sperm depends on its mentioned parameters, the study should be useful for development of techniques for cryopreservation of palearctic brown frogs urinal sperm.
Key words: amphibians; brown frogs; urinal sperm; spermatozoa; cryopreservation.
УДК 597.94:591.147.8
ПЕРВЫЙ ОПЫТ РАЗМНОЖЕНИЯ ТРИТОНА КАРЕЛИНА, TRITURUS KARELINII (STRAUCH, 1870) С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УРИНАЛЬНОЙ СПЕРМЫ ДЛЯ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ ИКРЫ
© В.К. Утешев, А.А. Кидов, С.А. Каурова, Н.В. Шишова, Е.В. Мельникова
Ключевые слова: земноводные; тритоны; искусственное оплодотворение; сперматозоиды; уринальная сперма. Тритон Карелина Triturus karelinii (Strauch, 1870) - восточносредиземноморский вид, имеющий фрагментированный ареал. Последствия антропогенной деятельности приводят к крайне уязвимому положению этого тритона на Кавказе и особенно в Талыше. Возможной мерой поддержания его численности является разведение этого тритона в условиях неволи и возвращение выращенных животных в природные угнетенные популяции. В данной статье приводятся результаты первых положительных экспериментов по размножения тритона Карелина с использованием уринальной спермы для искусственного внутреннего оплодотворения икры.
ВВЕДЕНИЕ
Тритон Карелина Triturus karelinii (Strauch, 1870) -восточносредиземноморский вид, современный ареал которого представлен несколькими фрагментами, расположенными на юго-востоке Балканского полуострова, севере и западе Малой Азии, в южной части полуострова Крым, на Кавказе и в южном Прикаспии [3]. В Кавказском экорегионе тритон Карелина распространен в исторических границах широколиственных лесов, а его изолированные популяции в степной и горно-ксерофитной зонах являются реликтовыми [2]. Активное сведение лесов, загрязнение и зарыбление водоемов делает положение этого тритона на Кавказе крайне уязвимым. Вид внесен в Красные Книги Российской Федерации и Азербайджана.
В наиболее плачевном состоянии, по нашему мнению, находятся популяции T. karelinii в горнолесном поясе Юго-Восточного Азербайджана. Преобразование горных территорий приводит к расчленению ареала этого вида в Талыше и образованию изолированных микропопуляций, приуроченных к конкретным нерестовым водоемам и исчисляющихся сотнями и даже десятками особей. Нельзя исключать, что в ближайшем будущем важнейшим лимитирующим фактором для тритона Карелина на этом участке своего ареала станет угнетение популяций под действием инбредной депрессии.
Одной из наиболее действенных мер для восстановления вида в регионе является устройство незарыб-ляемых водоемов (например, для полива или поения скота). Так, на севере Азербайджана, в Шемахинском районе, именно наличие большого количества ското-
пойных прудов способствовало сохранению тритона Карелина после полного сведения лесов.
Кроме того, на наш взгляд, перспективным является поддержание численности существующих популяций и создание новых за счет разведения этого тритона в искусственных условиях. При воспроизводстве земноводных в лаборатории следует использовать все современные репродуктивные технологии, включая гормональную стимуляцию нереста, искусственное оплодотворение, кратковременное и длительное хранение репродуктивных клеток, криоконсервацию и криобан-кирование. В данной статье приводятся результаты первых экспериментов по размножения тритона Карелина с использованием уринальной спермы для искусственного внутреннего оплодотворения икры.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Материалом для наших исследований послужили взрослые особи тритона Карелина одной из наиболее изученных изолированных популяций горного Талыша -урочища Зарбюлюн [1]. Животных отлавливали в период их зимовки (I декада января 2012 г.) в воде и в убежищах на суше. До использования в экспериментах тритонов содержали в специальном зимовальном помещении лаборатории криоконсервации генетических ресурсов ИБК РАН при круглосуточной температуре +6 °С. В зимовальном помещении животные находились в небольшом пластиковом контейнере с субстратом из сфагнового мха. В I декаде апреля тритоны, разделенные по полу, были переведены в два аквариума с уровнем воды 5 см и продолжали содержаться при тех же температурах. Перед началом опытов экспери-
3090
Таблица 1
Показатели уринальной спермы тритона Карелина, собранной через различные отрезки времени после инъекции сурфагоном
Продолжительность времени после введения сурфагона, ч Показатель
n Объем урины, мл Концентрация сперматозоидов (х10б/мл) Количество сперматозоидов в образце урины (*10б) Доля подвижных сперматозоидов, %
З-б 9 0,01 105 і 9 1,12 і 0,0б 9б і 1
24 4 0,01 105 і 17 1,1З і 0,12 95 і 2
48 4 0,01 95 і 10 1,0З і 0,02 91 і 4
ментальные животные были рассажены индивидуально в аквариумы полезным объемом З л при температуре 18-22 °С.
Для стимуляции образования уринальной спермы самцам внутрибрюшинно инъецировали растворенный в физиологическом растворе для амфибий сурфагон (синтетический аналог гипоталамического гормона люлиберина) в дозе по 25 мкг и в объеме 0,2 мл раствора на одно животное. Для получения уринальной спермы самца извлекали из воды и, держа в руках над чашкой Петри, проводили мягкое массирование брюшной области по направлению от головы к клоаке. Вытекающую из клоаки уринальную сперму собирали в чашку Петри, измеряли ее объем, определяли концентрацию сперматозоидов в урине, рассчитывали общее количество сперматозоидов в полученном образце спермы. Отбор образцов уринальной спермы от каждого самца проводили 2-З раза в первые З-б часов после гормональной стимуляции, а затем через 24 и 48 часов после введения гормона.
Для изучения длительности жизни сперматозоидов полученные образцы уринальной спермы помещали в холодильник и хранили при температуре 4 °С в течение 2 суток. Процент подвижных сперматозоидов в образцах спермы подсчитывали сразу после получения, а затем через 12 и 48 часов. О продолжительности жизни сперматозоидов судили по проценту подвижных спер-миев в образцах хранившейся в холодильнике ури-нальной спермы.
Овуляцию ооцитов и откладку икры самками также стимулировали инъекцией сурфагона. Каждой самке гормон, растворенный в физиологическом растворе для амфибий, вводили внутрибрюшинно в дозе по 50 мкг и объеме 0,2 мл раствора на особь. Для получения неоп-лодотворенных яиц самку после откладки первых икринок вынимали из воды и мягко массировали ей брюшную область по направлению к клоаке. Для получения искусственно оплодотворенной икры через З часа после инъекции гормона самку вынимали из воды и при помощи пипетки в клоаку вводили 10 мкл полученной от самцов уринальной спермы. Введение ури-нальной спермы в клоаку самки повторяли троекратно в течение 10 часов после инъекции гормона. Отложенные яйца подсчитывали и контролировали их дальнейшее развитие.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Уринальная сперма, собранная через сутки после инъекции гормона, по всем характеристикам не отличается от спермы, полученной через З-б часов после
гормональной стимуляции (табл. 1). В образцах ури-нальной спермы, собранных через 48 часов после введения гормона, наблюдается тенденция к снижению концентрации и, следовательно, количеству сперматозоидов в образцах уринальной спермы. В то же время следует заметить, что концентрацию сперматозоидов и их общее количество в собранных образцах спермы мы смогли подсчитать лишь приблизительно, поскольку в каждом из полученных образцов спермы, наряду со свободно движущимися сперматозоидами, всегда присутствовали сгустки сперматозоидов большего или меньшего размера (по-видимому, фрагменты сперматофора). Плотная хаотичная упаковка спермиев в этих сгустках не позволяла подсчитать в них количество сперматозоидов.
Важно отметить, что в уринальной сперме, в отличие от сперматофора, сперматозоиды находятся в активированном состоянии и обладают подвижностью. Доля сперматозоидов, обладающих подвижностью, варьировала в пределах 70-99 %, в среднем составляя 91-9б%.
В связи с этим интересными представляются данные по продолжительности жизни спермиев в урине при низкотемпературном хранении (табл. 2).
Таблица 2
Изменение доли подвижных сперматозоидов в уринальной сперме тритона Карелина при низкотемпературном (4 °С) хранении
Период хранения, часы Подвижность спермиев, %
0 97,З і 0,8
12 80,0 і 3,5
24 51,З і 10,5
Зб Зб,З і 10,7
48 1,8 і 1,1
Таблица З
Результаты искусственного осеменения уринальной спермой самок тритона Карелина
№ самки Число отложенных яиц, шт. Число развивающихся яиц, шт. Доля развивающихся яиц, %
1 47 17 Зб,2
2 40 0 0
З 47 5 10,б
З091
Проведенный эксперимент показал, что доля подвижных сперматозоидов постепенно снижалась в процессе хранения, однако и через двое суток нахождения образцов уринальной спермы при 4 “С почти 2 % сперматозоидов оставались подвижными.
Для получения зрелых неоплодотворенных яиц гормонально стимулированных самок тритона, начавших откладывать первые икринки, извлекали из воды и мягко массировали им вентральную область тела по направлению к клоаке. В результате такого массирования удалось извлечь из клоаки лишь единичные неоп-лодотворенные яйца. Поэтому в последующем нами была предпринята попытка осуществить искусственное оплодотворение яиц посредством последовательного введения в клоаку самки нескольких порций полученной от самцов уринальной спермы (табл. З).
В целом, искусственное осеменение самок тритона Карелина уринальной спермой можно считать успешной: нами было получено 22 развивающихся яйца, из которых выклюнулись нормальные личинки.
ОБСУЖДЕНИЕ
Проведенное исследование показало, что после гормональной стимуляции у самцов тритона Карелина можно получить не только сформированные спермато-форы, но и жидкую уринальную сперму. Уринальная сперма тритона представляет собой спермальную плазму, в которой содержатся как отдельные подвижные сперматозоиды в достаточно высокой концентрации, так и сгустки сперматозоидов, которые, возможно, являются фрагментами сперматофоров. В литературе имеется описание исследования, в котором уже была прижизненно получена уринальная сперма от аксолотля мексиканской амбистомы, Ambystoma mexicanum (Shaw et Nodder, 1798) [4].
Возможность получения уринальной спермы открывает широкие возможности для проведения исследований по криоконсервации сперматозоидов хвостатых амфибий. В предыдущих исследованиях нам удалось успешно криоконсервировать уринальную сперму травяной Rana temporaria Linnaeus, 1758 [5] и прудовой Pelophylax lessonae (Camerano, 1882) лягушек [б]. Криоконсервация спермы хвостатых земноводных явилась бы новым шагом в решении проблемы сохранения исчезающих видов методом генетического криобанки-рования.
Однако возможность использования криоконсерви-рованной спермы хвостатых амфибий требует создания метода искусственного оплодотворения икры. В вышеупомянутой работе Н. Мансура с соавт. [4] неоплодо-творенную икру аксолотля получали при помощи массажа брюшной области гормонально стимулированных самок. Успешное искусственное оплодотворение яиц осуществляли в чашке Петри с использованием свеже-полученной уринальной спермы. Наши эксперименты показали, что у тритона Карелина одновременно удает-
ся получить лишь единичные неоплодотворенные яйца от начавших нереститься без контакта с самцами гормонально стимулированных самок. Вероятно, это является особенностью физиологии тритонов Triturus sensu lato и отличает их от тех хвостатых амфибий, у которых в овидукте происходит накопление значительного количества овулированных ооцитов, которые можно получить путем сцеживания (у аксолотля и, по нашим неопубликованным данным, у иглистого тритона, Pleu-rodeles waltl Michahelles, 1830).
Проблемы, возникшие с получением неоплодотво-ренных яиц у тритона Карелина путем сцеживания, заставили нас предпринять попытку проведения внутреннего искусственного оплодотворения введением в клоаку самки нескольких порций уринальной спермы. Были получены первые положительные результаты искусственного внутреннего оплодотворения икры тритона, однако для создания технологии искусственного осеменения необходимо проведение дополнительных исследований.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кидов А.А., Матушкина К.А. Постларвальный рост тритона Карелина, Triturus karelinii (Strauch, 1870) (Amphibia, Caudata: Salaman-dridae) в горах Талыша // Актуальные проблемы экологии и сохранения биоразнообразия России и сопредельных стран: сб. науч. тр. Владикавказ, 2012. Вып. 8. С. 46-50.
2. Кузьмин С.Л. Земноводные бывшего СССР. М.: Товарищество научных изданий КМК, 1999. 298 с.
3. Литвинчук С.Н., Боркин Л.Я. Эволюция, систематика и распространение гребенчатых тритонов (Triturus cristatus complex) на территории России и сопредельных стран. СПб: Европейский Дом, 2009. 592 с.
4. Mansour N., Lahnsteiner F., Patzner R.A. Collection of gametes from live axolotl, Ambystoma mexicanum, and standardization of in vitro fertilization // Theriogenology. 2011. V. 75. № 2. P. 354-361.
5. Shishova N.R., Uteshev V.K., Kaurova S.A., Browneb R.K., Gakho-va E.N. Cryopreservation of hormonally induced sperm for the conservation of threatened amphibians with Rana temporaria as a model research species // Theriogenology. 2011. V. 75. № 2. P. 220-232.
6. Uteshev V.K., Shishova N. V., Kaurova S.A., Manokhin А.А., Gakho-va E.N. Collection and cryopreservation of hormonally induced sperm of pool frog (Pelophylax lessonae) // Russ. J. Herpetol. 2013. V. 20. № 2. P. 105-109.
Поступила в редакцию 15 мая 2013 г.
Uteshev V.K., Kidov A.A., Kaurova S.A., Shishova N.V., Melnikova E.V. FIRST EXPERIENCE OF REPRODUCTION OF A KARELIN’S NEWT TRITURUS KARELINII (STRAUCH, 1870) WITH URINAL SPERM USE FOR EGGS FERTILIZATION
Karelin’s newt Triturus karelinii (Strauch, 1870) is an Eastern Mediterranean species with fragmented areal. Anthropogenic activity in the Caucasus region, especially in Talysh, makes it extremely endangered. Captive breeding and reintroducing into nature depressive populations is one of the available measures to support its population. The article presents results of the first successful experiments on reproduction of Karelin’s newt, using urinal sperm for artificial internal fertilization of eggs.
Key words: amphibians; newts; artificial insemination; spermatozoa; urinal sperm.
3092
