CC BY
97
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
УДК 616.98:578.828.6]-092:612.017.1.064]:575.08
А.Э. Лопатухин1, Д.Е. Киреев1, А.Н. поляков2, Е.К. Букин2, R. Kaiser3, N. Luebke3, Д.А. Куевда1, Г.А. Шипулин1
первый опыт применения стандартизированной генотипической методики определения тропизма вич
1ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, москва; представительство компании ViiV Healthcare в России, москва; 3Institute of Virology, University of Cologne, Germany
Антагонисты корецептора CCR5 - абсолютно новый класс препаратов для лечения ВИЧ-инфекции. Механизм действия препаратов данного класса заключается в избирательном связывании с корецептором CCR5, что приводит к предотвращению проникновения ВИЧ в клетку. Перед назначением CCR5-антагонистов необходимо определение вирусного тропизма. Недавно в России была зарегистрирована генотипическая методика определения тропизма, которая может быть использована в клинической практике. В настоящей работе описывается первый опыт применения данной методики на клинических образцах. Получена высокая корреляция при сравнении с результатами референсной лаборатории.
Ключевые слова: ВИЧ, генотипическая методика, тропизм, V3 петля, CCR5, CXCR4, R5X4, gpl20, набор реагентов
A.E. Lopatukhin, D.Ye. Kireyev, A.N. Polyakov, Ye.K. Bukin, R. Kaiser, R. Luebke, D.A. Kuyevda, G.A. Shipulin
THE FIRST EXPERIENCE OF APPLICATION OF STANDARDIZED GENOTYPE TECHNIQUE OF IDENTIFICATION OF HIV-TROPISM
1Central Research Institute for Epidemiology. 111123 Moscow, Russian Federation; Representative office of ViiV Healthcare in the Russian Federation, Moscow; institute of Virology, University of Cologne, Germany
The antagonists of co-receptor CCR5 are an ultimately new class ofpreparations to treat HIV-infection. The mechanism of action of the preparations of this class is in the selective binding with co-receptor CCR5. This process results in the prevention of penetration of HIV into cell. Before prescribing the CCR5 antagonists the detection of viral tropism has to be done. Recently, in Russia the genotype technique of tropism detection was registered which can be used in clinical practice. The present article describes first experience of application of the given technique to clinical samples. The high correlation was established while comparing with the results of reference laboratory.
Key words: HIV, genotype technique, tropism, V3 loop, CCR5, CXCR4, R5X4, gpl20, reagents kit
Введение
Исключительно высокая степень изменчивости вируса иммунодефицита человека побуждает к постоянному совершенствованию антиретровирусной терапии, что влечет за собой непрерывную разработку и внедрение новых антиретро-вирусных препаратов.
Относительно недавно стал доступен класс препаратов, препятствующих присоединению вирусной частицы к клетке-мишени путем воздействия на ССГ5-корецептор. Первым зарегистрированным препаратом данного класса является маравирок (МагаУгос), доказавший свою эффективность при применении в составе комплексной АРВ-терапии [6, 8]. Как известно, различные штаммы ВИЧ используют в качестве корецептора хемокиновые рецепторы ССЯ5 или СХСЯ4. ВИЧ, использующий ССЯ5, называют Г5-тропным, СХСЯ4 - Х4-тропным, а вирус, использующий оба типа, -Г5Х4-тропным. Являясь ССЯ5-антагонистом, маравирок эффективен при инфекции, вызванный только Г5-тропными вирусами, следовательно, перед его включением в состав АРВ-терапии необходимо определять тропизм вируса у пациента [3, 13].
Существует два основных подхода к определению тропизма ВИЧ - использование фенотипических либо генотипи-ческих методик. Несмотря на то что фенотипические методы
Для корреспонденции:
Лопатухин Алексей Эдуардович, мл. науч. сотр. отдела мол. диагностики и эпидемиологии
Адрес: 1111236 Москва, ул. Новогиреевская, 3а Телефон: 8-916-758-62-21 E-mail: Lopatukhin@pcr.ru
признаны "золотым стандартом" определения тропизма ВИЧ и имеют максимальную чувствительность при определении минорной Х4-популяции [10, 14], такие их недостатки, как длительность исследования, высокая стоимость и необходимость наличия в образце вирусной нагрузки не менее 1000 коп/мл, делают сложным применение данной методики в рутинной практике [10]. Исследование выполняется лишь несколькими зарубежными лабораториями, именно по этой причине данная методика фактически неприменима на территории РФ.
Принципиально другим способом определения тропизма ВИЧ является генотипический метод, основанный на биоинформационном анализе нуклеотидной последовательности петли V3 гена gp120 [7]. По сравнению с фенотипическим методом генотипический подход имеет такие преимущества, как быстрота проведения анализа, низкая стоимость, возможность проведения в большом количестве лабораторий.
Генотипическое исследование тропизма ВИЧ сходно с исследованием лекарственной устойчивости ВИЧ, однако в отличие от резистентности, возникающей в ответ на применение АРВ-терапии, тропизм является исходной биологической характеристикой вируса. Благодаря этому при проведении исследования тропизма ВИЧ возможен анализ не только вирусной РНК, представляющей наиболее успешно реплицируемые на данный момент варианты вируса, но и провирусной ДНК, находящейся в инфицированных клетках и отражающей "историю" эволюции вируса с момента инфицирования.
В настоящее время благодаря большому количеству исследований, проведенных за рубежом, данный метод активно развивается и разрешен к использованию в клинической практике [12]. В 2011 г. в России был зарегистрирован препарат маравирок, что создает необходимость проведения
МИКРОБИОЛОГИЯ
определения тропизма в клинической практике. Однако до недавнего времени в России отсутствовала какая-либо гено-типическая методика определения тропизма, разрешенная к использованию в клинических лабораториях.
В данной работе описывается первый российский опыт использования генотипической методики в практике на клинических образцах. При проведении исследования использовалась разработанная ранее стандартизированная генотипи-ческая методика [1]. С ее помощью возможно определение тропизма как путем анализа вирусной РНК, так и провирус-ной ДНК. Чувствительность методики составляет 100 копий РНК ВИЧ/мл в случае экстракции РНК из 1000 мкл плазмы и 500 копий/мл в случае экстракции РНК из 200 мкл плазмы, а при выявлении провирусной ДНК в лейкоцитах крови - 500 геномных эквивалентов (ГЭ)/мл. Данная методика прошла клинические испытания и зарегистрирована в Росздравнад-зоре в составе набора реагентов "АмплиСенс HIV-Resist-Seq" (РУ №° ФСР 2008/02414 от 11.04.12). Результаты тестирования сравнивались с результатами референсной зарубежной лаборатории, проведшей анализ тех же клинических образцов.
Материалы и методы. При проведении исследования использовали 28 образцов крови от пациентов с подтвержденной ВИЧ-инфекцией, среди которых присутствовали пациенты, как не получавшие антиретровирусную (АРВ) терапию, так и находящиеся на АРВ-терапии длительное время. При этом ни один из пациентов не имел опыта приема АРВ-препаратов класса ССГ5-антагонисты.
Для разделения на плазму и клеточную фракцию образцы крови центрифугировали в течение 10 мин при 1500 g. Вирусную нагрузку ВИЧ в образцах плазмы пациентов определяли с помощью набора реагентов "АмплиСенс ВИЧ-монитор-FRT" производства ФБУН ЦНИИ эпидемиологии (Россия). Экстракцию РНК ВИЧ из плазмы крови проводили с помощью комплекта реагентов "РИБО-золь-Е" производства ФБУН ЦНИИ эпидемиологии (Россия). Экстракция ДНК ВИЧ из лейкоцитарного кольца проводилась с помощью комплекта реагентов "РИБО-преп" с предварительной отмывкой лейкоцитов с помощью реагента "Гемолитик" производства ФБУН ЦНИИ эпидемиологии (Россия).
При анализе РНК ВИЧ, экстрагированной из плазмы крови, получение специфических фрагментов ДНК гена белка оболочки ВИЧ проводили с помощью "гнездовой" ОТ-ПЦР. В случае анализа ДНК ВИЧ, экстрагированной из клеточной фракции крови, получение специфического фрагмента ДНК гена белка оболочки ВИЧ проводили с помощью одностадийной ПЦР. Праймеры для проведения ПЦР были взяты из ранее опубликованных работ [5, 11] и изменены для более эффективной амплификации вариантов ВИЧ-1, циркулирующих на территории Российской Федерации. В результате амплификации получали специфические фрагменты ДНК гена белка оболочки (gp120) следующего размера: 799 пар нуклеотидов (п. н.) при анализе ДНК ВИЧ-1 и 424 п. н. при анализе РНК ВИЧ-1. В обоих случаях продукты амплификации содержали всю петлю V3. Далее проводилась очистка продуктов амплификации и их секвенирование.
Для проведения реакции циклического секвенирования использовали реактивы BigDye Terminator kit v1.1 (Applied Biosystems, США) и праймеры, разработанные во ФБУН ЦНИИ эпидемиологии. Нуклеотидная последовательность каждого специфического фрагмента ДНК определялась по двум цепям с помощью прямого и обратного секвенирующе-го праймера.
Определение нуклеотидных последовательностей производили на секвенаторе Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) согласно инструкции производителя. Редактирование нуклеотидных последовательностей и получение консенсусной нуклеотидной последовательности проводили с помощью программного обеспечения ДЕОНА (МедАйТи Групп, Россия). Определение тропизма ВИЧ путем анализа нуклеотидной последователь-
ности производилось на сайте http://www.geno2pheno.org/ Института информатики Макса Планка (Max Planck institut informatik, Германия).
Результаты и обсуждение. Перед назначением препаратов из класса антагонистов ССГ5-рецептора необходимо определять тропизм не только вирусов, которые активно реплицируются в организме, но и тех вирусов, которые представлены в виде минорных популяций. Резервуаром таких вирусных популяций служат инфицированные клетки, содержащие провирусную ДНК. Другой причиной, по которой определение тропизма может быть рекомендовано путем анализа ДНК ВИЧ-1, является необходимость смены вирусологически эффективной АРВ-терапии при возникновении побочных эффектов или с целью ее упрощения. Часто у таких пациентов уровень вирусной нагрузки находится на недетек-тируемом уровне. В таких случаях исследование провирус-ной ДНК остается единственной возможностью определить вирусный тропизм. Поэтому методика была использована как для РНК ВИЧ, так и для ДНК ВИЧ.
Исследование эффективности методики на клинических образцах проводилось в сотрудничестве с Институтом вирусологии Кельнского университета (University of Cologne, Institute of Virology, Кельн, Германия). В ходе испытаний двумя лабораториями независимо было протестировано 28 образцов крови. Вирусный тропизм определялся путем анализа плазмы крови при исследовании вирусной РНК ВИЧ и клеточной фракции при исследовании провирусной ДНК ВИЧ. Экстракцию нуклеиновых кислот проводили в Центральном НИИ эпидемиологии. После проведения экстракции каждый образец был разделен на две равные части, одна из которых анализировалась в ЦНИИ эпидемиологии, а вторая отправлена в Германию. Этапы амплификации, секвенирования и редактирования нуклеотидных последовательностей проводились независимо в двух лабораториях. Анализ нуклеотидных последовательностей с целью определения тропизма обеими лабораториями проводился с помощью ресурса geno2pheno[coreceptor] [9]. Использовалась клональная интерпретация с уровнем порога ложноположительного результата (false positive rate) 10% в соответствии с европейскими рекомендациями [13].
В ЦНИИ эпидемиологии успешно было проанализировано 48 образцов - 20 (71,4%) образцов плазмы крови и 28 (100%) образцов, содержащих лейкоциты крови. В лаборатории Кельна успешно было проанализировано 47 образцов - 19 (67,9%) образцов плазмы крови и 28 (100%) образцов лейкоцитов.
Сравнение полученных результатов производилось последовательно в несколько этапов. На первом этапе проводили оценку количества CCR5- и СХСЯ4-тропных вирусов ВИЧ-1, выявленных среди протестированных образцов.
Обеими лабораториями выявлено 8 образцов, содержащих СХСГ4-тропные варианты вирусов и 20 образцов, имеющих тропизм ccR5 (см. таблицу), что свидетельствует о высокой сходимости результатов независимых лабораторий. Однако также были получены два дискордантных результата между матрицами РНК и ДНК. Образец № 11 имел тропизм ccR5 при исследовании ДНК и cXcR4 при исследовании РНК в лаборатории ЦНИИЭ, в то время как в лаборатории Кельна для обеих матриц был получен результат CXCR4. Второй дискордантный образец (№ 13) дал обратную картину. В лаборатории ЦНИИЭ для него был получен результат cXcR4 для обеих матриц, а в лаборатории Кельна ccR5 при исследовании ДНК и cXcR4 при исследовании РНК.
При сравнении результатов двух лабораторий, полученных во время анализа разных видов клинического материала, было получено 100% совпадение, когда исследовалась вирусная РНК (17 образцов). При сравнении результатов анализа провирусной ДНК получено совпадение в 93% (26 из 28 образцов).
результаты анализа клинических образцов лабораториями ЦнииЭ и кельна
№ Вирусная ЦНИИЭ Кельн
нагрузка, копий/мл ДНК РНК ДНК РНК
1 1,09E+04 CCR5 CCR5 CCR5 CCR5
2 3,55E+04 CXCR4 CXCR4 CXCR4 CXCR4
3 9,25E+05 CCR5 CCR5 CCR5 CCR5
4 7,79E+03 CXCR4 CXCR4 CXCR4 CXCR4
5 5,69E+03 CCR5 NA CCR5 CCR5
6 1,90E+05 CCR5 NA CCR5 NA
7 8,93E+03 CCR5 CCR5 CCR5 CCR5
8 6,56E+05 CCR5 CCR5 CCR5 NA
9 4,75E+05 CCR5 CCR5 CCR5 CCR5
10 1,03E+05 CCR5 NA CCR5 NA
11 3,99E+05 CCR5 CXCR4 CXCR4 CXCR4
12 8,94E+04 CCR5 CCR5 CCR5 CCR5
13 3,22E+06 CXCR4 CXCR4 CCR5 CXCR4
14 1,11E+04 CCR5 NA CCR5 CCR5
15 1,17E+06 CCR5 CCR5 CCR5 CCR5
16 3,17E+03 CXCR4 NA CXCR4 NA
17 1,73E+05 CCR5 NA CCR5 NA
18 4,71E+05 CCR5 NA CCR5 NA
19 1,49E+05 CCR5 CCR5 CCR5 NA
20 1,90E+03 CCR5 CCR5 CCR5 CCR5
21 1,55E+03 CCR5 CCR5 CCR5 CCR5
22 3,38E+04 CCR5 CCR5 CCR5 NA
23 3,04E+04 CXCR4 CXCR4 CXCR4 CXCR4
24 9,58Е+02 CXCR4 CXCR4 CXCR4 CXCR4
25 3,24E+04 CCR5 CCR5 CCR5 CCR5
26 9,34E+04 CXCR4 CXCR4 CXCR4 CXCR4
27 8,04E+03 CCR5 CCR5 CCR5 CCR5
28 5,23Е+02 CCR5 NA CCR5 NA
Примечание. NA - данные отсутствуют.
На втором этапе проводили сравнение нуклеотидных последовательностей, полученных в обеих лабораториях. Анализ сравнения последовательностей, полученных в разных лабораториях, показал, что в случае исследования РНК ВИЧ для 7 из 17 образцов было получено 100% совпадение нуклеотидов в области петли V3. При исследовании ДНК ВИЧ 100% совпадение нуклеотидных последовательностей было получено только для 4 образцов из 28. Полученные нами результаты согласуются с другими исследованиями, показавшими большую вариабельность провирусной ДНК по сравнению с вирусной РНК в организме ВИЧ-инфицированного [4]. Во всех случаях неполного совпадения последовательностей отличия были дополнительно проанализированы. Под отличиями в нуклео-тидных последовательностях подразумевалось в том числе наличие в одной позиции вырожденного нуклеотида в одной лаборатории при его отсутствии во второй. При этом одно из значений данной полиморфной позиции соответствовало невырожденному нуклеотиду. В большинстве случаев отличие не подразумевало замены одного невырожденного нуклеотида на другой. Итоговая корреляция между нуклеотидными последовательностями составила 97,8% для последовательностей, полученных в ходе анализа вирусной РНК, и 95,9% для последовательностей, полученных с матрицы провирусной ДНК. Несмотря на большую вариабельность провирусной ДНК ВИЧ, анализ, проведенный независимо в обеих лабораториях, показал, что исследование провирусной ДНК более эффективно, так как происходит уменьшение количества невалидных образцов.
Заключение. В работе описан первый опыт применения в России генотипической методики определения тропизма ВИЧ, основанной на секвенировании V3 петли гена gp120 региона env с последующей интерпретацией с помощью ресурса geno2pheno[coreceptor]. Данная методика входит в состав зарегистрированного набора реагентов "АмплиСенс HIV-Resist-Seq" и может быть использована в клинических лабораториях.
Таким образом, в результате проведенной работы были получены дополнительные сведения об эффективности применения генотипической методики для определения тропизма ВИЧ при исследовании образцов от ВИЧ-инфицированных пациентов перед назначением маравирока в составе АРВ-терапии.
Работа проведена при финансовой поддержке представительства компании ВииВ Хэлскер в России.
ЛИТЕРАТУРА
1. Лопатухин А.Э., Киреев Д.Е., Куевда Д.А. Разработка единой стандартизованной методики определения тропизма ВИЧ у пациентов перед введением в состав АРВ-терапии препарата - антагониста ССГ5-рецепторов. VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием "Молекулярная диагностика-2010". Сборник трудов под ред. акад. РАМН В.И. Покровского. Т. I: 59-63.
2. Покровский В.В., Юрин О.Г., Кравченко А.В., и др. Протоколы лечения больных ВИЧ-инфекцией. Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2011; Приложение 3: 1-24.
3. Panel on antiretroviral guidelines for adults and adolescents. Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. Department of Health and Human Services. 1-239. Available at http://www.aidsinfo.nih.gov/ContentFiles/ AdultandAdolescentGL.pdf.
4. Abbate I., Rozera G., Tommasi C. et al. Analysis of co-receptor usage of circulating viral and proviral HIV genome quasispecies by ultra-deep pyrosequencing in patients who are candidates for CCR5 antagonist treatment. Clin. Microbiol. Infect. 2011; May, 17(5): 72531. doi: 10.1111/j.1469-0691.2010.03350.x. Epub. 2010 Nov. 5.
5. Brumme Z.L., Dong W.W., Yip B. et al. Clinical and immunological impact of HIV envelope V3 sequence variation after starting initial triple antiretroviral therapy. AIDS; 2004; 5, 18(4): F1-9.
6. Heera J., Ive P., Botes M. et al. The MERIT study of Maraviroc in anti-retroviral-naive patients with R5 HIV-1: 96-week results. Fifth international AIDS society (IAS) conference on HIV pathogenesis, treatment and prevention. Cape Town. 2009; abstract TUAB103.
7. Jensen M.A. Wout AB. Prediction HIV-1 coreceptor usage with sequence analysis. AIDS Rev. 2003; 5: 104-12.
8. Lalezari J., Goodrich J., DeJesus E. et al. Efficacy and safety of Maraviroc plus optimized background therapy in viremic, ART-experienced patients infected with CCR5-tropic HIV 1, 24-week results of a phase 2b/3 study in U.S. & Canada. Abstract 104bLB. 14th Conference on Retroviruses and opportunistic infections, Los Angeles. 2007; abstract/30635htm.
9. LengauerT., SanderO., SierraS., ThielenA., KaiserR. Bioinformatics prediction of HIV coreceptor usage. 2007 Dec; 25(12): 1407-10.
10. Prosperi M.C.F., Bracciale L., Fabbiani M. et al. Comparative determination of HIV-1 co-receptor tropism by Enhanced Sensitivity Trofile, gp120 V3-loop RNA and DNA genotyping. Retrovirology, 2010; 7: 56.
11. Sierra S., Kaiser R., Lübke N. et al. Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach. J. Vis. Exp. 2011; 58, e3264, DOI: 10.3791/3264.
12. Svicher V., D'ArrigoR., Alteri C. Performance of genotyping tropism testing in clinical practice using the enhanced sensitivity version of Trofile as reference assay: results from the OSCAR study group. New Microbiologica. 2010; 33: 195-206.
13. Vandekerckhove L.P., Wensing A.M., Kaiser R. et al. European guidelines on the clinical management of HIV-1 tropism testing. Lancet Infect Dis. 2011; 11(5): 394-407.
14. Whitcomb J.M., Huang W., Fransen S. et al. Development and characterization of a novel single-cycle recombinant virus assay to determine human immunodeficiency virus type 1 coreceptor tropism. Antimicrob Agents Chemother. 2007; 51(2): 566-75.
Поступила 17.08.12
