CC BY
60
Первый опыт комплексного электронно-микроскопического и бактериологического исследования камней предстательной
железы
И.В. Виноградов1, Д.Г. Ким2, Л.В. Диденко3
Кафедра клинической андрологии ФГБОУВПО «Российский университет дружбы народов», Москва 2Городской фонд ДНК-исследований, Москва; 3лаборатория анатомии микроорганизмов ФГБУ«Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва
Контакты: Игорь Владимирович Виноградов [email protected]
Работа основана на изучении камней предстательной железы, полученных при трансуретральной резекции простаты у 5 пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы в сочетании с хроническим калькулезным простатитом. Камни исследованы методами сканирующей электронной микроскопии и рентгеновского микроструктурного анализа, а также проведено сравнительное бактериологическое исследование смывов с поверхности камней после их ультразвуковой обработки и без нее. Выявлено, что на поверхности камней простаты присутствуют бактериальные биопленки, а в состав камней входят микроэлементы, которые могут быть использованы бактериями в качестве источников питания, необходимых для их жизнедеятельности. Предварительная обработка ультразвуком камней простаты перед посевом на питательные среды смывов способствует улучшению бактериологической диагностики, что может быть связано с дисперсией биопленок, и выходу вегетативных форм бактерий из биопленки. Эта особенность ультразвука может послужить теоретическим обоснованием для его применения в целях улучшения эффективности диагностики различных форм простатита.
Ключевые слова: камни предстательной железы, хронический простатит, биофильм-инфекция (микробные биопленки), хроническое воспаление, электронная микроскопия, ультразвуковая терапия
First experience of electron microscopic and bacteriological examination of the prostate gland stones
I.V. Vinogradov, D.G. Kim, L.V. Didenko
'Department of Clinical Andrology, Peoples' Friendship University of Russia, Moscow
2City DNA Study Foundation, Moscow
3Laboratory for Anatomy of Microorganisms, N.F. Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology,
Ministry of Health of Russia, Moscow
The work is based on a study of prostate stones obtained by transurethral resection of the prostate in 5 patients with benign prostatic hyperplasia in combination with chronic calculous prostatitis. Stones have been investigated by scanning electron microscopy and X-ray microstructural analysis, as well as a comparative study of bacteriological swabs from the surface of the stones after ultrasonic treatment of stone and without it. Pretreatment ultrasound prostate stones before sowing on nutrient medium swabs improves bacteriological diagnosis, which may be due to the dispersion of biofilms and exit vegetative forms of bacteria from it. This feature can serve as ultrasound theoretical justification for its use to improve the efficiency of diagnosis of various forms of prostatitis.
Key words: stones prostate, chronic prostatitis, biofilm infection, chronic inflammation, electron microscopy, ultrasound therapy
Введение
Хронический простатит (ХП) является одним из самых распространенных урологических заболеваний, поражающих мужчин молодого и среднего возраста [1, 2]. Заболевание представляет собой значительную социальную и психологическую проблему, так как приводит к существенному снижению качества жизни, в том числе за счет негативного влияния на половую и репродуктивную функции [3].
Одним из факторов, приводящих к персистенции микроорганизмов в простате и длительному рецидивирующему течению ХП, является образование камней в предстательной железе [4—7] и формирование микробных биопленок на их поверхности [8].
Бактерии в составе биопленок по своим свойствам отличаются от свободно плавающих (планктонных) бактерий того же вида, так как образуемый ими экзопо-лисахаридный матрикс в условиях воздействия небла-
гоприятных факторов внешней среды и защитных функций организма-хозяина предоставляет бактериям преимущества. Экзополисахаридный матрикс биопленки определяет устойчивость бактерий к антибиотикам. Часть клеток в биопленке находится в состоянии покоя и имеет очень низкий уровень метаболической активности. В такой форме бактерии временно утрачивают способность к размножению и культивированию в лабораторных условиях при сохранении патогенного потенциала [9, 10].
Вероятно, это объясняет тот факт, что только 5—10 % пациентов с диагнозом ХП имеют положительные результаты микробиологического исследования секрета предстательной железы или эякулята [11]. При этом J.N. Krieger et al. в 1996 г. были выявлены бактериальные гены в ткани простаты у большинства (77 %) пациентов с ХП, а по данным ведущего мирового эксперта по этой проблеме J.C. Nickel, антибактериальная терапия оказывается эффективной в 40 % случаев, что может служить доказательством присутствия бактерий в простате пациентов с ХП категории IIIA в противовес отрицательным результатам рутинного микробиологического исследования [12].
Кроме того, бактерии внутри биопленки становятся недоступны для иммунной системы организма-хозяина [13, 14].
Процесс образования камней в предстательной железе может быть реализован с помощью различных механизмов. Они включают в себя хроническое воспаление, застой секрета в железе, рефлюкс мочи из мочеиспускательного канала при инфравезикальной обструкции, пороки развития предстательной железы и полиморфизм гена белков-ингибиторов кальцифи-кации. В ряде работ доказывается роль бактерий как этиологического фактора, провоцирующего образование конкрементов урогенитального тракта [15, 16]. Большинство авторов считают, что основными механизмами литогенеза в предстательной железе являются преципитация простатического секрета и кальци-фикация амилоидных телец в процессе воспаления в простате, и оценивают их как осложнение ХП [17].
Частота обнаружения камней у пациентов значительно возросла с применением методов ультразвуковой диагностики. Принято считать, что частота обнаружения камней в простате увеличивается с возрастом, но в ряде работ была показана клиническая корреляция между образованием камней в предстательной железе и синдромом хронической тазовой боли и симптомами нижних мочевых путей у молодых мужчин [18-20].
Актуальность исследования
Несмотря на то что микробному фактору отводится определенная роль в процессе образования камней в предстательной железе, остаются неясными механиз-
мы персистенции микроорганизмов и их роль в реализации воспалительных процессов в простате.
Очевидно, что результаты исследований патогенетических закономерностей, связанных с микробным фактором, будут способствовать разработке новых подходов к диагностике, схем лечения и профилактики простатолитиаза.
Цель исследования — определить химический состав камней предстательной железы и провести сравнительное бактериологическое исследование смывов с поверхности камней после их ультразвуковой обработки и без нее.
Материалы и методы
Объектами нашего исследования послужили камни размером 0,2—0,7 см в диаметре, полученные в стерильных условиях при трансуретральной резекции предстательной железы 5 пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы в клинике кафедры клинической андрологии ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» на базе НУЗ «Дорожная клиническая больница им. Н.А. Семашко на ст. Люблино ОАО «РЖД».
Камни простаты от каждого пациента были разделены на 3 фрагмента, каждый из которых был помещен в стерильный раствор 0,9 % NaCl. Таким образом, от каждого пациента было получено по 3 образца.
Для исследования состава микрофлоры смывные воды от образцов № 1 каждого пациента объемом 2 мл помещали в пробирку с мясо-пептонным бульоном и культивировали при температуре 37 °C в течение 24 ч. После инкубации производили посев на агаризо-ванную среду Columbia и инкубировали в термостате при температуре 37 °C. Учет результатов и видовую идентификацию микроорганизмов осуществляли спустя 24 ч после посева.
Образцы № 2 помещали в специальную резиновую капсулу с 0,9 % раствором NaCl и подвергали обработке ультразвуком в импульсном режиме с помощью аппарата УЗТ-1.03У в водной среде. Мощность воздействия составляла 0,4 Вт/см2, суммарная длительность — 30 мин. После указанного воздействия из капсулы извлекали 2 мл среды и помещали в мясо-пептонный бульон, далее действовали по схеме опыта, которая описана выше для интактных фрагментов камней предстательной железы. Бактериологические исследования были осуществлены на базе бактериологической лаборатории Городского фонда ДНК-исследований.
Образцы № 3 были фиксированы по методу Ito— Karnovsky. После фиксации образцы помещались на карбоновый скотч и алюминиевый столик, напылялись слоем золота толщиной 5 нм в напылительной установке (SPEI, USA). Анализ образцов осуществлялся в электронно-ионном сканирующем микроскопе Quanta 2003D (FEI Company, USA) в режиме высокого
Концентрация микроорганизмов, обнаруженных в камнях предстательной железы
Образец камня Обнаруженные микроорганизмы, концентрация (кл/мл)
1 2 3 4 5
Контроль (образцы № 1) - - - - E. coli 1 x 103
Камни предстательной железы, обработанные ультразвуком (образцы № 2) - - Klebsiella spp. 105 Acinetobacter spp. 106 E. coli 1 x 106
вакуума при ускоряющем напряжении 10 кВ. Исследование элементного состава камней производилось с помощью приставки к сканирующему электронному микроскопу EDAX (FEI Company, USA).
Результаты исследования
В смывах с образцов камней, не подвергшихся воздействию ультразвуком, только в одном случае был обнаружен рост кишечной палочки в концентрации 1 X 103 кл/мл.
После воздействия на камни ультразвуком и последующего посева смывных вод рост бактерий был зафиксирован уже в 3 из 5 случаев. Следует отметить, что в том образце камня, в смывных водах которого без ультразвуковой обработки был получен рост кишечной палочки, концентрация последней после ультразвуковой обработки возросла в 2 раза (таблица).
При исследовании образцов в сканирующем электронном микроскопе выявлено, что камни имели участки с гладкой поверхностью и кристаллоподобные структуры с острыми краями. В камне выявлялись трещины и сколы (рис. 1).
Рис. 2. Биопленка на поверхности камня
Рис. 1. Общий вид фрагмента камня предстательной железы (а, в); строение поверхности камня при большем увеличении: кристаллопо-добные структуры с острыми краями (стрелки) (б, г)
Рис. 3. Кокковидные бактерии на поверхности камня
На гладкой поверхности камней и в трещинах были обнаружены бактериальные биопленки, которые представляли собой конгломераты бактерий, покрытых экзоклеточным матриксом (рис. 2). Отдельные участки биопленки состояли из хорошо визуализируемых кокковидных бактерий с минимальным покрытием экзоклеточным матриксом (рис. 3).
Обсуждение
Выявлено наличие на поверхности камней простаты адгезированных бактерий и образованных ими биопленок. Рентгеновский микроструктурный анализ, проведенный с помощью приставки EDAX к сканирующему электронному микроскопу, показал, что в состав камня помимо кальция, цинка, кремния входят химические элементы, которые могут быть использованы бактериями в качестве источников питания, необходимых для их жизнедеятельности. К этим химическим элементам относятся углерод, азот, сера, фосфор. У одного из пациентов выявлено наличие в камне изотопа урана (рис. 4).
Образование биопленок на поверхности камня приводит к формированию очага персистенции ин-
Рис. 4. Микроэлементный состав камней предстательной железы
фекционных агентов. Особенностью такого очага является устойчивость к антибактериальной терапии и факторам клеточного и гуморального иммунитета. Кроме этого, следует отметить, что миграция бактерий из биопленок непредсказуема, и соответственно обнаружение патогенных бактерий в секрете пред-
стательной железы является скорее случайным событием.
Нами показано, что предварительная обработка ультразвуком камней предстательной железы (перед посевом на питательные среды смывов) способствует улучшению бактериологической диагностики, что, возможно, связано с дисперсией биопленки, и выходу вегетативных форм бактерий из нее.
Следует отметить, что использованный режим ультразвуковой обработки не влиял на жизнеспособность бактерий, колонизирующих камни.
В литературе имеются единичные указания на то, что при воздействии ультразвуковыми волнами низкой интенсивности не только не наступает разрушение жизнеспособных микроорганизмов, но при определенных условиях происходит стимуляция их роста. Эта особенность воздействия ультразвука на отдельные микроорганизмы и микробные сообщества может послужить теоретическим обоснованием для его применения в целях улучшения эффективности диагностики различных форм простатита.
Ультразвуковая терапия в диагностических целях у пациентов с калькулезным ХП и отрицательными результатами бактериологического исследования секрета простаты/эякулята до начала этиопатогенетиче-ской терапии может способствовать активации микрофлоры в составе локализованной на поверхности камня биопленки с последующей миграцией вегетативных форм бактерий в секрет предстательной железы, при этом возрастает вероятность обнаружения бактерий и соответственно может быть откорректирована антибактериальная терапия.
Полученные нами данные могут указывать на несовершенство общепринятой классификации ХП, так как граница между II и III категориями заболевания носит условный характер и во многом определяется недостаточной чувствительностью и специфичностью существующих методов диагностики.
Ограниченные возможности бактериологических методов приводят в ряде случаев к ошибочному или неполному диагнозу. Поскольку эти методы не выявляют жизнеспособные бактерии в составе биопленок, зачастую делается заключение о «стерильном воспалении» или вирусной инфекции.
Выводы
При использовании общепринятых бактериологических методов исследования микрофлоры камней результаты могут быть ложноотрицательными, так как свойства роста бактерий в составе биопленки, локализованной на поверхности камня, могут быть изменены воздействием извне.
Воздействие ультразвуковыми волнами малой интенсивности на микробные биопленки может стимулировать ростовые свойства бактерий за счет диспергирующего
действия на экзополиматрикс биопленки и выхода вегетативных форм бактерий. Эта особенность воздействия ультразвука может послужить теоретическим обоснованием для его применения в целях улучшения эффективности диагностики бактериальных форм простатита.
Граница между бактериальным и абактериальным простатитом зачастую носит условный характер, так как во многом определяется недостаточной чувствительностью и специфичностью существующих методов диагностики.
1. Schaeffer A.J. Clinical practice. Chronic prostatitis and the chronic pelvic pain syndrome. N Engl J Med 2006;355(16): 1690-8.
2. Урология. Национальное руководство. Под ред. Н.А. Лопаткина. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009.
3. Аляев Ю.Г., Шпоть Е.В., Султанова Е.А. Хронический простатит: оптимизация подходов к лечению. Рус мед журн 2011;32: 2057.
4. De Marzo A., Platz E., Sutciliffe S. et al. Inflamation in prostate carcinogenesis. Nat Rev Cancer 2007;7(4):256-69.
5. Bartoletti R., Cai T., Mondaini N. et al. Prevalence, incidence estimation, risk factors and characterization of chronic prostatitis/ chronic pelvic pain syndrome in urological hospital outpatients in Italy: results
of a multicenter case-control observational study. J Urol 2007;178(6):2411-5.
6. Sfanos K.S., Sauvageot J., Fedor H.L. et al. A molecular analysis of prokaryotic and viral DNA sequences in prostate tissue from patients with prostate cancer indicates the presence of multiple and diverse microorganisms. Prostate 2008;68(3):306-20.
ЛИТЕРАТУРА
7. Zhao W.P., Li Y.T., Chen J. et al. Prostatic calculi influence the antimicrobial efficacy in men with chronic bacterial prostatitis. Asian J Androl 2012;14(5):715-9.
8. Mazzoli S. Biofilms in chronic bacterial prostatitis (NIH-II) and in prostatic calcifications. FEMS Immunol Med Microbiol 2010;59(3):337-44
9. Плакунов В.К., Стрелкова Е.А., Журина М.В. Персистенция и адаптивный мутагенез в биопленках. Микробиология 2010;79(4):447-58.
10. Flemming H.C., Wingender J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol 2010;8(9):623-33.
11. Nickel J.C., Weidner W. Chronic Prostatitis: Current Concepts and Antimicrobial Therapy. Infect Urol 2000;13(Suppl):22-8.
12. Nickel J.C. Rational management
of nonbacterial prostatitis and prostatodynia. Curr Opin Urol 1996;6:53-8.
13. Wolcott R.D., Ehrlich G.D. Biofilm and chronic infections. JAMA 2008;299(22): 2682-4.
14. Vu B., Chen M., Crawford R.J., Ivanova E.P. Bacterial extracellular polysaccharides involved
in biofilm formation. Molecules 2009;14(7): 2535-54.
15. Вощула В.И., Лыш Е.Я., Станкевич С.И. Инфекция в этиопатогенезе мочекаменной болезни. Мед новости 2007;11:113-8.
16. Bruyere F., Traxer O., Saussine C., Lechevallier E. Infection and urinary lithiasis. Prog Urol 2008;18(12):1015-20.
17. Sfanosa K.S., Wilson BA., De Marzoa A.M., Isaacsb W.B. Acute inflammatory proteins constitute the organic matrix of prostatic corpora amylacea and calculi in men with prostate cancer. Proc Natl Acad Sci USA 2009;106(9):3443-8.
18. Shoskes D.A., Lee C.T., Murphy D. Incidence and significance of prostatic stones in men with chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome. Urology 2007;70(2):235-8.
19. Kim W.B., Doo S.W., Yang W.J., Song Y.S. Influence of prostatic calculi on lower urinary tract symptoms in middle-aged men. Urology 2011;78(2):447-9.
20. Hong C.G., Yoon B.I., Choe H.S. et al. The Prevalence and Characteristic Differences in Prostatic Calcification between Health Promotion Center and Urology Department Outpatients. Korean J Urol 2012;53(5):330-4.
