CC BY
54
Российский кардиологический журнал № 5 (43) / 2003
КАРДИОХИРУРГИЯ
ПЕРВЫЙ ОПЫТ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ АУТОЛОГИЧНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ СОКРАТИТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ МИОКАРДА
Шумаков В.И., Казаков Э.Н., Онищенко Н.А., Гуреев С.В., Остроумов Е.Н., Честухин В.В.,
Крашенинников М.Е., Миронков Б.Л., Хубутия А.Ш.
НИИ Трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ, Москва
Резюме
Предшествующие экспериментальные исследования показали, что мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (МСК) имеют способность дифференцироваться в кардиомиоциты in vitro и in vivo, индуцируя ангио-генез и восстанавливая поврежденную миокардиальную функцию. Между тем, возможности клеточных технологий в клинической кардиологии остаются неизученными.
С января 2003г. в клинике института восьми больным с сердечной недостаточностью выполнена трансплантация аутологичных МСК с различными сроками культивации: 6 больным МСК вводили интракоронарно и 2 больным - интрамурально, в зону пост-инфарктного кардиосклероза. В трех случаях МСК непосредственно перед трансплантацией были помечены Таллием-201 с целью определения местонахождения введенных МСК в ближайшие часы после трансплантации. Результаты радиоизотопной сцинтиграфии показали, что через 1,5 часа после интракоронарного введения и через 6,5 часов после интрамиокардиальной инъекции МСК остаются в зоне введения.
Через месяц после трансплантации МСК выявлено улучшение регионарной перфузии и диастолической функции миокарда у всех больных. Отчетливый рост ФИЛЖ с 31 до 40% выявлен у больного ИКМП после интраму-рального введения МСК. Через 1 месяц после трансплантации МСК отмечено улучшение качества жизни и толерантности к физической нагрузке. МСК, введенные интракоронарно, остаются в бассейне коронарной артерии, через которую осуществлялось введение МСК. Интракоронарное и интрамуральное введение МСК улучшает функциональные показатели сократительной функции миокарда, повышает толерантность к физической нагрузке и качество жизни больных с ХСН.
Ключевые слова: клеточная трансплантация, мезенхимальные стволовые клетки, аутологичный костный мозг, восстановление миокардиальной функции.
Несмотря на успехи медицинской науки последних лет, количество пациентов с хронической сердечной недостаточностью (ХСН) увеличивается с каждым годом, что является одной из главных проблем здравоохранения всех экономически развитых стран мира.
По прогнозам департамента здоровья и человеческих ресурсов США, в стране будет продолжаться неуклонный рост числа больных с ХСН, и к 2050 г. в США уже будет более 16 миллионов таких больных [12].
Увеличение частоты развития ХСН в человеческой популяции заставляет специалистов разрабатывать принципиально новые, доступные и эффективные методы лечения ХСН.
Одним из таких методов является пересадка в миокард малодифференцированных клеток с мощным потенциалом к пролиферации и дифференцировке, с целью улучшения сократительной способности миокарда, регуляции процессов ремоделирования левого желудочка (ЛЖ) после инфаркта миокарда (ИМ), ле-
чения дилатационной кардиомиопатии (ДКМП) и других патологий [1, 2, 5 , 8, 17,18].
В эксперименте было доказано, что восстановление функции миокарда может быть достигнуто путем повышения функционального резерва кардио-миоцитов реципиента за счет стимуляции в них процессов гиперплазии и неоангиогенеза, а также инги-бирования апоптоза [1, 2, 4, 8, 15, 16, 17].
Из различных направлений клеточной трансплантации наиболее перспективным является трансплантация прекультивированных МСК ауто-логичного костного мозга [1, 2, 16, 17]. Эти клетки, будучи аутологичными для реципиента, снимают с врача этические, юридические и организационные проблемы получения донорских клеток, а также устраняют необходимость иммуносупрессивной терапии, которая обычно требуется после трансплантации эмбриональных и фетальных клеток [10]. Среди МСК костного мозга выделяют две популяции клеток: популяцию гемопоэтических стволовых клеток, которые способны пролиферировать и дифферен-
42
Таблица 1
Клиническая характеристика больных, отобранных на трансплантацию МСК
Пациенты: 1 2 3 4 5 6 7 8*
Возраст, (лет) 34 46 46 42 32 52 65 29
Диагноз ИКМП ИКМП ИКМП ИБС ДКМП ИКМП ИКМП ИБС, ОИМ
Лист ожидания ТС - - + - + + - -
ФК СН по ЫУНА Ш-М ■ ■■-IV ■■■-IV N N - ■■
Кол-во перенесенных инфарктов миокарда 1 2 2 1 0 1 2 1
Блокада ЛНПГ + + + - - - + -
Длительность ХСН, (в месяцах) 12 4 12 2 12 6 4 ме нее 1 мес.
Одышка в покое - - + - + - - -
Оте ки + + + - + + - -
Зависимость от мочегонных средств + + + - + + - -
р-блокаторы + + + + - - + +
Дигоксин - - + - + + - -
Ингибиторы АПФ + + + + + + + +
Нитраты + + + + + + + +
Коронарная ангиопластика ПМЖВ ЛКА в анамнезе - - - + - + - +
Примечание: ТС - трансплантация сердца; ФК - функциональный класс; ОИМ - острый инфаркт миокарда; БЛНПГ - блокада левой ножки пучка Гиса; ПМЖВ - передняя межжелудочковая ветвь; ЛКА - левая коронарная артерия;* больной поступил в клинику института через 14 часов после развития острого ИМ.
цироваться в элементы красной и белой крови, и популяцию стромальных пластик-адгезивных клеток, которые при культивировании могут дифференцироваться в клетки тканей мезенхимального происхождения, в том числе — и в кардиомиоциты [1, 2, 13, 16, 17].
Прокультивированные в течение 7 дней в питательной среде, с обработкой в течение 24 часов 5-азацитидином, аутологичные МСК костного мозга, очищенные от эритроидных и тромбоцитарных элементов, после пересадки в зону экспериментального кардиосклероза, полученного путем криопов-реждения, вызвали у крыс ограничение экспансии рубца и левожелудочковой дилатации, улучшение коронарной перфузии и насосной функции сердца. Также было показано, что прекультивированные МСК костного мозга после пересадки в миокард дифференцировались в клетки эндотелия, гладко-мышечные клетки и в кардиомиоциты, образуя щелевые контакты [9, 10, 15, 16, 17]. Аналогичные и весьма обнадеживающие результаты трансплантации пластик-адгезивных МСК в эксперименте были получены в лаборатории биотехнологии стволовых клеток нашего института [1,2].
Настоящая работа является первым в России клиническим исследованием, анализирующим первые результаты трансплантации аутологичных МСК больным с ХСН, полученные в рамках клинической программы трансплантации МСК, разработанной и осуществляемой в НИИТ и ИО МЗ РФ с января 2003 г.
В нашем исследовании мы поставили задачу выявить зоны накопления МСК при интракоронарном и интрамуральном способах введения в миокард и оценить влияние этих клеток на показатели миокар-ди аль ной пер фу зии и со кра ти тель ной функ ции сердца у больных с ХСН.
Материалы и методы
Общая характеристика больных — реципиентов МСК.
В исследование было включено восемь пациентов с клиническими проявлениями сердечной недостаточности: пять больных с ишемической кардио-миопатией (ИКМП), один больной ИБС, один больной с ДКМП, один пациент с острым трансму-ральным инфарктом миокарда передней стенки левого желудочка. Трое из этих больных находятся в листе ожидания трансплантации сердца. Исходные клинические данные этих больных представлены в табл. 1.
Трем больным (пациент 4, 6 и 8) в сроки за 21, 63 и 6 дней до трансплантации МСК была выполнена баллонная ангиопластика передней межжелудочковой ветви левой коронарной артерии (ПМЖВ).
Данные гемодинамики и сократительной функции и размеров полостей сердца у больных перед трансплантацией МСК представлены в табл. 2.
Из таблиц 1 и 2 видно, что все больные имели клинические и функциональные проявления сердечной недостаточности, но степень ее проявления была неодинаковой.
43
Российский кардиологический журнал № 5 (43) / 2003
Таблица 2
Состояние внутрисердечной гемодинамики, сократительной функции и размеров полостей сердца
у больных перед трансплантацией МСК
Пациенты: 1 2 3 4 5 6 7 8 М±т
ФИ ЛЖ,* в % 32 33 12 53 11 14 45 45 30,6±16,6
ФИ ПЖ, *в % 40 60 33 62 15 21 39 50 40,0±16,6
КДР ЛЖ2, в см. 5,9 6,6 5,8 4,7 8,1 7,7 6,7 5,6 6,4±1,1
КДО ЛЖ2,в мл. 178 220 167 100 354 279 234 154 210,7±79,5
КДР ПЖ2,в см 2,9 2,2 2,6 2,4 3,0 3,2 3,1 2,5 2,7±0,36
ДЛА1 сист, мм рт.ст. 65 26 38 38 50 50 41 - 44±11,5
ДЛАдиаст,мм рт.ст. 30 14 20 16 16 23 19 - 19,7±5,1
КДДЛЖ1, мм рт.ст. 35 11 20 15 20 22 21 19 20±6,5
ЧСС 72 54 90 70 100 94 63 77 77±16
Примечание: ФИ - фракция изгнания, ЛЖ- левый желудочек, ПЖ- правый желудочек, КДР - конечно-диастолический размер; КДД ЛЖ- конечно-диастолическое давление; * — по данным радиоизотопной вентрикулографии,1 — по данным зондирования полостей сердца,2 — по данным ЭхоКП
Получение трансплантационного материала и способы его введения больным:
Забор аутологичных клеток костного мозга осуществляли под местной анестезией в условиях операционной путем пункции гребня подвздошной кости больных, готовящихся к трансплантации МСК. Аспират в количестве 150-300 мл. помещали в пробирки, содержащие гепарин, затем центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин; полученный осадок клеток ре-суспендировали в лизирующем гипотоническом растворе, затем интенсивно перемешивали и вновь центрифугировали в течение 5 мин в том же режиме.
Культивация клеток. Гемолизированный суперна-тант полностью удаляли отсасыванием, а клеточный осадок, свободный от эритроидных и тромбоцитар-ных элементов, в количестве 350-1500 • 106 клеток ре-суспендировали в ростовой среде Iskov's (Gibco, Grand Island), с добавками. Суспензию клеток затем высевали для культивирования на чашки Петри d=150 мм в концентрации 2,5-3,0 • 106 кл/мл при 37оС в СО2-инкубаторе — атмосфере с 5% СО2 и 95% влаж-
Рис.1. МСК в процессе культивирования: а-через 1 неделю культивирования, 3-и сутки после обработки МСК 5-азацитидином; в поле зрения — прикрепляющиеся клетки костного мозга; увеличение х 600, фазовый контрас; б-через 8 недель культивирования; в поле зрения — образовавшийся монослой прикрепившихся распластанных (пластик-адгезивных) клеток и делящиеся ошаренные клетки; увеличение х 400, фазовый контраст.
ности на 2-е суток. В конце вторых суток в среду вносили 5-азацитидин (Sigma, USA), до конечной концентрации 6 мкМ на 72 часа, для направления диф-ференцировки стромальных МСК в кардиомиоцито-подобные и для ингибирования спонтанной диффе-ренцировки их по остеобластоидному направлению [1,2]. Через 72 часа инкубации с 5-азацитидином (на шестые сутки культивирования) смешанная культура МСК использовалась либо для введения в коронарное русло, либо для продолжения ее культивирования (рис. 1а).
Продолжение культивирования имело целью получение культуры МСК, обогащенной стромальными стволовыми клетками, имеющими кардиомиоцитар-ное направление дифференцировки. Для этого куль-туральную среду полностью заменяли ростовой с добавлением к ней инсулиноподобного фактора роста II, основного фактора роста фибробластов, тироксина и трийодтиронина. Среду заменяли через каждые три дня в течение 2-3 месяцев для наращивания значительной клеточной массы (рис. 1б) до 15-50 • 106 клеток, в зависимости от исходного пула стволовых клеток в аспирате больного. Перед интрамуральным введением этих клеток во время кардиохирургической операции, пластик-адгезивные клетки снимались методом трипсинизации, и отмывались центрифугированием; образовавшийся осадок ресуспен-дировался в растворе Хэнкса с добавками до конечной концентрации 10 • 106 кл/мл и хранился на льду до введения больному не более 8 часов. Жизнеспособность клеток при кратко сроч ном культи ви ро ва нии со ста ви ла 95+2% по окрашиванию трипановым синим.
Было применено два способа введения МСК в миокард: интракоронарное введение и интрамуральное введение — в зону постинфарктного кардиосклероза.
Интракоронарное введение МСК осуществ-
44
Таблица 3
Длительность культивирования и способы введения МСК
Пациенты 1 2 3 4 5 6 7* 8
Дата забора клеток 18.01.03 24.01.03 21.02.03 13.03.03 27.03.03 4.04.03 4.04.03 4.04.03
Срок культивации, в сутках 61 55 5 7 6 5 12 4
Дата введения клеток 20.03.03 20.03.03 26.02.03 20.03.03 02.04.03 09.04.03 16.04.03 8.04.03
Метод введения Интрако- Интраму- Интрако- Интрако- Интрако- Интрако- Интраму- Интрако-
ронарное ральное ронарное ро нар ное ро нар ное ро нар ное ральное * ро нар ное
Количество клеток, млн. 125 52 63 583 400 160 30 300
Примечание: * интрамуральное введение МСК в область постинфарктного кардиосклероза во время операции: аорто-коро-нарное шунтирование передней межжелудочковой ветви, ветви тупого края и правой коронарной артерии в сочетании с пластикой митрального клапана.
лялось селективно, через катетер, введенный в инфаркт-зависимую коронарную артерию. После точного позиционирования катетера в коронарной артерии под контролем ангиографии, взвесь клеток (3 мл), содержащая от 63 до 500 млн. МСК разводилась физиологическим раствором до объема 50 мл и вводилась порциями по 20 мл.
Интрамуральное введение МСК осуществлялось путем инъекции в миокард взвеси клеток, содержащей от 30 до 52 млн. МСК в 2,5 мл физиологического раствора; МСК культивировались в течение 55-61 дней. Сроки культивации МСК и способы их доставки в миокард представлены в табл. 3.
Методы оценки эффективности трансплантации МСК.
Оценку эффективности трансплантации МСК больным с ХСН проводили с помощью клинических и сцинтиграфических методов исследования.
Оценка клинического состояния больных проводилась путем определения функционального класса ХСН по NYHA, объективного 6-минутного теста и методики субъективной оценки состояния больного с вычислением индекса активности (The Duke Activity Status Index -индекс DASI) [4, 20]. По этой методике более высоким значениям индекса соответствует более высокая физическая активность боль ных.
Оценку качества жизни больных проводили с помощью валидизированной методики изучения индекса качества жизни больных с ХСН — согласно Миннесотскому опроснику проводился расчет индекса MLHFQ (Minnesota Living with Heart Failure Questionnaire — индекс MLHFQ), где более высокий показатель индекса соответствует менее высокому качеству жизни больных с ХСН [4, 19].
Сцинтиграфическое обследование больных проводилось всем больным непосредственно перед трансплантацией МСК и 4-м больным через один месяц после трансплантации МСК была выполнена перфу-зионная сцинтиграфия миокарда и радионуклидная вентрикулография. Исследования проводили по методикам, принятым в НИИТ и ИО МЗ РФ на гам-
ма-камере BASICAM фирмы SIEMENS с использованием отечественной системы сбора и обработки ра-дионуклидной информации ГОЛД-РАДА.
Для визуализации месторасположения МСК в сердце после введения их больным клетки метили in vitro таллием-201, имеющим период полураспада 48 часов. Для этого за 24 часа до трансплантации МСК в миокард, в культуральную среду с клетками вносили радиоактивный хлорид таллия, из расчета 0,5 МБк/мл. Непосредственно перед трансплантацией клеточная культура отмывалась от среды с остаточной радиоактивностью раствором Хэнкса без Са2+ и Mg2+ и затем вводилась больному либо интракоронарно, либо ин-трамиокардиально, во время операции на открытом сердце. После регистрации изображений МСК, меченных таллием-201, через 1,5 часа после интракоро-нарного введения и спустя 6,5 часов после интраму-рального введения проводили обязательное сравнение среднего счета радиоактивности вне тела, в области печени и в области сердца, куда стволовые клетки не вводили, а также и в зоне накопления радиоактивного индикатора.
Для уточненной оценки месторасположения МСК в сердце после регистрации их изображений с помощью таллия-201, не изменяя положения больного по отношению к гамма-камере, внутривенно вводили другой перфузионный радиоактивный агент — тетро-фосмин — Тс-99м. По перфузионному изображению миокарда с тетрофосмином —Тс-99м обводили область левого желудочка, и полученный контур накладывали на изображение МСК, меченных талли-ем-201. Таким образом, используя метод двойной метки, мы оценивали точное местоположение введен ных МСК.
Для оценки общего изменения перфузии миокарда при обработке результатов статического изображения миокарда, кроме стандартной оценки распределения перфузии по 10 сегментам, в каждом изображении рассчитывали величину захвата миокардом тетрофос-мина —Тс 99м (в % от введенной дозы). Этот показатель служил аналогом миокардиальной фракции сердечного выброса и отражал в процентах долю сердечного выброса, приходящуюся на весь миокард.
45
Российский кардиологический журнал № 5 (43) / 2003
Изображения стволовых клеток меченных таллием 201 после их введения в миокард
До
После
До
а. Введение в среднюю треть ПМЖВ ЛКА
б. Множественные
инъекции в иброзно-измененный иокард
После V.
1
¿Л
2
Фронтальная
я
Левая косая
Левая боковая
□
© Ш> 4Р Ш
^ ж/ Щг
Контуры наложены с изображений миокарда с террофосмином Тс-99м, выполненных вслед за введением стволовых клеток
Рис. 2. Выявление местонахождения МСК после их введения в миокард.
Сцинтиграммы пациентов 2 и 4; см. табл. 1-5. 1- изображение МСК, меченных таллием -201 в культуре; 2-уточненная диагностика местонахождения МСК после наложения сцинтигра-фического изображения левого желудочка, полученного с помощью тетрофосмина-Тс-99м; а — введение МСК интракоронарно в средний сегмент ПМЖВ ЛКА, МСК идентифицируются в области верхушки левого желудочка, (пациент 4); б - введение МСКинтрамурально, в зону постинфарктного фиброза, (па ци ент 2).
Для раздельной оценки распределения перфузии в миокарде в систолу и диастолу, выполняли синхронизированную с ЭКГ регистрацию изображений перфузии миокарда с формированием в репрезентативном цикле 16 изображений. Затем, с помощью анализа Фурье, были сформированы параметрические изображения амплитуды сокращения, ударного объема, парадоксального движения стенки и фазового изображения начала изгнания. При региональной оценке этих изображений по 10 сегментам оценивали распределение перфузии в миокарде в систолу и диастолу раздельно.
Результаты
Идентификация МСК, введенных в миокард.
Изучение терапевтических эффектов МСК на функцию сердца требовало, прежде всего, определения их местонахождения после интракоронарного и интрамиокардиального введения МСК. Если после интрамурального введения МСК в постинфарктную зону кардиосклероза логично было предположить, что введенные стволовые клетки будут находиться в области инъекции, то где окажутся МСК после интракоронарного введения — следовало установить. Для решения этого вопроса был выбран безопасный метод сцинтиграфической диагностики, основанный на последовательном применении двух радиоизотопных меток: Таллия-201 для МСК в культуре и тетро-фосмина -Тс- 99м для внутривенного введения больному. Исследование было проведено на 3-х больных: у 2-х больных — с интракоронарным введением МСК и у 1 больного — с интрамуральным введением клеток
а б в г
Рис. 3. Количественная оценка региональных изменений перфузии по стандартным проекциям статической сцинти-графии миокарда с тетрофосмином-Тс-99м у больного ИКМП (пациент 3; см. табл.1-5) до и через 1 мес. после введения МСК в ПМЖВ ЛКА.
а-пер фу зия ми о кар да до вве де ния МСК; б-че рез один ме сяц после введения МСК; в-исходные данные перфузии миокарда в % по сегментам левого желудочка; г-данные перфузии миокарда левого желудочка по сегментам в % через месяц после интракоронарного введения МСК. Стрелками указаны сегменты с приростом перфузии миокарда более чем на 5%.
в зону постинфарктного рубца. Результаты радиоизотопных исследований представлены на рис. 2 а и б.
Из рисунков видно, что, как при интрамуральном, так и при интракоронарном введении, МСК остаются в зоне введения.
Важно, что МСК после интракоронарного введения остались в бассейне введения, несмотря на то, что это был бассейн перенесенного инфаркта. Накопление препарата в задней стенке — миокарде, нормально перфузируемом правой коронарной артерией, не отмечено.
Всем больным в первые сутки после трансплантации МСК было выполнено Холтеровское монитори-рование ЭКГ с целью диагностики возможных нарушений ритма. Из восьми больных только у одного были зарегистрированы нарушения ритма: частая желудочковая экстрасистолия с двумя короткими пробежками желудочковой тахикардии. При повторном Холтеровском мониторировании ЭКГ нарушений ритма у этого больного не было выявлено.
Изменение перфузии и сократительной функции миокарда через 1 месяц после трансплантации МСК.
Через один месяц после трансплантации МСК было обследовано четыре пациента: трое после интракоронарного введения МСК (пациенты 1, 3, 4) и один больной — после интрамурального введения дифференцированных МСК в виде кардиомиоцито-подобных клеток (пациент 2) с длительным сроком культивации (55 суток), в зону постинфарктного кардиосклероза. Сводные данные изменения перфу-
46
-е-
фузию и сократительные свойства миокарда исследуемых больных.
На рис. 3 представлены сцинтиграммы больного ИКМП (пациент 3; см. табл. 1-5) после интракоронар-ного введения стволовых клеток в проксимальные отделы ПМЖВ ЛКА.
При количественной оценке статических перфу-зионных сцинтиграмм миокарда в 3 стандартных проекциях после введения МСК в проксимальные отделы ПМЖВ ЛКА отмечено увеличение перфузии базальных отделов и переднеперегородочной стенки — области введения стволовых клеток (рис. 3). При количественной оценке изменений общей перфузии миокарда всего левого желудочка сердца отмечено увеличение миокардиальной фракции сердечного выброса с 3,3% до 3,85%. При оценке перфузионных сцинтиграмм и в систолу, и в диастолу в левой передней косой проекции 45о установлено увеличение перфузии свободной стенки ПЖ, при оценке амплитудных изображений отмечен рост региональной кинематики свободной стенки ПЖ (рис. 4), что, по нашим данным, отражает у больных ИКМП снижение давления в легочной артерии и конечно-диастолического давления в левом желудочке [3].
Примечательно, что на ЭКГ, выполненных с интервалом 3 и 7 дней в срок через один месяц после трансплантации МСК у этого больного, в сравнении с исходной ЭКГ, не регистрируется полная блокада левой ножки пучка Гиса, что было также подтверждено и хол-теровским мониторированием ЭКГ.
Особый интерес для оценки влияния трансплантации МСК на миокард представляет больной З., 46 лет, история болезни № 108/2003, с диагнозом: ИБС, атеро-склеротический и постинфарктный кардиосклероз. Полная блокада левой ножки пучка Гиса. Безболевая ишемия. НК 2Б ст., ИКМП, (пациент 2; см. табл. 1-5),
Таблица 4
Изменения (Д) перфузии, размеров и сократительной функции миокарда ЛЖ через 1 месяц после трансплантации МСК (по результатам радиоизотопных исследований)
Пациенты ФВ ЛЖ % КДО ЛЖ мл Скорость наполнения (АУ/А^ Легкие/миокард МФСВ % Перф сегм. (п=30)
до 1 мес до 1 мес до 1 мес до 1 мес до 1 мес
1 33 34 246 182 402 335 ,62 ,54 2,3 1,75 0
+ 1 - 64 -67 -0,08 -0,55
2 31 40 318 295 270 350 ,63 ,59 1,5 1,88 +2
+9 -23 +80 -0,04 +0,38
3 13 12 346 347 551 835 ,64 ,63 3,3 3,85 +10
-1 +1 +224 -0,01 +0,55
4 63 62 122 110 445 481 ,47 ,40 2,3 1,66 +14
-1 -12 +36 -0,07 -0,64
Сред. знач. изменен. А + 2 % -24,5 мл +82 -0,05 -0,08 +6,5
Примечание: ФВ ЛЖ - фракция выброса левого желудочка, КДО - конечно-диастолический объем ; МФСВ - миокардиаль-ная фракция сердечного выброса. Шрифтом выделено значимое изменение показателя.
Систола
Диастола
\ ^ч \
Рис. 4. Синхринизированная с ЭКГ перфузионная сцинти-графия больного ИКМП (пациент 3; см. табл.1-5): а-до введения МСК; б-через месяц после интракоронарного введения МСК. Стрелками указана свободная стенка правого желудочка.
зии, размеров и сократительной функции миокарда представлены в табл. 4. Из таблицы видно, что количественные показатели исходного состояния перфузии и функции левого желудочка у обследованных нами больных свидетельствуют о различной тяжести клинического состояния и о возможности различной реакции этих больных на введенные МСК. Из таблицы видно также, что в ответ на введение МСК каждый больной отреагировал значимым положительным изменением нескольких анализируемых показателей: 1-й больной — изменением 2-х; 2-й — 5-и; 3-й — 2-х; 4-й — 3-х параметров. Положительная тенденция среднего прироста (А) в изменении таких показателей, как конечно-диастолический объем левого желудочка, скорость наполнения ЛЖ, соотношение перфузии легкие/миокард и количество перфузируемых сегментов, рассматривалось нами как знак положительного воздействия МСК на пер-
47
Российский кардиологический журнал № 5 (43) / 2003
которому МСК вводились интрамурально, в зону постинфарктного кардиосклероза. Этому больному, помимо трансплантации МСК, не выполнялось никаких других вмешательств, поэтому все изменения его клинического состояния, общей и локальной функции миокарда можно считать результатом трансплантации МСК.
До трансплантации МСК этот больной ИКМП находился на терапии, включающей в себя фуросемид в дозе 20 мг два раза в неделю, а также верошпирон, Р-блокаторы и ингибиторы АПФ. 24 января с помощью пункции гребня подвздошной кости у больного взят костный мозг в количестве 250 мл; 20 марта 2003 г., т.е. через 55 суток культивирования, МСК были интрамурально введены больному (протокол операции № 44). Через неделю после трансплантации МСК отмена фуросемида, под контролем давления в правом предсердии, не привела к появлению отеков, как это происходило в дооперационном периоде. По данным Эхо КГ уже через 10 дней после трансплантации МСК отмечалось увеличение ФИ ЛЖ с 30 до 40%. При количественной оценке статических перфузионных сцинти-грамм миокарда в 3 стандартных проекциях через 1 месяц после трансплантации МСК отмечено увеличение перфузии переднеперегородочной и заднебоковой стенок — области введения стволовых клеток. Также установлено увеличение миокардиальной фракции сердечного выброса с 1,5% до 1,88%. Вместе с тем, отмечая выраженное перераспределение перфузии на изображениях миокарда, увеличение количества нормально перфузируемых сегментов мы не отметили. При оценке перфузионных сцинтиграмм в левой боковой проекции и в систолу, и в диастолу показано увеличение перфузии в передне-перегородочной стенке.
При оценке перфузионных сцинтиграмм в левой косой проекции 450 показано увеличение перфузии боковой стенки ЛЖ и МЖП и в систолу, и в диастолу, при оценке амплитудных изображений отмечен рост региональной кинематики свободной стенки ЛЖ. Также отмечено значительное уменьшение размеров полости ЛЖ по длинной (с 8,5 см до 6,5 см) и короткой (с 6,0 до 4,5 см) осям, рис. 5.
На сцинтиграммах отчетливо видно уменьшение
Рис. 5. Изменение размеров ЛЖ и регионарной перфузии миокарда ЛЖ больного ИКМП (пациент 2; см. табл. 1-5): а-изображение меченных Таллием -201 МСК через 6,5 часов после интрамурального введения в область постинфарктного кардиослероза; б -амплитудное изображение миокарда ЛЖ до введения МСК; в -амплитудное изображение миокарда ЛЖ через 1 месяц после введения МСК. Стрелками указана зона улучшения локальной контрактильности левого желудочка, соответствующая области введения МСК.
размеров полости ЛЖ и увеличение перфузии ниж-нее-боковой стенки в области постинфарктного рубца.
22 апреля 2003г. больной З. выписан из клиники с улучшением состояния (см. табл. 4 и 5).
Изменение клинического состояния пациентов через один месяц после трансплантации МСК.
Оценка функционального состояния пациентов по классификации КУНА выявила тенденцию к снижению функционального класса СН у больных, перенесших трансплантацию стволовых клеток. Аналогичные результаты были получены при изучении индекса активности (индекса DASI) [20]. По данным объективного 6-минутного теста толерантность к физической нагрузке возрастала (увеличилось расстояние, проходимое пациентами за 6 минут), табл. 5.
Отмечено также значительное улучшение психологического состояния пациентов, особенно больных, находящихся в листе ожидания трансплантации сердца.
Обсуждение
Важным результатом данного исследования является констатация того факта, что МСК, введенные ин-тракоронарно, остаются в бассейне коронарной артерии, через которую осуществлялось их введение: вне
Таблица 5
Изменение показателей комплексной клинической оценки состояния больных через 1 месяц
после трансплантации МСК
Пациенты: 1 2 3 4 Среднее значение
Время исследования До 1 мес До 1 мес До 1 мес До 1 мес До 1 мес
ФК NYHA III-IV II-III III-IV II-III III-IV II-III II I-0 2,3 1,5
Индекс DASI 15,2 23,5 36,7 44,7 7,2 18,95 39,9 50,7 24,7 34,5
6-минутный тест 30м 425 400 450 200 300 500м Более 550м - -
Индекс MLHFQ 12 4 9 6 19 6 3 0 10,75 4
Примечание: индекс DASI - более высокие показатели соответствуют более высокой физической активности; индекс MLHFQ - более высокие показатели соответствуют менее высокому качеству жизни.
48
этой зоны очагового накопления индикатора не было обнаружено, а бассейн накопления клеток соответствовал области перенесенного инфаркта миокарда.
Для всех 4-х больных, наблюдавшихся нами в течение 1 месяца после трансплантации МСК, установлена положительная тенденция изменения показателей клинического состояния, как обьективных, так и субъективных (табл. 5).
При сцинтиграфических исследованиях уже через 3 недели у всех больных было отмечено увеличение перфузии регионов периинфарктной зоны миокарда. Кроме этого, нами было отмечено восстановление региональной кинетики в этих зонах, а также перфузии и функции свободной стенки правого желудочка. Однако, полученные результаты не были в одинаковой степени выраженными у разных больных (табл. 1-5).
Во-первых, отчетливый рост фракции выброса ЛЖ был отмечен нами лишь у одного пациента (пациент 2; см. табл. 1-5), которому была выполнена трансплантация дифференцированных МСК (срок культивации — 55 суток) аутологичного костного мозга интрамураль-но, в зону постинфарктного кардиосклероза. Уменьшение размеров полости ЛЖ было отмечено у 3 из 4 пациентов; увеличение скорости наполнения ЛЖ- у двух больных; снижение соотношения перфузии легкие/миокард — у 4-х больных. Важно подчеркнуть, что этот показатель уже давно используется радиологами, работающими в области ядерной кардиологии, для прогноза левожелудочковой недостаточности, особенно при ишемической болезни сердца. Снижение пер-фузионного соотношения легкие/миокард в первую очередь свидетельствует об увеличении емкости коронарного русла, по сравнению с объемом сосудистого русла легких, и поэтому снижение этого показателя у больных после введения МСК мы рассматриваем как знак положительного воздействия МСК на миокард.
Другой показатель общей перфузии сердца — количество экстрагированного миокардом перфузионного индикатора в % от введенной дозы — миокардиальная фракция сердечного выброса (МФСВ) используется реже, однако мы обладаем значительным опытом его использования. Увеличение МФСВ после введения стволовых клеток показывает, насколько увеличилась емкость коронарного русла по отношению ко всему сердечному выбросу. Этот показатель значимо возрос у пациентов 2 и 3, тогда как у больных 1 и 4 он значительно снизился.
Известно, что локальные нарушения перфузии и функции миокарда являются наиболее типичными проявлениями ишемической болезни сердца. Однако, эти нарушения гетерогенны, а методы их оценки построены на сравнении зон с максимальной и минимальной величиной изучаемого показателя. В нашем исследовании значимое увеличение перфузии сегментов миокарда ЛЖ (визуально мы отметили рост региональной
перфузии у всех 4 больных) мы отметили только у 2 больных (пациенты 3 и 4, см. табл. 1-5), которым вводили МСК после короткого срока культивации, т.е. вводили смешанную культуру клеток миэлоидного и стромального рядов. У двух других пациентов, которым вводили преддифференцированные МСК в виде кар-диомиоцитоподобных клеток (пациенты 1 и 2, см. табл. 1-5), значимых изменений региональной перфузии мы не отметили. Мы полагаем, что улучшение коронарной перфузии миокарда у больных ИМКП после интракоронарного введения МСК может быть связано со стимуляцией ангиогенеза, следствием которой явилось увеличение региональной кинематики свободной стенки ПЖ и улучшение диастолических показателей левого желудочка — таких, как максимальная скорость наполнения ЛЖ, КДО ЛЖ, и КДД ЛЖ [3].
Значительное повышение ФИ ЛЖ с отчетливым локальным улучшением контрактильности миокарда в области постинфарктного кардиосклероза после интрамурального введения МСК в эту область (пациент 2, см. табл. 1-5) вселяет надежду на успех лечения больных ИКМП путем сочетания интрамурального введения МСК с хирургической реваскуляризацией миокарда, а также в комбинации с другими методами хирургического лечения ХСН [12, 15, 18].
Полученные результаты позволяют предложить трансплантацию аутологичных МСК костного мозга как биологический мост к трансплантации сердца — например, у больных, включенных в лист ожидания ТС. Говорить о влиянии трансплантации МСК на апоп-тоз кардиомиоцитов человека на основании полученных результатов пока рано, но хочется верить, что ближайшие исследования прольют свет и на этот аспект влияния МСК на течение и прогноз ХСН.
Безусловно, изложенные в настоящей статье результаты можно назвать пока предварительными, они требуют обсуждения, дальнейшего накопления и изучения, но они вселяют оптимизм и поэтому исследование влияния трансплантированных МСК на функцию сердца у больных ХСН должно быть продолжено. Вместе с тем, несмотря на небольшой объем тщательно выполненных наблюдений, они соответствуют "пилотному" характеру исследовательских работ, назначение которых — указать на новые перспективные направления в терапии ИБС.
Заключение
Трансплантация МСК является безопасным и эффективным методом лечения и может использоваться как вспомогательный метод лечения, например, у больных, ожидающих трансплантацию сердца, и/или как подготовка больного с ХСН к реконструктивной операции на собственном сердце, а также как способ замещения постинфарктного фиброзного поля жизнеспособными кардиомиоцитоподобными клетками.
49
Российский кардиологический журнал № 5 (43) / 2003
Не менее перспективным является направление ин-тракоронарного введения МСК в сочетании с ангиопластикой инфаркт-зависимой артерии в первые часы после развития острого инфаркта миокарда для ограничения зоны инфаркта, апоптотического повреждения миокарда и последующего замещения погибших кардиомиоцитов [15].
Поскольку стволовые клетки костного мозга могут быть получены в достаточном количестве путем по-
Литература
1. Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е. и др. Костный мозг как источник получения мезенхимальных клеток для восстановительной терапии поврежденных органов// Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2002, 4, 3-6.
2. Потапов И.В., Башкина Л.В., Зайденов В.А., и др. Влияние пересадки эмбриональных кардиомиоцитов и мезенхимальных клеток костного мозга на сократительную функцию сердца при экспериментальном инфаркте миокарда// Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2002, 3, стр.88-89.
3. Остроумов Е.Н., Ермоленко А.Е., Гуреев С.В., и др. Фракция выброса правого желудочка как показатель эффективности реваскуляризации миокарда у больных ишемической болезнью сердца с застойной недостаточностью кровообращения// Кардиология 1996; 4: 57-61.
4. Гендлин Г.Е., Самсонова Е.В., Бухало О.В. Методики исследования качества жизни у больных хронической сердечной недостаточностью// Сердечная недостаточность, Том 1, 2, 2000.
5. Shmji Tomita, Ren-Ke Li; Richard D. et al. Autologous Transplantation of Bone Marrow Cells Improves Damaged Heart Function// Circulation, November, 9, 1999: 856-861.
6. Kocher AA, Schuster, Szabolcs MJ, et al. Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function// Nat. Med. 2001;7:430-436.
7. Hiroshi Kamihata, Hiroaki Matsubara, Takashi Nishiue et al. Implantation of Bone Marrow Mononuclear Cells Into Ischemic Myocardium Enhances Collateral Perfusion and Regional Function via Side Supply of Angioblasts, Angiogenic Ligands, and Cytokines// Circulation. 2001;104:1046-1052.
8. Jih-ShiuanWang, Dominique Shum-Tim, Jacques Galipeau et al. Marrow stromal cells for cellular cardiomyoplasty: Feasibility and potential clinical advantages: //J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 2000;120:999-1006.
9. Ohno N, Fedak PW, Weisel RD et al. Cell transplantation in non-ischemic dilated cardiomyopathy. A novel biological approach for ventricular restoration// Jpn. J. Thorac. Cardiovasc. Surg, 2002 Nov;50(11):457-60.
вторной аспирации костного мозга, а их количество возможно увеличивать in vitro и при этом не требуется иммуносупрессии после их трансплантации, данный подход к лечению хронической сердечной недостаточности имеет большие перспективы для клинического использования. Но, несмотря на то, что трансплантация МСК сулит большие обещания, ее будущее целиком зависит от проведения надежно контролируемых, рандомизированных клинических исследований.
10. Jih-Shiuan Wang, Dominique Shum-Tim, Edgar Chedrawy et al. The coro-nary delivery of marrow stromal cells for myocardial regeneration: Pathophysiologic and therapeutic implications// J. Thorac. Cardiovas. Surg., 2001;122:699-705
11. Shinji Tomita, Donald A. G. Mickle, Richard D. Weisel et al. Improved heart function with myogenesis and angiogenesis after autologous porcine bone marrow stromal cell transplantation// J. Thorac. Cardiovasc. Surgery, June 2002; Volume 123, Number 6.
12. Yutaka Sakakibara; Keiichi Tambara; Fanglin Lu et al. Combined Procedure of Surgical Repair and Cell Transplantation for Left Ventricular Aneurysm: An Experimental Study// Circulation, 2002; 106:I-193.
13. Mark A.Robbins :Management of end-stage heart failure, Eric A. Rose (editor), 1998 ISBN 0-316-75697-0, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, USA.
14. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC et al. Multilineage potential of adult human mesenchimal stem cells// Science, 1999; 284:143-147.
15. Strauer BE, Brehm M, Zeus T, Kostering M et al. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans// Nat. Med., 2001 Apr; 7(4):430-6.
16. Kocher AA, Schuster, Szabolcs MJ, et al. Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function// Nat. Med. 2001 Apr; 7 (4): 412-3.
17. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S., Jakoniuk I., et al. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium// Nature, 2001, 410, 701 -705.
18. Menasche P, Hagege A, Scorsin M, et al.: Myoblast transplantation for heart failure// Lancet, 2001, 357: 279-280.
19. Rector TS, Tschumperlin LK, Kubo SH, et al. Use of the Living With Heart Failure questionnaire to ascertain patients' perspectives on improvement in quality of life versus risk of drug-induced death// J. Card. Fail., 1995,Jun;1(3):201-6.
20. Hlatky MA, Boineau RE, Higginbotham MB et al. A brief self-administered questionnaire to determine functional capacity (the Duke Activity Status Index) // Am. J. Cardiol., 1989 Sep 15;64(10):651-4.
Abstract
The previouse experimental studies revealed that mezenchimal bone marrow stem cells (MSC) have the ability of differentiating into cardiomiocytes in vitro and in vivo inducting angiogenesis and restoring the impared myocardial function. At that, the cell technology capacities in clinical cardiology remain unstudied.
Starting from January 2003 8patients suffering from heart failure underwent the transplantation of autological MSC with different stages of cultivation: MSC was administered intracoronary to 6 and intramuraly to the post-infarction cardiosclerosis zone.
In three cases the MSC were marked with thallium-201directly before transplantation in order to define the location of MSC during the hours after transplantation. The results of radionuclide scintigraphy demonstrated that in 1,5 hours after intracoronary administration and in 6,5 hours after intramyocardial injection MSC remain in the zone of administration. In 1 month after the transplantation the improvement of regional perfusion and diastolic function was observed in old patients. Significant growth offunctional ischemia of the left ventricle from 31 to 40% was observed in patient suffering from ИКМП after intramural administration of MSC. In 1 month after MSC transplantation quality of life and phisical stress tolerance improvement was observed. Intracoronary administered MSC remain in coronary artery, through which MSC was administered. Intracoronary and intramural administration of MSC improves functional indices of retractive myocardial function, increases physical stress tolerance and life quality of patients suffering from chronic heart failure.
Keywords: cell transplantation, mezenchimal stem cells, autologic bone marrow, rehabilitation of myocardial function.
Поступила 08/05-2003
50
