CC BY
5
ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
УДК 577.355
Первичные процессы фотосинтеза Thalassiosira weissflogii при воздействии ципрофлоксацина
Д.А. Тодоренко1*©, Н.Д. Сидоченко2©, А .А. Байжуманов1©, Л.Б. Братковская3©, Д.Н. Маторин1©
Кафедра биофизики, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова,
Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12;
2Российский университет дружбы народов, Россия, 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6;
3Кафедра общей экологии и гидробиологии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12 'e-mail: [email protected]
Фторхинолоновые антибиотики, такие как ципрофлоксацин, активно использовались в медицинской практике, в том числе в пандемию COVID-19, для подавления побочных бактериальных инфекций. Широкое применение и неправильная утилизация приводят к появлению антибиотиков в окружающей среде, что может оказывать воздействие на природные водные организмы, включая фитопланктон. Воздействие фторхинолоновых антибиотиков на процессы фотосинтеза диатомовых микроводорослей, которые являются основными продуцентами в морских экосистемах, мало изучено. В работе исследовано воздействие антибиотика ципрофлоксацина на первичные процессы фотосинтеза морской диатомовой микроводоросли Thalassiosira weissflogii. Показано, что ципрофлоксацин воздействует на работу фотосистемы II (ФС11), препятствуя передаче поглощенной энергии от возбужденных молекул хлорофилла антенны к реакционному центру (РЦ) ФСП (^Do). При воздействии ципрофлоксацина выявлено снижение эффективности донирования электрона к Р680+ (FV / FO), ингибирование квантового выхода ФСП (FV/ FM), снижение доли активных РЦ (ABS / RC) и увеличение диссипации поглощенной энергии на РЦ (DIo / RC). Показано, что механизм действия ципрофлоксацина связан с повреждением РЦ ФСП. Ципрофлоксацин усиливает светочувствительность микроводорослей и вызывает увеличение количества продуктов перекисного окисления липидов. Предлагается использование параметров флуоресценции хлорофилла для анализа воздействия антибиотиков на микроводоросли.
Ключевые слова: морские диатомовые микроводоросли, кривые OJIP, фторхинолоновые антибиотики, фотосистема II, флуоресценция хлорофилла, фотоингибирование
DOI: 10.55959/MSU0137-0952-16-78-3-6
Введение
Фармацевтические препараты, включая антибиотики, являются опасными микрозагрязнителями окружающей среды из-за медленной деградации, повышенной персистентности и биотоксичности [1, 2]. Широкое использование антибиотиков в здравоохранении, сельском хозяйстве, птицеводстве и аквакультуре, а также неправильная утилизация привели к повсеместному их распространению в окружающей среде. Антибиотики лишь частично удаляются в ходе очистки сточных вод на очистных сооружениях и впоследствии попадают в поверхностные воды [3]. Антибиотики обычно обнаруживаются в концентрациях от нг/л до мкг/л в поверхностных, подземных и морских
водах [4—6], а в некоторых случаях даже на уровне мг/л [7]. В водной среде антибиотики могут быть токсичны для разных организмов, вызывая неблагоприятные последствия для водных экосистем в целом [8].
Фотосинтезирующие организмы являются основой пищевой цепи в водных экосистемах, и любые изменения в их жизнеспособности могут привести к серьезным последствиям на более высоких трофических уровнях. Несмотря на то, что целевым организмом, на который направлено действие антибиотиков, являются бактерии, антибиотики могут оказывать неблагоприятное воздействие и на эукариотические микроводоросли — в частности, на такие органеллы, как ми-
© Тодоренко Д.А., Сидоченко Н.Д., Байжуманов А.А., Братковская Л.Б., Маторин Д.Н., 2023
тохондрии и хлоропласты, имеющие собственный геном [9].
Одним из наиболее активно используемых антибиотиков широкого спектра действия в медицине и ветеринарии является ципрофлоксацин (ЦФ), относящийся к группе фторхинолонов. Фторхинолоновые антибиотики широко использовались в пандемию СОУТО-19 для подавления побочных бактериальных инфекций [10]. ЦФ эффективен в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий за счет нарушения синтеза бактериальной ДНК путем ингибиро-вания лигазной активности ферментов: топоизо-меразы II (ДНК-гиразы) и ДНК-топоизомеразы IV. ЦФ является распространенным загрязнителем окружающей среды [1]. Известно, что фторхино-ловые антибиотики устойчивы к биодеградации, поэтому остатки фторхинолонов и их производных обнаруживаются в природных водоемах. Мировая медиана концентрации ЦФ в пресноводных экосистемах составляет 0,164 мг/л, а его максимальная обнаруженная концентрация — 6,5 мг/л [11]. Фторхинолоны могут оказывать токсическое воздействие на микроводоросли, что может приводить к нарушению их жизненных процессов [12—14]. Имеющиеся данные о токсичности ЦФ для микроводорослей в основном выполнены на зеленых пресноводных микроводорослях, тогда как мало данных о воздействии ЦФ на морские диатомовые микроводоросли, которые являются основой фотосинтетической продукции морских экосистем. В настоящей работе исследовано воздействие ЦФ в разных концентрациях на первичные процессы фотосинтеза, связанные с поглощением квантов света, преобразованием поглощенной энергии в реакционных центрах (РЦ) и фотосинтетическим электронным транспортом, у диатомовой микроводоросли ТНааяяю-sira weissflogii (Огайо-—) О.А. БгухеП & ИаБ1е 1977 с помощью снятия световых и индукционных кривых флуоресценции хлорофилла.
Материалы и методы
Объектом исследования служила чистая культура морской одноклеточной диатомовой микроводоросли Т. weissflogii из коллекции кафедры общей экологии и гидробиологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.
Культуру выращивали на питательной среде Г/2, приготовленной на искусственной морской воде с концентрацией соли 17 г/л. Микроводоросли культивировали в колбе Эрленмейера объемом 100 мл при непрерывном освещении с плотностью потока квантов 50 мкмоль фотонов/м2 • с при температуре 23 ± 1°С и постоянном перемешивании (120 об./мин) в течение 4 сут; плотность клеток достигала ~4,7 х 105 кл/мл.
В качестве токсиканта использовали антибиотик ЦФ (98% активного вещества) (Келун-Каз-
фарм, Казахстан) в форме водного раствора, который добавляли в концентрациях от 5 до 50 мг/л в свежую среду с микроводорослями. Начальная концентрация клеток микроводорослей в эксперименте составила 5 • 104 кл/мл. Микроводоросли с антибиотиком в разных концентрациях экспонировали в течение 3 сут в тех же условиях, что и при выращивании маточной культуры микроводорослей. Количество клеток оценивали путем прямого счета в камере Горяева и измерения оптической плотности (Б677нм — Б730нм, L = 1 см) с помощью спектрофотометра, созданного на кафедре биофизики с использованием портативного спектрометра USB 2000 (Ocean Optics Inc., США).
Кинетические кривые флуоресценции хлорофилла (OJIP) регистрировали с помощью флуориме-тра Aquapen-C 100 (Photon System Instruments, Чехия). Флуоресценцию индуцировали синим светом с длиной волны 455 нм в течение 2 с при плотности потока квантов 3000 мкмоль фотонов / м2 • с. Перед регистрацией образцы адаптировали к темноте. Кривые OJIP анализировали с помощью JIP-теста в соответствии с опубликованной ранее работой [15], где представлены расчет параметров флуоресценции и их описание.
Быстрые световые кривые регистрировали на флуориметре Water-PAM (Walz, Германия) с им-пульсно-амплитудной модуляцией при последовательном увеличении интенсивности действующего света (0—1400 мкмоль фотонов/м2 • с); продолжительность каждого из световых сеансов действующего света составляла 20 с. На каждом уровне освещенности квантовая эффективность ФСП (^ФСП = (FM' - Ft) / FM') регистрировалась при световом импульсе 3000 мкмоль/м2 • с в течение 0,8 с. Ft представляет собой текущий выход флуоресценции на свету, измеренный с помощью модулирующего света (<1 мкмоль фотонов/м2 • с) непосредственно перед импульсом насыщения. Относительную скорость линейного электронного транспорта (electron transport rate, далее ETR) рассчитывали как ETR = ^ФСП х интенсивность света х 0,5. Из световой кривой ETR рассчитывали следующие параметры: коэффициент максимальной утилизации световой энергии (угол наклона световой кривой — а) и максимальную относительную скорость электронов по электронотранспортной цепи (ETRmax). Обозначения и описание параметров флуоресценции представлены в соответствии с общепринятой номенклатурой [16].
Перекисное окисление липидов (ПОЛ) в клетках мироводорослей оценивали путем измерения содержания продуктов взаимодействия конечных продуктов ПОЛ с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) — ТБК-активные продукты — согласно описанной ранее методике [17] с небольшими модификациями. К 200 мкл суспензии клеток водоросли добавляли 1 мл раствора 0,25%-ной ТБК в 10%-ной трихлоруксусной кислоте. Полученные
Таблица
Параметры флуоресценции диатомовой микроводоросли Т. weissflogii на 3 сут инкубации с антибиотиком ЦФ в разной концентрации
Параметры флуоресценции Контроль 5 мг/л 10 мг/л 25 мг/л 50 мг/л
Vj 0,44 ± 0,002 0,48 ± 0,007* 0,52 ± 0,005* 0,49 ± 0,016* 0,41 ± 0,031
fv / fm 0,7 ± 0,001 0,65 ± 0,004* 0,41 ± 0,002* 0,25 ± 0,004* 0,14 ± 0,006*
Fv/Fo 2,37 ± 0,01 1,84 ± 0,03* 0,71 ± 0,004* 0,32 ± 0,01* 0,17 ± 0,01*
veo 0,56 ± 0,002 0,52 ± 0,007* 0,48 ± 0,005* 0,51 ± 0,016* 0,59 ± 0,031
<pdo (= fo / fm) 0,3 ± 0,001 0,35 ± 0,004* 0,59 ± 0,002* 0,76 ± 0,004* 0,86 ± 0,006*
PIabs 0,93 ± 0,003 0,54 ± 0,031* 0,1 ± 0,003* 0,03 ± 0,003* 0,01 ± 0,003*
ABS/RC 3,18 ± 0,02 3,69 ± 0,1 6,55 ± 0,08* 11,86 ± 0,5* 21,2 ± 1,94*
DIo / RC 0,94 ± 0,01 1,3 ± 0,04 3,83 ± 0,04* 8,96 ± 0,42* 18,17 ± 1,78*
Площадь над кривой OJIP (Area) 326588 ± 5413 257194 ± 15806* 367795 ± 11967* 211231 ± 13344* 195675 ± 22077*
Доля КВК (OEC fraction) 1 0,90 0,64 0,46 0,32
ETR 158 ± 5 135 ± 6* 100 ± 1* 39 ± 6* 26 ± 0,4*
a 0,23 ± 0,004 0,19 ± 0,012* 0,15 ± 0,001* 0,06 ± 0,01* 0,04 ± 0,001*
Примечание: * — статически значимые отличия от контроля (p < 0,05)
пробы инкубировали в течение 30 мин при температуре 95°С на водяной бане, после чего пробирки охлаждали 5 мин при температуре 0°С. Затем пробы центрифугировали в течение 15 мин при 8000 об./мин. Поглощение света регистрировали при 532 и 600 нм. Концентрацию ТБК-активных продуктов рассчитывали с учетом коэффициента молярной экстинкции 156 мМ-1см-1.
Для анализа и обработки полученных данных использовали пакеты программ Origin (OriginLab Corp., США) и Statistica v.10 (StatSoft, Inc., США). Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA (апостериорный тест Даннетта). Значения p < 0,05 считались статистически значимыми. В таблице представлены значения среднего (M) и стандартные отклонения (± SD). Для каждого исследуемого параметра выполнено три повтора, кроме эксперимента по фо-тоингибированию, где измерения проводились в одной повторности из-за особенностей самого эксперимента.
Результаты и обсуждение
Культуру T. weissflogii инкубировали в течение 3 сут без ЦФ и в присутствии антибиотика в различных концентрациях — 5, 10, 25 и 50 мг/л. В контроле концентрация клеток увеличивалась с 5 • 104 кл/мл до ~2,8 • 105 кл/мл. Количество клеток T. weissflogii несколько увеличивалось в присутствии ЦФ в низких концентрациях на 8 и 22 % при 5 и 10 мг/л соответственно (рис. 1). Стимулирование скорости роста микроводорослей в присутствии антибиотиков в низких концентрациях отмечалось ранее в литературе [18, 19]. При воздействии ЦФ в концентрациях 25 и 50 мг/л наблюдали уменьшение концентрации клеток на 17 и 39 % соответственно (рис. 1). Наши результаты
согласуются с более ранними работами на зеленых пресноводных водорослях, в которых показано снижение скорости роста при кратковременном воздействии ЦФ в высоких концентрациях [14].
Для оценки воздействия ЦФ на фотосинтетическую активность и электронотранспортные процессы T weissflogii регистрировали кривые ОЛР и световые кривые флуоресценции хлорофилла. На рис. 2 представлены световые кривые ^ФСц и БТЯ T weissflogii после 3-суточной инкубации с ЦФ. Параметр ^фСп характеризует долю поглощенной энергии, которая используется в фотохимических реакциях в ФС11 и коррелирует с квантовой эффективностью фиксации СО2 в отсутствие фотодыхания и реакции Мел ера [20]. В адаптированном к темноте объекте значение ^ФСц равно величине Ру / Бм, которая является потенциальным квантовым выходом ФС11. Начальное значение ^ФСц при 0 мкмоль фотонов/м2 • с (= Бу/Бм) в контроле
Рис. 1. Количество клеток T. weissflogii на 3 сут инкубации с ципрофлоксацином в разной концентрации
составило 0,71 ± 0,003, что свидетельствует о достаточно высокой фотосинтетической активности клеток Т. weissflogii (рис. 2А). В присутствии ЦФ происходило значительное (р < 0,05) снижение Ру/ РМ. Значения данного параметра при воздействии 5, 10, 25 и 50 мг/л ЦФ составили 0,64 ± 0,01, 0,44 ± 0,002, 0,21 ± 0,02 и 0,16 ± 0,003 соответственно. По мере увеличения интенсивности действующего света происходило уменьшение фФС11 как в контроле, так и при воздействии ЦФ, связанное с увеличением тепловой диссипации избыточной световой энергии, когда энергия не используется в реакциях фотосинтеза. На основании параметра фФС11 можно рассчитать относительную скорость БТЯ при умножении интенсивности освещения на фФС11. Кривая зависимости БТЯ от интенсивности освещения имеет классическую форму кривой Р-1 (фотосинтез-освещенность) с линейным светолимитированным участком, а также участком, где кривая выходит на плато, когда достигается световое насыщение БТЯ. Дальнейшее увеличение интенсивности света не влияет на скорость фотосинтеза и может даже приводить к ее уменьшению (участок динамического фотоин-гибирования). На рис. 2Б представлены кривые БТЯ водорослей Т. weissflogii в контроле и при воздействии ЦФ. В присутствии ЦФ происходило уменьшение интенсивности БТЯ по сравнению с контролем. Из световой кривой БТЯ рассчитывали параметры, представленные в таблице. При воздействии ЦФ выявлено уменьшение максимальной скорости линейного электронного транспорта (БТЯтах) и уменьшение угла наклона линейного участка световой кривой БТЯ (а), что свидетельствует о снижении утилизации поглощенной энергии в процессе фотосинтеза.
Для того чтобы оценить воздействие ЦФ на определенные участки фотосинтетической электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) Т. weissflogii, мы регистрировали кривые ОЛР и анализировали их с помощью ЛР-теста. На рис. 3 представлены кривые ОЛР Т. weissflogii после 3-суточной инкубации с ЦФ. В кинетике индукции флуоресценции культуры Т. weissflogii в ответ на свет высокой интенсивности наблюдалось несколько фаз, известных как переходы О.-1-Р [15]. Начальный уровень фазы О при 50 мкс соответствует интенсивности флуоресценции хлорофилла при «открытых» РЦ ФС11 (БО), когда все ОА окислены. Фаза О. обусловлена светоиндуцированным восстановлением ОА, тогда как следующие фазы отражают, главным образом, дальнейшее накопление восстановленного ОА в результате восстановления акцепторов Ов и пула пластохинонов (РО). Во время фазы 1-Р происходит полное восстановление РО-пула, что приводит к «закрытию» (восстановлению) РЦ ФС11 (БМ). Как видно из представленного рисунка, кривые ОЛР Т. weissflogii при воздействии ЦФ претерпевали значительные изменения. При воздействии минимальной концентрации ЦФ 5 мг/л происходило уменьшение фазы 1-1-Р, связанное с нарушением электронного транспорта от ОА в РО-пул [21]. По мере увеличения концентрации антибиотика отмечалось увеличение уровня О (БО) и снижение уровней I, I и Р (БМ). Существенное увеличение О при воздействии ЦФ может быть обусловлено возрастанием эмиссии флуоресценции хлорофилла в антенных комплексах за счет нарушения миграции энергии к РЦ, либо частичным восстановлением пула РО в темноте, а снижение Р указывает на накопление неактивных РЦ ФС11. В присутствии ЦФ выявлено
О 200 400 600 800 1000 1200 1400 Интенсивность света, мкмоль фотонов/м2-с
О 200 400 600 800 1000 1200 1400 Интенсивность света, мкмоль фотонов/м2 с
Рис. 2. Световые кривые эффективного квантового выхода ФС11 (фФС11) (А) и относительного линейного электронного транспорта (БТК) (Б) Т. weissflogii на 3 сут инкубации с ципрофлоксацином в разной концентрации
снижение площади над индукционном кривои OJIP (параметр Area), характеризующее уменьшение размера пула электронных акцепторов до полного восстановления QA на акцепторной стороне ФС11 (таблица). В значительной степени кривые OJIP изменялись при воздействии ЦФ в максимальной концентрации 50 мг/л, при которой пики J, I, P на кривой практически отсутствовали, а уровень O возрастал.
Известно, что фторхинолоновые антибиотики снижают скорость выделения O2 фотосинтезирую-щими клетками [22]. Активность работы кислород-выделяющего комплекса (КВК) мы оценивали по изменению выхода флуоресценции в районе 300 мкс (пик К) по формуле Vk = (F300 мкс - fo) / Fy. У растений, подверженных высоким температурам и другим видам стресса, наблюдается пик К между O и J, связанный с электронным дисбалансом на акцепторной и донорной сторонах ФС11, при котором увеличивается отток электронов от P680 к акцепторам ФС11 и снижается приток электронов с донорной стороны ФС11 к P680+ [23]. Используя эту информацию, можно рассчитать долю КВК (OEC fraction) через
i-Vk
ЦФ
1-Vk
V,
контроль
В присутствии ЦФ у микроводорослей обнаружено уменьшение доли КВК (таблица) при воздействии ЦФ относительно контроля, что указывает на повреждающее действие ЦФ на КВК. Отношение Ру / РО отражает эффективность донирования электрона к Р680+ и фотосинтетическую конверсию в РЦ ФС11 [24]. При воздействии ЦФ выявлено (р < 0,05) уменьшение Ру/РО из-за снижения оттока электронов с донорной стороны в результате повреждения комплексов ФС11 (таблица).
100000
(С
ш et
=Г ф
® 5
0 >■ >>
с; ■в- g
£ i
8 ■!■
1 о m о.
80000
60000
40000
О
с;
х
20000
— Контроль
—•— 5 мг/л
—•—10 мг/л л
"—•—25 мг/л
—•— 50 мг/л
I Р
■ I // \\
о ¿г
0,01
0.1
100
1000
1 10 Время, мс
Рис. 3. Кинетические кривые флуоресценции хлорофилла (ОЛР) T. weissflogii на 3 сутки инкубации с ципрофлоксацином в разной концентрации
Известно, что амплитуда фазы O-J в бесстрессовых условиях отражает количество восстановленных («закрытых») РЦ по отношению к общему числу РЦ, которые могут быть восстановлены («закрыты») [25]. Значительный рост амплитуды фазы O-J (рост параметра VJ) отражает увеличение общего числа «закрытых» РЦ, неспособных к реокислению QA- и восстановлению вторичного хинонового акцептора QB. Доказательством является действие ингибитора электронного транспорта диурона, который конкурирует со вторичным хиноном QB за место связывания на белке D1 [15, 16]. Это приводит к нарушению электронного транспорта между QA и QB, и восстановлению кривых OJIP в точке J (увеличению VJ). Результаты нашего исследования показали, что ЦФ не вызывает существенного накопления восстановленных РЦ, вследствие чего электронный транспорт за пределы QA (^eq) также существенно не снижается (таблица). Отсутствие значительного воздействия ЦФ на акцепторную сторону ФС11 обусловлено тем, что ЦФ не проявляет сильной конкуренции с QB за связывание на Dl-белке в ФС11 в отличие от другого антибактериального препарата — налидик-совой кислоты [26]. При воздействии ЦФ квантовая эффективность ФС11 (FV / FM) снижалась в результате накопления поврежденных комплексов ФС11, неспособных к фотохимическому преобразованию поглощенной энергии. Снижение доли активных РЦ проявлялось в увеличении отношения размера антенны на РЦ (ABS / RC), отражающего увеличение поглощенной энергии на РЦ. Поскольку неактивные РЦ не способны к фотохимическому разделению заряда, то увеличение скорости диссипации энергии захваченных антенной фотонов вызывает увеличение параметра рассеяния поглощенной энергии на РЦ (DIo / RC). В связи со снижением доли активных РЦ в присутствии ЦФ также наблюдали увеличение квантовой эффективности диссипации поглощенной энергии (^Do) в результате нарушения миграции энергии от антенных комплексов к неактивным РЦ. Наши результаты согласуются с данными ранее опубликованной работы [26], авторы которой показали in vitro на тилакоидах шпината, что ЦФ препятствует передаче энергии от возбужденных молекул хлорофилла антенны к РЦ ФС11 и, тем самым, снижает вероятность разделения зарядов в РЦ. Параметр PIABS отражает функциональное состояние ФС11 и является интегральным параметром, включающим в себя произведение таких параметров как ABS/RC, FV/ FM и ^Eo [15]. При воздействии ЦФ выявлено существенное снижение PIABS, отражающее снижение функционального состояния ФС11 — главным образом, в результате уменьшения доли активных РЦ (увеличение ABS / RC) и снижения FV / FM.
Некоторые антибиотики, такие как хлорам-феникол, линкомицин и левомицетин, способны блокировать цикл репарации ФС11 после фотоин-гибирования, останавливая синтез Б1-белка в хлоропласте [27]. Белок Б1 является одним из ключевых белков ФС11, формирующим основу РЦ ФС11 вместе с Б2-белком, на которых расположены переносчики электронов. Поскольку процесс фотоингибирования, т.е. снижения фотосинтетической активности под воздействием избыточного света, во многом связан со снижением активности ФС11, то наиболее подходящими методами для оценки степени фотоингибирования являются регистрация скорости выделения О2 клетками и параметра Бу/ Бм [28]. В условиях повреждения РЦ ФС11 величина Бу/Рм линейно коррелирует со скоростью выделения О2 [29], а снижение Бу/ Бм связано со степенью деградации белка Б1 [30]. Для того чтобы оценить воздействие ЦФ на репарацию Б1-белка T weissflogii после фотоингибирования, мы инкубировали пробы с ЦФ и без него (контроль) в течение 0,5 ч на слабом свету (8 мкмоль фотонов/м2-с), затем освещали образцы светом высокой интенсивности (2000 мкмоль фотонов / м2 • с) в течение 0,5 ч, после чего экспонировали образцы при 8 мкмоль фотонов/м2 • с в течение 24 ч. На рис. 4 представлено изменение параметра / Бм T. weissflogii в контроле и в присутствии ЦФ и хлорамфеникола. Как видно из рисунка, после применения света высокой интенсивности происходило снижение Бу/ Бм с 0,67 до 0,25 в контроле (свет), и с 0,66 до 0,2 в присутствии ЦФ (свет) и хлорамфеникола (свет). В пробах контроля (темнота) и ЦФ (темнота), не подвергшихся световому стрессу, величина параметра Ру / Рм не менялась в течение 24 ч инкубации. После светового воздействия пробы с контролем и антибиотиками оставляли восстанавливаться на слабом свету, регистрируя Бу/ Бм через 0,5, 1, 3 и 24 ч после фотоингибирования. В присутствии ЦФ активность ФС11 восстанавливалась до практически начальных значений, зарегистрированных до фотоингибирования, хотя и с некоторой задержкой по сравнению с контролем. Таким образом, показано, что ЦФ не влияет на репарацию Б1-белка T weissflogii после фотоингибирования в отличие от хлорамфеникола.
Различные токсиканты способны вызывать окислительный стресс в клетках микроводорослей, стимулируя образование активных форм кислорода [31]. Они инициируют ПОЛ, которое является индикатором повреждения клеточных мембран. В результате ПОЛ образуются конечные метаболиты, такие как малоновый диальдегид, реагирующие с ТБК, известные как ТБК-активные продукты. На рис. 5 представлено содержание ТБК-активных продуктов T weissflogii в контроле и в присутствии ЦФ. Как видно из представленного рисунка, ЦФ в концентрации до 50 мг/л не
оказывал статистически значимого воздействия на содержание ТБК-активных продуктов, тогда как в концентрации 50 мг/л вызывал увеличение количества ТБК-активных продуктов по сравнению с контролем. Наши результаты согласуются с данными, полученными на зеленных микроводорослях, для которых показали увеличение продуктов ПОЛ при воздействии ЦФ [12, 13]. Увеличение количества ТБК-активных продуктов при воздействии ЦФ в высоких концентрациях свидетельствует о том, что данный антибиотик индуцирует окислительный стресс у T weissflogii, вызывая структурные и функциональные повреждения фотосинтетического аппарата.
3 22 Время, ч
Рис. 4. Изменение параметра FV / FM культуры микроводоросли T. weissflogii в контроле и в присутствии ципрофлоксацина в концентрации 100 мг/л при повышенной освещенности 2000 мкмоль фотонов/м2 • с в течение 30 мин и последующей экспозиции на слабом свету 8 мкмоль фотонов/м2 • с. Стрелками показано включение (Т) и выключение (+) избыточного света. ХФ — хлорамфеникол в концентрации 100 мг/л
Рис. 5. Содержание ТБК-активных продуктов в клетках T. weissflogii на 3-и сут инкубации с ципрофлоксацином в разной концентрации
Таким образом, проведенные исследования выявили чувствительность к воздействию ЦФ морских диатомовых микроводорослей, являющихся основными продуцентами в морских экосистемах. Результаты показали, что ЦФ снижает эффективность фотосинтеза этих микроводорослей на уровне ФС11 (FV/ FM). В присутствии ЦФ наблюдали увеличение квантовой эффективности рассеяния поглощенной энергии (^Do) — по-видимому, в результате нарушения миграции энергии от антенных комплексов к РЦ. Наши результаты согласуются с ранее опубликованными данными [26], полученными in vitro на тилакоидах шпината, согласно которым ЦФ препятствует передаче энергии от возбужденных молекул хлорофилла антенны к РЦ ФС11 и, тем самым, снижает вероятность разделения зарядов в РЦ. Возможно также снижение оттока электронов с донорной стороны ФС11 (FV / FO, VK, OEC fraction). Эти из-
менения приводят к уменьшению доли фотохимически активных РЦ (ABS / RC) и увеличению DIo / RC. Наши данные свидетельствует о том, что ЦФ может индуцировать окислительный стресс у диатомовых водорослей, также вызывая структурные и функциональные повреждения фотосинтетического аппарата. Флуоресценция хлорофилла является чувствительным методом и поэтому возможно использование примененных параметров флуоресценции для анализа воздействия антибиотиков на природные популяции фитопланктона in situ.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 22-11-00009). Работу проводили без использования животных и без привлечения людей в качестве испытуемых. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Van Doorslaer X., Dewulf J., Van Langenhove H., Demeestere K. Fluoroquinolone antibiotics: An emerging class of environmental micropollutants. Sci. Total Environ. 2014;500—501:250—269.
2. Eregowda T., Mohapatra S. Fate of micropollutants in engineered and natural environment. Resilience, response, and risk in water systems. Eds. M. Kumar, F. Munoz-Arriola, H. Furumai, and T. Chaminda. Singapore: Springer; 2020:283-301.
3. Omuferen L.O., Maseko B., Olowoyo J.O. Occurrence of antibiotics in wastewater from hospital and convectional wastewater treatment plants and their impact on the effluent receiving rivers: current knowledge between 2010 and 2019. Environ. Monit. Assess. 2022;194(4):306.
4. Lalumera G.M., Calamari D., Galli P. Preliminary investigation on the environmental occurrence and effects of antibiotics used in aquaculture in Italy. Chemosphere. 2004;54(5):661-668.
5. Yang S., Carlson K.H. Solid-phase extraction-high performance liquid chromatography-ion trap mass spectrometry for analysis of trace concentrations of macrolide antibiotics in natural and wastewater matrices. J. Chromatogr. A. 2004;1038(1—2):141—155.
6. Santos L.H.M.L.M., Araujo A.N., Fachini A., Pena A., Delerue-Matos C., Montenegro M.C.B.S.M. Ecotoxicological aspects related to the presence of pharmaceuticals in the aquatic environment. J. Hazard. Mater. 2010;175(1—3):45—95.
7. Kümmerer K. Drugs in the environment, emission of drugs, diagnostic aids and disinfectants into wastewater by hospitals in relation to other sources review. Chemosphere. 2001;45(6—7):957—969.
8. Kovalakova P., Cizmas L., McDonald T.J., Marsalek B., Feng M., Sharma V.K. Occurrence and toxicity of antibiotics in the aquatic environment: A review. Chemosphere. 2020;251:126351.
9. Vannini C., Domingo G., Marsoni M., Mattia F.D., Labra M., Castiglioni S., Bracale M. Effects of a complex
mixture of therapeutic drugs on unicellular algae Pseudokirch-neriella subcapitata. Aquat. Toxicol. 2011;101(2):459—465.
10. Karampela I., Dalamaga M. Could respiratory fluoroquinolones, levofloxacin and moxifloxacin, prove to be beneficial as an adjunct treatment in COVID-19? Arch. Med. Res. 2020;51(7):741-742.
11. Hughes S.R., Kay P., Brown L.E. Global synthesis and critical evaluation of pharmaceutical data sets collected from river systems. Environ. Sci. Technol. 2013;47(2):661-677.
12. Liu B.Y., Nie X.P., Liu W.Q., Snoeijs P., Guan C., Tsui M.T.K. Toxic effects of erythromycin, ciprofloxacin and sulfamethoxazole on photosynthetic apparatus in Selenastrum capricornutum. Ecotoxicol. Environ. Saf. 2011;74(4):1027-1035.
13. Nie X.P., Liu B.Y., Yu H.J., Liu W.Q., Yang Y.F. Toxic effects of erythromycin, ciprofloxacin and sulfamethoxazole exposure to the antioxidant system in Pseudokirchneriella subcapitata. Environ. Pollut. 2013;172:23-32.
14. Xiong J., Kurade M.B., Kim J.R., Roh H., Jeon B. Ciprofloxacin toxicity and its co-metabolic removal by a freshwater microalga Chlamydomonas mexicana. J. Hazard. Mater. 2017;323(Part A):212-219.
15. Strasser R.J., Tsimilli-Michael M., Srivasta A. Analysis of the chlorophyll a fluorescence transient. Chlorophyll a fluorescence. Advances in photosynthesis and respiration, vol. 19. Eds. G. Papageorgiou and R. Govindjee. Dordrecht: Springer; 2004:321-362.
16. Schreiber U. Pulse-Amplitude-Modulation (PAM) fluorometry and saturation pulse method: an overview. Chlorophyll a fluorescence. Advances in photosynthesis and respiration, vol. 19. Eds. G. Papageorgiou and R. Govindjee. Dordrecht: Springer; 2004:279-319.
17. Stewart R.R.C., Bewley J.D. Lipid peroxidation associated with accelerated aging of soybean axes. Plant Physiol. 1980;65(2):245-248.
18. Yang L.H., Ying G.G., Su H.C., Stauber J.L., Adams M.S., Binet M.T. Growth-inhibiting effects of 12 antibacterial agents and their mixtures on the freshwater
microalga Pseudokirchneriella subcapitata. Environ. Toxicol. Chem. 2008;27(5):1201-1208.
19. Chen Q., Zhang L., Han Y., Fang J., Wang H. Degradation and metabolic pathways of sulfamethazine and enrofloxacin in Chlorella vulgaris and Scenedesmus obliquus treatment systems. Environ. Sci. Pollut. Res. 2020;27:28198-28208.
20. Genty B., Briantais J.M., Baker N.R. The relationship between the quantum yield of photosynthetic electron-transport and quenching of chlorophyll fluorescence. Biochim. Biophys. Acta. 1989;990(1):87-92.
21. Антал Т.К., ^асв^ая Е.Э., Матоpин Д.Н., Волгушева A.A., Оотпов В.А., ^сиделена Т.Е., Pубин А.Б. Исследование влияния ионов метилртути и меди на первичные процессы фотосинтеза у зеленой водоросли Chlamydomonas moewusii с использованием параметров кинетических кривых переменной флуоресценции хлорофилла. Биофизика. 2009;54(4):681-687.
22. Pan X., Zhang D., Chen X., Mu G., Li L., Bao A. Effects of levofloxacin hydrochlordie on photosystem II activity and heterogeneity of Synechocystis sp. Chemosphere. 2009;77(3):413-418.
23. Kalaji H.M., Jajoo A., Oukarroum A., Brestic M., Zivcak M., Samborska I.A., Cetner M.D., Lukasik I., Goltsev V., Ladle, R.J. Chlorophyll a fluorescence as a tool to monitor physiological status of plants under abiotic stress conditions. Acta Physiol. Plant. 2016;38:102.
24. Joshi M.K., Mohanty P. Chlorophyll a fluorescence as a probe of heavy metal Ion toxicity in plants. Chlorophyll
a fluorescence. Advances in photosynthesis and respiration, vol. 19. Eds. G. Papageorgiou and R. Govindjee. Dordrecht: Springer; 2004:637-661.
25. Lazâr D. The polyphasic chlorophyll a fluorescence rise measured under high intensity of exciting light. Funct. Plant Biol. 2006;33(1):9-30.
26. Aristilde L., Melis A., Sposito G. Inhibition of photosynthesis by a fluoroquinolone antibiotic. Environ. Sci. Technol. 2010;44(4):1444-1450.
27. Murata N., Takahashi S., Nishiyama Y., Allakhver-diev S.I. Photoinhibition of photosystem II under environmental stress. Biochim. Biophys. Acta. 2007;1767(6):414-421.
28. Tyystjärvi E. Photoinhibition of Photosystem II. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 2013;300:243-303.
29. Pätsikkä E., Aro E.-M., Tyystjärvi E. Increase in the quantum yield of photoinhibition contributes to copper toxicity in vivo. Plant Physiol. 1998;117(2):619-627.
30. Rintamäki E., Salo R., Lehtonen E., Aro E.-M. Regulation of D1- protein degradation during photoinhibition of photosystem II in vivo: phosphorylation of the D1 protein in various plant groups. Planta. 1995;195(3):379-386.
31. Pinto E., Sigaud-kutner T.K.S., Leitao M.A.S., Oka-moto O.K., Morse D., Colepicolo P. Heavy metal-induced oxidative stress in algae. J. Phycol. 2003;39(6):1008-1018.
Поступила в редакцию 22.05.2023 После доработки 17.10.2023 Принята в печать 25.10.2023
RESEARCH ARTICLE
Primary photosynthetic processes of Thalassiosira weissflogii under the effect of ciprofloxacin
D.A. Todorenko1*©, N.D. Sidochenko2©, A A. Baizhumanov1©, L.B. Bratkovskaya3©, D.N. Matorin1©
1Department of Biophysics, Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University, 1—12 Leninskie gory, Moscow, 119234, Russia;
2Peoples' Friendship University of Russia, 6Miklukho-Maklaya st., Moscow, 117198, Russia;
3Department of General Ecology and Hydrobiology, Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University,
1—12 Leninskie gory, Moscow, 119234, Russia *e-mail: [email protected]
Fluoroquinolone antibiotics such as ciprofloxacin have been actively used in medical practice, including the COVID-19 pandemic, to suppress adverse bacterial infections. Widespread application and improper disposal have resulted in the ubiquity of antibiotics in the environment, which can affect aquatic life, including phytoplankton. The effect of fluoroquinolone antibiotics on the photosynthetic processes of marine diatoms, which are the main producers in marine ecosystems, has been little studied. In this work the effect of the antibiotic ciprofloxacin on the primary photosynthetic processes in the marine diatom Thalassiosira weissflogii was studied. It has been shown that ciprofloxacin affects the functioning of PSII, preventing the transfer of absorbed energy from the excited antenna chlorophyll molecules to the PSII RC (^Do). Under the influence of ciprofloxacin, a decrease in the efficiency of electron donation to P680+ (FV / FO), inhibition of the quantum yield of PSII (FV / FM), a decrease in the proportion of active RCs (ABS / RC), and an increase in the dissipation of absorbed energy in RCs (DIo / RC) were revealed. It has been shown that the
mechanism of action of ciprofloxacin is associated with damage of PSII RC. Ciprofloxacin enhances the photosensitivity of microalgae and causes an increase in lipid peroxidation products. It is proposed to apply the parameters of chlorophyll fluorescence analyzing the effect of antibiotics on microalgae.
Keywords: marine diatoms, OJIP curves, fluoroquinolone antibiotics, photosystem II, chlorophyll fluorescence, photoinhibition
Funding: The research was funded by Russian Science Foundation, project number 22-11-00009.
Сведения об авторах
Тодоренко Дарья Алексеевна — канд. биол. наук, науч. сотр. кафедры биофизики биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-35-03; e-mail: [email protected]; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7344-0256
Сидоченко Никита Дмитриевич — студент Российского университета дружбы народов. Тел.: 8-495-952-89-01; e-mail: [email protected]; ORCID: https://orcid.org/0009-0001-0451-8718
Братковская Любовь Борисовна — канд. биол. наук, вед. науч. сотр. кафедры общей экологии и гидробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-25-18; e-mail: [email protected]; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-0511-7983
Байжуманов Адиль Ануарович — канд. биол. наук, ст. науч. сотрудник кафедры биофизики биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-35-03; e-mail: adilbayzhumanov@ biophys.msu.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9737-4516
Маторин Дмитрий Николаевич — докт. биол. наук, проф., вед. науч. сотр. кафедры биофизики биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-35-03; e-mail: [email protected]; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6164-5625
