CC BY
34
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
29
(установлено иммуногистохимическим методом), что может быть связано с устранением физиологической избыточности функционального ответа на повреждение. При отсутствии повреждений количество клеток достигало максимума к концу второй недели без последующего падения. В контроле численность введенных миобластов снижалась с первых дней после трансплантации.
Пролиферация миосателлитоцитов как основа усиления биолюминесцентного сигнала подтверждалась высоким уровнем экспрессии Ki-67, установленным на 7, 13 и 19-е сут. эксперимента.
На последнем этапе исследователи в опытах in vitro и in vivo показали, что в 4% случаев даже одна клетка способна к долгосрочной пролиферации (около 14—17
делений). Выделенные через два месяца дочерние клетки трансплантированных миосателлитоцитов, согласно иммуногистохимическому и генетическому анализу, не отличались от введенных клеток.
Таким образом, авторы с использованием биолюминесцентного метода привели доказательства, позволяющие предположить, что гетерогенная популяция сателлитоци-тов включает истинно стволовые клетки, способные к долгосрочной пролиферации и дифференцировке в мио-генном направлении. Разработка высокоселективных методов их получения может послужить основой для дальнейшего применения в рамках клеточной терапии для лечения пациентов с повреждениями мышечной системы.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Данилов Р.К. Источники развития миобластов при регенерации скелетных мышц. Онтогенез, 1983; 14С5): 551—5.
2. Данилов Р.К. Очерки гистологии мышечных тканей. — Уфа: Башкортостан, 1994. — 5Dc.
3. Клишов A.A. Гистогенез, регенерация и опухолевый рост скелетной мышечной ткани. Л. : Медицина, 1971. — 175 с.
4. Повзун С.А. Общая патологическая анатомия. Учебное пособие для медицинских вузов. — СПб.: СОТИС, 2006. — 336 с.
5. Beauchamp J.R., Heslop L., Yu D.S. et al. Expression of CD34 and myf5 defines the majority of quies cent adult skeletal muscle satellite cells. J. Cell Biol. 2000; 151: 1221-34.
6. Seale P., Asakura A., Rudnick M. A. The Potential of Muscle Stem Cells. Developmental Cell 2001; 1: 333-42.
7. Kuang S., Kuroda K., Le Grand F. et al. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell 2007; 129t5]: 999—1010.
8. Sacco A., Doyonnas R., Kraft P. et al. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature 2008; 456C7221): 502—6.
9. Deasy B.M., Gharaibeh B.M., Pollett J.B. et al. Long-Term Self-Renewal of Postnatal Muscle-derived Stem Cells. MBC 2005; 16 [71: 3323—33.
10. Collins C.A. Satellite cell self-renewal. Curr Opin Pharmacol 2006; 6t3]: 301-6.
11. Mauro A. Satellite cells of muscle skeletal fibers. J. Biophys. Biochem. Cytol. 1961; 9: 493—5.
Порготовип ИЯ. База
По материалам: Sacco А„ Doyonnas R„ Kraft P. et al. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature 2008; 456(7221): 502-6
КЛИНИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ
Первая успешная трансплантация тканеинженерной трахеи в клинике
Выраженные стенозы дыхательных путей, причиной которых являются устойчивые к радио- и химиотерапии опухоли, инфекции или травмы, представляют собой серьезную медицинскую проблему, так как в ряде случаев для них не существует эффективных реконструктивных методов лечения. Для пациентов с этой патологией часто единственным решением является операция бронхэк-томии с последующим наложением анастомоза между свободными концами [1]. Однако длина изымаемого участка, как правило, ограничена несколькими сантиметрами и ее увеличение возможно только в случае замещения органа. С другой стороны, все попытки создания аутогенных и синтетических трансплантатов до настоящего времени были неудачными, а использование в клинической практике аллогенных трансплантатов имеет значительные ограничения [1—4].
В доклинических испытаниях с использованием тканеинженерных эквивалентов трахеи и бронхов предлагались слишком длительные и трудоемкие методики, чтобы применять их в рутинных клинических операциях [5], или же использовались искусственные матриксы
[4], которые невозможно представить в качестве альтернативы живой ткани. Группа исследователей P. Macchia-rini и соавт. в своей работе применяла очищенные от клеток донорские трансплантаты трахеи, заселенные аутогенными эпителиоцитами, полученными из биопсийного материала, а также хондроцитами, дифференцированными из мультипотентных мезенхимальных стро-мальных клеток (ММСК) реципиента. Доклинические испытания были проведены на мышах и свиньях [3]. In vitro удалось создать короткие жизнеспособные тканеинженерные участки трахеи [6], которые при трансплантации в организм животного не вызывали иммунного отторжения [7]. Вдохновленные этими результатами, ученые приступили к разработке биоинженерных трансплантатов трахеи и бронхов, и в ноябре 2008 г. в журнале The Lancet появилось сообщение о первой успешной трансплантации трахеи пациентке со стенозом главного левого бронха.
Тридцатилетия я женщина поступила в клинику с дис-фонией и сильным кашлем, вызванным туберкулезной инфильтрацией шейного отдела трахеи и главного левого
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 1, 2009
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
бронха. При обследовании обнаружился стеноз бронха на протяжении 3 см. Попытка поместить в левый бронх стент Дюмона не увенчалась успехом и, несмотря на соблюдение всех предусмотренных процедур, развилась вторичная пневмония, вызвавшая непроходящий кашель и накопление экссудата в плевральных полостях. После удаления стента у пациентки появилась тяжелая дыхательная недостаточность. Единственным решением в этом случае являлась тотальная бронхэктомия, однако такая операция характеризуется высоким риском смерти пациентов. По этой причине исследователи предложили полную резекцию левого бронха и части трахеи, и замещение его биоинженерным эквивалентом, изготовленным из человеческой трахеи.
В качестве матрикса будущего трансплантата был взят сегмент трупной трахеи длиной 7 см. Трахея была очищена от окружающей соединительной ткани, после чего было проведено 25 циклов девитализации, чтобы очистить матрикс от клеток донора и антигенов гистосовместимости. Девитализация проводилось с применением 4% деокси-холата натрия и дезоксирибонуклеазы I [6]; весь процесс занял 6 недель. После каждого цикла девитализации авторы проводили гистологическое исследование ткани, иммунофлуоресцентное для выявления количества оставшихся ядросодержащих клеток, а также иммуногисто-химическое на наличие в ткани антигенов гистосовместимости ША-АВС, Н1_А ОТ, Ни\ йР и Н1_А ТО.
Для заселения трансплантата эпителиоцитами и хон-дроцитами авторы применили биореактор собственной разработки. На медленно вращающийся отрезок трахеи равномерно нанесли суспензию клеток с помощью шприца — как на внешнюю, так и на внутреннюю его поверхность. Затем трансплантат, наполовину погруженный в среду культивирования, на протяжении всего времени пребывания в биореакторе постоянно вращался, чтобы клетки попеременно контактировали со средой и воздухом. Таким образом были смоделированы реальные условия, в которых эпителиоциты находятся в воздухоносных путях. Также биореактор позволил применить разные среды культивирования для хондроцитов и эпителиоцитов.
В биореакторе трансплантат находился 96 час., после чего был использован в операции для замещения удаленного бронха. При операции был полностью удален
главный левый бронх и участок трахеи, к которому он примыкал. Затем трансплантат был вшит в образовавшийся промежуток, и некоторое несоответствие диаметров просвета тканеинженерного эквивалента и просвета бронха реципиента было преодолено благодаря эластичности донорской ткани.
На десятые сутки после операции пациентка была выписана из клиники без признаков дыхательной недостаточности и иммунной реакции отторжения трансплантата. Согласно виртуальной трехмерной реконструкции дыхательных путей по данным, полученным с помощью компьютерной томографии, тканеинженерный эквивалент был практически неотличим от собственных бронхов. По данным биопсии, проведенной через 1 мес. после операции, в трансплантированном участке образовалась слизистая оболочка, хотя авторы не поясняют, насколько она соответствовала слизистой оболочке здоровых бронхов. Также наблюдалась его васкуляризация; авторы работы считают, что васкуляризации трансплантата могли способствовать ангиогенные факторы (ЬРВР, ТВРр) сохранившиеся в бесклеточном матриксе, однако они не определяли наличие этих веществ в пересаживаемом эквиваленте трахеи.
Период наблюдения за пациенткой составил 4 мес., в течение которых ее состояние оставалось стабильно хорошим. Тем не менее, авторы работы указывают, что перед началом масштабных клинических испытаний их метода требуется период наблюдения более 6 мес., чтобы более точно оценить последствия такой операции. В связи с невозможностью отследить судьбу трансплантированных клеток в организме пациентки, врачи не могут сказать, какие именно клетки сформировали слизистую оболочку в трансплантате: трансплантированные эпителиоциты или клетки, мигрировавшие из слизистой оболочки здоровых участков бронха. Поэтому трудно судить и о том, какой трансплантат предпочтительнее — заселенный клетками или просто бесклеточный донорский матрикс, очищенный от антигенов НЬА, который был бы гораздо удобнее для рутинного применения в клинике. В будущем, по-видимому, применение таких трансплантатов без или в сочетании с аутогенными клетками станет решением для пациентов, которым показана обширная бронхэктомия.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Grillo Н.С. Tracheal replacement: a critical review. Ann. Thorac. Surg. 2002; 73: 1995-2004.
2. Macchiarini P., Walles T., Biancosino C., Mertsching H. First human transplantation of a bioengineered airway tissue. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2004; 128: 638-41.
3. Birchall М., Macchiarini P. Arway transplantation: a debate worth having? Transplantation 2008; 85: 1075—80.
4. Sato T., Tao H., Araki M. et al. Replacement of the left main bronchus with a tissue-engineered prosthesis in a canine model. Ann. Thorac. Surg.
2008; 86: 422.
5. Macchiarini P. Trachea-guided generation. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2004; 128: 14-6.
6. Conconi M.T., De Coppi P., Di Liddo R. et al. Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells. Transpl. Int. 2005; 18: 727-34.
7. Jungebluth P., Go T., Asnaghi A., Bellini S. Structural and morphological evaluation of a novel enzymatic detergent tissue engineered tracheal tubular matrix. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2008; in print.
Подготовила А.С. Григорян По материалам: Macchiarini P., Jungebluth P., Go T. et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet 2008:372(9655): 2023-30
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 1, 2009
