CC BY
20Перспективы терапии цирроза печени мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга. Первый опыт
С.П. Лукашик1, В.М. Цыркунов2, Я.И. Исайкина3, О.Н. Романова3, А.Т. Шиманский3,
О.В. Алейникова3, Р.И. Кравчук2
Учреждение образования «Белорусский государственный медицинский университет», Минск; 2Учреждение образования «Гродненский государственный медицинский университет», Гродно; 3Государственноеучреждение «Республиканский научно-практический центр детской онкологии и гематологии», Минск, Республика Беларусь
Цель исследования: обсудить характеристики мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и перспективы их использования, в том числе на примере результатов собственного клинического исследования по лечению вирусассоциированного цирроза печени HCV-этиологии.
Результаты: цирроз печени (ЦП), формирующийся при прогрессировании хронических гепатитов, в том числе вирусной этиологии, остается одной из основных причин смерти. Единственным эффективным способом терапии для сохранения жизни таких больных является пересадка печени, что не всегда возможно в связи с нехваткой донорских органов. Складывающаяся ситуация формирует новые стратегии лечения, к которым относится клеточная терапия с использованием МСК, обладающих высокой пластичностью, низкой иммуногенностью и способностью к направленной миграции. В экспериментальных моделях показаны механизмы воздействия МСК по ограничению прогрессирования фиброза печени и стимуляции процессов регенерации. В клинических исследованиях отмечается хорошая переносимость и относительная безопасность введения аутологичных МСК, а также положительные эффекты, характеризующиеся улучшением синтетической функции печени, уменьшением класса тяжести цирроза по шкалам Чайлд-Пью и MELD, снижением уровня общей смертности. Приводятся результаты собственного проспективного пилотного исследования с применением аутологичных МСК из костного мозга у пациентов с HCV-ассоциированным циррозом печени.
Заключение: МСК способны оказывать множественные синергичные воздействия на звездчатые клетки Ито, уменьшать воспалительный процесс в ткани печени и ремоделировать процессы фиброгенеза. Для объективного подтверждения клинических преимуществ метода, оценки долгосрочной эффективности и безопасности применения МСК, а также выработки рациональных стратегий необходимы дальнейшие клинические исследования.
Ключевые слова: цирроз печени, мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, трансплантационная терапия.
Prospects of therapy of liver cirrhosis by mesenchymal bone Marrow stem cells. First experience
S.P. Lukashyk1, V.M. Tsyrkunov2, Y.I. Isaikina3, O.N. Romanova3, A.T. Shymanski3, O.V.Aleinikova3, R.I.Krauchuk2 'Belorussian State Médical University, Minsk; 2Grodno State Médical University, Grodno,
! State Institution "Belarusian Research Center for Pédiatrie Oncology, Hematology and Immunology", Minsk, Republic ofBelarus
Aim: to discuss the mesenchymal stem cells (MSCs) characteristics and prospects of of their use, including for example the results of our own clinical studies for the treatment of HCV-associated liver cirrhosis.
Results: liver cirrhosis, which is formed in the progression of chronic hepatitis, including viral etiology remains one of the maj or causes of death. The only effective method of lifesavingtherapy for these patients is liver transplantation, which is not always possible due to the shortage of donor organs. The emerging situation creates new treatment strategies, which include cell therapy using MSCs which have high potential for differentiation, low immunogenicity and the capacity for directional migration. In experimental models MSCs mechanisms of action are shown to limit the progression of liver fibrosis and stimulation of regeneration processes. In clinical studies good tolerability and relative safety of administration of autologous MSCs have reported as well as the positive effects on liver synthetic function, a decrease in the severity of cirrhosis on class Child-Pugh and MELD, reduction in overall mortality are shown. The results of our own prospective pilot study using autologous MSCs from bone marrow in patients with HCV-associated liver cirrhosis are described.
Conclusion: MSCs can exert multiple synergistic effects on the hepatic stellate cells, reduce inflammation in the liver tissue remodeling processes and fibrogenesis. For objective evidence of the clinical benefits of the method, evaluation of long-term efficacy and safety of MSCs, as well as developing rational strategies, further clinical studies are required.
Key words: cirrhosis of the liver, mesenchymal stem cells of bone marrow, transplant therapy.
Цирроз печени (ЦП), формирующийся при про-грессировании хронических гепатитов, в том числе вирусной этиологии, остается одной из основных причин смерти. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в настоящее время в Европе ЦП обусловливает 1,8% всех случаев смерти и около 170000 случаев смерти ежегодно [1].
В Республике Беларусь за период 19872012 гг. количество протоколов вскрытий, в которых зафиксированы признаки фиброза / ЦП, увеличилось с 4,6 до 14,5%. Среди умерших мужчины составили 62,8% (средний возраст — 49,2 года), женщины — 37,2% (средний возраст — 59,3 года); в трудоспособном возрасте умерли 77,6% мужчин и 55,2% женщин [2].
Актуальной задачей остается лечение больных с ЦП. Единственным эффективным способом терапии для сохранения жизни таких больных является пересадка печени, что не всегда возможно в связи с нехваткой донорских органов.
Складывающаяся ситуация формирует новые стратегии лечения, к которым относится клеточная терапия. К концу 2012 г. было зарегистрировано более 170 клинических испытаний по применению стволовых клеток при заболеваниях печени, демонстрирующих возмож-
ность положительного влияния цитотерапии на основные механизмы прогрессирования патологического процесса в печени [3]. Многие из них описывают терапевтический потенциал ме-зенхимальных стволовых клеток (МСК). Учитывая низкую иммуногенность и способность к направленной миграции, МСК в последние годы стали предметом интенсивных исследований в качестве потенциальных клеточных кандидатов для стимуляции репарации различных тканей, в том числе печени. В клинических исследованиях показано, что при лечении МСК отмечаются их хорошая переносимость, безопасность, положительные терапевтические эффекты, а также снижение уровня общей смертности [4-8].
В настоящей статье представлены характеристики МСК и обзор перспектив их использования, а также результаты собственного клинического исследования по лечению вирусассоци-ированного ЦП НСУ-этиологии.
Пластичность мезенхимальных стволовых клеток
Клетки стромального микроокружения характеризуются очень высокой пластичностью, т. е. способностью в своей дифференцировке преодолевать барьеры линейной специфичности,
приобретая профиль экспрессии и функциональный фенотип, характерные для клеток других тканей. Их пластичность в пределах мезен-химальной ткани получила название ортодоксальной [9]. Однако МСК могут проявлять и так называемую неортодоксальную пластичность: при культивировании с использованием определенных стимуляторов они способны дифференцироваться в клетки печени, почек, поджелудочной железы, нервной ткани, обладающие не только характерным фенотипом, но и соответствующей функциональной активностью. Таким образом, МСК, принадлежащие к мезо-дермальному эмбриональному ростку, в своей дифференцировке способны преодолевать барьеры эмбрионального развития, превращаясь в клетки тканей, происходящих из эктодермаль-ного (нервная ткань) и эндодермального (печень, поджелудочная железа, мочевыводящие пути) эмбриональных ростков [10-12]. Это положило начало новой эре использования МСК в цитотерапии болезней, не связанных с органами кроветворения.
Одним из побудительных мотивов широкого использования МСК явилось и то, что эти клеточные элементы легко выделить из различных тканей организма и быстро увеличить их количество в относительно несложных условиях культивирования. Так, при культивировании МСК в средах, содержащих специфические стимуляторы дифференцировки печеночных клеток или при их совместном культивировании с гепатоцитами (такие маркеры гепатоцитов, как транскрипционные факторы — с/ЕВР(3 и Н№4а), клетки приобретают полигональную форму, а также способность секретировать альбумин и альфа-фетопротеин [13-15]. При введении МСК интрапортально мышам с экспериментальным ЦП их генетические маркеры обнаруживаются в клетках печени (до 16% гепатоцитов содержат маркеры МСК), что сопровождается улучшением функции органа и общего состояния экспериментальных животных [14,15].
Способность мезенхимальных стволовых клеток ограничивать прогрессирование фиброза печени
На данном этапе существуют экспериментальные исследования с применением МСК при фиброзе печени, авторы которых высказали предположение о возможности МСК оказывать
значительное влияние на ремоделирование экс-трацеллюлярного матрикса [16,17].
Опубликованы данные, указывающие на способность МСК взаимодействовать со звездчатыми клетками Ито (ЗКИ), которые при вирусном поражении являются основным источником фибриллярных коллагенов и других экс-трацеллюлярных матриксных протеинов, входящих в состав фиброзной ткани. Известно, что в условиях развившегося воспалительного процесса ЗКИ претерпевают фенотипические изменения и переходят от состояния покоящихся, ретиноидзапасающих клеток, к пролифери-рующим, миофибробластоподобным, экспрес-сирующим а-гладкомышечный актин [3,18,19]. В экспериментальных исследованиях было продемонстрировано, что МСК могут оказывать множественные синергичные воздействия на состояние и функциональную активность ЗКИ: ингибировать активированные клетки, предотвращать их новую активацию и/или модулировать эффекты ЗКИ.
Ингибирующее действие МСК на проли-феративную и фиброгенную функции активированных ЗКИ сопровождается значительным уменьшением депозитов экстрацеллюляр-ных матриксных протеинов (ЭМП) в ткани печени [20-23]. Лежащие в основе этого механизмы объясняются паракринным влиянием МСК через интерлейкин-10 (ИЛ-10), фактор некроза опухоли альфа (ФИО-а) и гепатоцитарный фактор роста. В то же время установлено, что активированные ЗКИ сами могут выделять ИЛ-6, индуцирующий секрецию ИЛ-10 мезенхимальны-ми клетками, предполагая динамическое взаимодействие клеток в сложившемся микроокружении [24].
Установлено, что процессы фиброгенеза и фибролиза находятся в динамическом равновесии во многом благодаря сбалансированному взаимодействию между матриксными ме-таллопротеиназами (ММП) и тканевыми ингибиторами матриксных металлопротеиназ (ТИММП) — те и другие эспрессируются ЗКИ. При благоприятных условиях спонтанного разрешения фиброза у пациентов с ЦП было продемонстрировано увеличение апоптоза ЗКИ, снижение экспрессии ТИММП и увеличение активности коллагеназы. Такая корреляция подчеркивает потенциальную роль ТИММП в регулировании выживаемости ЗКИ. В исследова-
нии in vitro было показано, что ТИММП-1 способны ингибировать апоптоз ЗКИ через эффекты торможения на ММП [25]. Этот же механизм был исследован in vivo на модели крыс с инфарктом миокарда. Было отмечено, что после проведения трансплантации МСК в инфаркциро-ванном миокарде наблюдается значительное снижение экспрессии ТИММП-1, коллагена I и III, трансформирующего фактора роста-ßl и улучшение функционального состояния миокарда по сравнению с контролем [26]. Теоретически подобные модулирующие молекулярные изменения могут происходить и в ткани печени, значительно улучшая механизмы репарации. Так, показано, что большинство молекул, секретируемых МСК и связанных с фиброгене-зом, являются анти-фиброгенными, что указывает на способность клеток участвовать в деградации ЭМП. Однако тонкий механизм такого явления сложен и пока до конца не изучен.
Рядом исследователей были продемонстрированы доказательства способности МСК предупреждать переход ЗКИ от состояния покоя к состоянию активности («профилактическое» действие МСК). Так, в условиях эксперимента in vitro (в ко-культуре МСК и ЗКИ) количество ЗКИ в фазе GO клеточного цикла увеличивалось, а в фазе S — уменьшалось [23].
Способность мезенхимальных стволовых клеток улучшать процессы регенерации в печени
Это еще одна важная цель цитотерапии. Уменьшение воспаления и количества ЭМП может быть основой для активации регенерации ге-патоцитов. С одной стороны, МСК после трансплантации способны уходить из-под иммунного контроля, с другой — продемонстрирована их иммуномодулирующая и противовоспалительная активность, в основе которой лежат как паракринный эффект МСК, так и межклеточные взаимодействия между МСК и иммунными клетками [7, 8]. В модели на крысах показано, что введение бессывороточной концентрированной среды после выращивания на ней МСК способствовало значительному выживанию животных с острой печеночной недостаточностью. Авторы наблюдали дозозависимый эффект в выживании крыс и указали на необходимость использования оптимальной терапевтической концентрации клеток [27, 28].
Механизмы воздействия МСК на процессы регенерации печени и возможности применения этого направления при ЦП требуют уточнения, так как в результатах экспериментальных исследований имеются некоторые противоречия. Существуют работы, демонстрирующие, что МСК в ткани печени способны приобретать миофибробластный фенотип и секретировать молекулы, проявляющие профиброгенную активность [29-31]. Объяснением неоднозначности полученных результатов могут служить различия в использовавшихся экспериментальных моделях и методологических подходах. Кроме того, можно предположить, что вариабельность дифференцировки и эффектов МСК зависит от характера поражения печени, сроков цитотран-сплантации, а также характеристик микросреды, оказывающих влияние на хоминг и приживление МСК в ткани печени. Для уточнения механизмов взаимодействия, происходящих в патологически измененной печени после трансплантации МСК, необходимо проведение дальнейших исследований.
Клиническое применение стволовых клеток костного мозга для лечения цирроза печени
Переход от доклинического этапа к клиническому применению стволовых клеток у пациентов с фиброзом / ЦП вызвал большой интерес. В настоящее время существует несколько клинических исследований по лечению ЦП стволовыми клетками костного мозга. Однако все они проведены на небольшом количестве пациентов, различаются по использованным видам клеток и технологиям цитотрансплантации.
Б. Тега! и соавт. для лечения девяти пациентов с декомпенсированным ЦП использовали ау-тологичные клетки костного мозга, которые вводили в периферическую вену. Через 24 недели от начала терапии в биохимическом анализе крови наблюдалось увеличение общего белка и альбуминов, уменьшение альфа-фетопротеина и степени тяжести ЦП по шкале Чайлд-Пью, а также снижение экспрессии ядерного антигена клеточной пролиферации при биопсии печени [32].
Позднее, в 2007 г., М. МоЬатас1пе)ас1 и соавт. провели два исследования с включением пациентов с декомпенсированным ЦП. В первом из них аутологичные МСК костного мозга вводили в периферическую вену пациентов, что
дало возможность наблюдать улучшение функции печени (снижение уровня аланиновой ами-нотрансферазы (AJIT), уменьшение количества баллов MELD) и сделать выводы об эффективности и безопасности исследования [5]. Во втором своем исследовании для лечения пациентов с декомпенсированным ЦП авторы использовали трансплантацию CD34+ стволовых клеток костного мозга, вводя их через печеночную артерию, но не получили аналогичных оптимистических результатов [33]. Кроме того, было сделано заключение о небезопасности процедуры доставки CD34+ клеток таким путем.
Исследование Р. Kharaziha с соавт., в которое были включены восемь пациентов с терминальной стадией ЦП различной этиологии (4 — в исходе HBV-инфекции, 1 — в исходе HCV-инфекции, 1 — алкогольной этиологии, 2 — криптогенных ЦП) показало, что введение МСК является безопасным и эффективным методом терапии для лечения терминальной стадии ЦП, т. к. после введения аутологичных МСК все пациенты имели хорошее самочувствие и улучшение функции печени [34].
Собственный опыт применения стволовых клеток костного мозга для лечения цирроза печени
Учитывая важность описываемой патологии, авторы настоящей статьи провели собственное проспективное пилотное клиническое исследование с применением аутологичных МСК костного мозга для оценки влияния МСК, полученных из костного мозга и имплантированных в паренхиму печени, на процессы фиброгенеза / фибролиза и регенерации в ткани печени у пациентов с HCV-ассоциированным ЦП.
При планировании исследования на основании знаний о структуре и результатов доклинических и предыдущих клинических испытаний нами проведена коррекция некоторых принципиальных составляющих для нивелирования их негативного влияния на объективность получаемых данных и более точную оценку результатов терапии.
После утвержденного протокола исследования комитетом по этике в исследование включены шесть пациентов (три мужчины и три женщины) с HCV-ассоциированным ЦП класса В и С по Чайлд-Пью (средний возраст — 44,5±2,7 года). Всем пациентам проводили общеклинические
и биохимические анализы крови, УЗИ органов брюшной полости, исследование крови на маркеры вирусов гепатитов (HBsAg, anti-HCV, HCV RNA), пункционную биопсию печени (ПБП).
Для получения аутотрансплантата МСК применяли технологию [35], модификация которой заключалась в трехкратной отмывке поверхности флакона с адгезированными клетками через 48 часов после начала культивирования моно-нуклеарных клеток костного мозга с целью минимизации возможной контаминации клетками крови с вирусной инфекцией. Мононуклеар-ные клетки выделяли из костного мозга пациента, который в объеме 40-60 мл получали посредством пункции (под анестезией) за 35-45 дней до планируемой инфузии МСК, и в концентрации 1-2х106/мл переносили во флаконы для последующего культивирования в С02 инкубаторе. Выполняли несколько пассажей, при которых МСК наращивали in vitro в среде IMDM с 10% ЭТС (Sigma, США), 2 мМ L-глутамина и 10-4 М 2-мер-каптоэтанола до нужного объема в зависимости от массы тела пациента. Клетки, снятые с поверхности культуральных флаконов последнего пассажа дважды отмывали в физиологическом растворе и переносили в 5 мл NaCl для дальнейшей инфузии пациенту. Принадлежность полученных данным методом клеток к МСК подтверждали наличием поверхностных маркеров CD105+, CD90+, CD73+. Обязательным требованием являлось исследование МСК из каждого пассажа на стерильность по всему спектру возможной бактериальной и вирусной контаминации.
Для анализа жизнеспособности клетки окрашивали 0,4%-ным раствором трипанового синего. Рассчитывали коэффициент жизнеспособности клеток (в процентах от общего числа подсчитанных клеток).
Выбор способа трансплантации
Применен метод внутрипаренхимального введения МСК в ткань печени: под контролем УЗИ вводили 5 мл взвеси МСК из расчета 1х106/кг массы тела — по 1 мл в 5 точек. Преимуществом предложенного способа, по нашему мнению, является его относительная безопасность, воздействие МСК на определенные участки органа, устранение возможности хоминга клеток за пределы ткани печени. Последнее важно с точки зрения объективизации результатов и точности интерпретации полученных при контрольном
морфологическом исследовании биоптатов, забранных из того же участка печени, куда вводились МСК.
Критерии оценки эффективности трансплантации
В шкалу оценки нами было введено морфологическое исследование биоптата печени, которое до сих пор считается золотым стандартом диагностики хронических гепатитов и ЦП. Эффективность оценивали в динамике с интервалом в 6 мес.
Наряду с рутинным морфологическим определением степени активности и стадии хрони-зации использованы методы иммуногистохи-мической (ИГХ) оценки изменений в печени, позволяющие оценить активацию миофибро-бластов по экспрессии альфа-гладкомышечного актина (а-БМА) и феномен «капилляризации» синусоидов по экспрессии СБ34+. Для проведения иммуногистохимического исследования биоптаты печени фиксировали в 10%-ном нейтральном растворе формалина и заливали в парафин по стандартной методике. В последующем использовали коммерческие антитела к антигенам СБ34+ и а-БМА («Бако», Дания).
Кроме того, в шкалу оценки эффективности результатов терапии МСК нами введено
электронномикроскопическое (ЭМ) исследование биоптата, что позволило выявить многие процессы, происходящие в печени на ультраструктурном уровне. ЭМ изучение проводили в биоптатах печени, фиксированных 1%-ным раствором четырехокиси осмия на 0,1 М буфере Миллонига и 2,5% растворе глутарового альдегида на 0,1 М буфере Миллонига [36]. Изготовленные ультратонкие срезы контрастировали 2% раствором уранилацетата на 50% метаноле [37] и цитратом свинца по E.S. Reynolds [38]. ЭМ препараты изучали в электронном микроскопе JEM-1011 (Япония) при увеличении 10000-40000 при ускоряющем напряжении 80 кВт. Изображения фотографировали вмонтированной цифровой камерой Olympus MegaView III (Германия).
Клиническая оценка общего состояния пациентов показала улучшение самочувствия уже через месяц после трансплантации МСК. Через 6 мес. отмечалось улучшение функциональных проб печени: снижение активности AJIT и содержания билирубина. Морфологическое исследование биоптатов печени до лечения и через 6 месяцев после трансплантации выявило активацию процессов фибролиза и регенерации ге-патоцитов, что продемонстрировано на рисунках 2-5 (случай ЦП у пациента Д.).
1-я группа пациентов с ЦП 2-я группа пациентов с ЦП 3-я группа пациентов с ЦП
п—6 ПБП Внутрипаренхимальное введение МСК п—6 Амбулаторное динамическое наблюдение 5 мес. п—6 Оценка результатов терапии на 6 мес. ПБП
Осмотры 0,1, 2, 3,4, 5, 6 мес.
Рис. 1. Общая схема дизайна исследования
V
^ / .*.v; - • ./ - - у
I. Y г ""v4-'- 7 ЩI
- У . if*'» • . •• ч 4
, -р » г* * ♦ • .V • I
Рис. 2. Капилляризация синусоидов. А — до трансплантации МСК: выраженная капилляриза-ция синусоидов. ИГХ: СБ34+.х400. Б — через 6 мес. после трансплантации МСК: слабо выраженная капилляризация синусоидов. ИГХ: СБ34 + х 400
Рис. 3. Активация миофибробластов. А — до трансплантации МСК: умеренно выраженная: ИГХ: а-БМА х 400. Б — через 6 месяцев после трансплантации МСК: слабо выраженная: ИГХ: а-БМАх 400
Рис. 4. Состояние митохондрий гепатоцитов. А — до трансплантации МСК: митохондрии с атипизмом форм, редукцией крист, конденсированным матриксом, отслоением наружной мембраны, образованием пузырей х 10000. Б — через 6 мес. после трансплантации МСК: митохондрии многочисленные, гипертрофированые, с диффузной локализацией, полиморфизмом, делящиеся, с многочисленными кристами х 10000
Рис. 5. Ядра гепатоцитов. А — до трансплантации. Ядро гепатоцита округлой формы. Мар-гинация хроматина. Компактное ядрышко с преимущественно фибрилярным компонентом. Вакуольная дистрофия в цитоплазме гепатоцита х 10000. Б — через 6 мес. после трансплантации МСК. Ядро гепатоцита овальной формы. Ядрышко с преимущественно гранулярным компонентом х 15000
В процессе введения МСК и на протяжении всего периода наблюдения ни у кого из пациентов осложнений не наблюдалось.
Таким образом, продемонстрировано, что МСК костного мозга могут in vitro проходить процесс дифференцировки в гепатоцитоподоб-ные клетки, обладающие морфологией, характерной для гепатоцитов. Терапевтическое использование интрапаренхимальных инъекций МСК является безопасной процедурой, может улучшить функциональное состояние печени, ускорить репаративные процессы в гепатоцитах и уменьшить количество ЭМП в ткани печени у пациентов с ЦП.
Заключение
Проведенные к настоящему времени позитивные клинические исследования при лечении декомпенсированного цирроза печени могут открыть новые возможности для лечения этого мало курабельного заболевания и позволяют планировать дальнейшее расширение контингента больных с целью продолжения испытаний. Доказана хорошая переносимость и безопасность введения МСК при лечении патологии печени. Следующий этап должен предусматривать модификацию доз, кратности и путей введения с последующей оценкой эффективности и безопасности использования МСК.
Литература
1. Zatonski W.A., Sulkowska U., Manczuk M., Rehm J., Boffetta P., Lowenfels A.B., La Vecchia C. Liver cirrhosis mortality in Europe, with special attention to Central and Eastern Europe // Eur.Addict. Res. - 2010. - Vol. 16. - P. 193-201.
2. Актуальные вопросы гепатологии: материалы 10-го межд. симпозиума гепатологов Беларуси / под ред. В.М. Цыркунова. - Гродно: ГрГМУ, 2013. - 172 с.
3. Forbes SJ., Newsome P.N. New horizons for stem cell therapy in liver disease//J.Hepatol.- 2012.-Vol. 56.- P. 496-499.
4. Friedman S.L. Evolving challenges in hepatic fibrosis//Gastroenterol. Hepatol. - 2010. - Vol. 7. - P. 425-436.
5. Mohamadnejad M., Alimoghaddam K., Mohyeddin-Bonab M., Bagheri M., Bashtar M., Ghanaati H.,Baharvand H.,Ghavamza-deh A., Malekzadeh R. Phase 1 trial of autologous bone marrow mes-enchymal stem cell transplantation in patients with decompensated liver cirrhosis // Arch. Iran Med. - 2007. - Vol. 10,- P.459-466.
6. Uccelli A., Moretta L., Pistoia V. Mesenchymal stem cells in health and disease // Nat. Rev. Immu-nol. - 2008.- Vol. 8.- P. 726-736.
7. Zhang L., Theise N., Chua M., Reid L.M. The stem cell niche of human livers: symmetry between development and regeneration // Hepatol. - 2008. - Vol. 48. - P. 1598-1607.
8. Zhang Z., Lin H., Shi M.,Xu R, Fu J., LvJ.,Chen L.,LvS.,Li Y.,Yu S., Geng H., Jin L., Lau G.K., Wang F.S. Human umbilical cord mesenchymal stem cells improve liver function and ascites in decompensated liver cirrhosis patients // J. Gastroenterol. Hepatol. - 2012. - Vol.27. - P. 112-120.
9. Bianco P., Riminucci M., Gronthos S., Robey P. Bone marrow stromal stem cells, nature, biology, and potential applications //Stem Cells - 2001,-Vol.19. - P. 180-192.
10. Владимирская Е.Б. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) в клеточной терапии // Онко-гематол.- 2007.- № 1.- С.4-16.
11. Makino S., Fukuda К., Miyoshi S., Konishi F., Kodama H., Pan J., Sano M.,Takahashi Т., Hori S.,Abe H., Hata J., Umezawa A., Oga-wa S. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro //J.Clin, invest. - 1999.-Vol. 103.-P. 697-705.
12. Beltrami A.P., Urbanek K., Kajstura J.,Yan S.M., Finato N., Bussani R., Nadal-Ginard В., Silves-tri F., Leri A., Beltrami C.A., Anversa P. Evidence that human cardiac myocytes divide after myo-cardial infarction // N. Engl. J. Med. - 2001. - Vol. 344. -P. 1750-1757.
13. Talens-Visconti R., Bonora A., Jover R. Hepatogenic differentiation of human mesenchymal stem cells from adipose tissue in comparison with bone marrow mesenchymal stem cells // World J. Gas-troenterol. - 2006. - Vol. 12. - P. 5834-5845.
14. LukJ.M., Wang P.P., Lee C.K., Wang J.H., Fan S.T. Hepatic potential of bone marrow stromal cells: development of in vitro co-culture and intra-portal transplantation models//J. Immunol. Methods- 2005. -Vol. 305,- P. 39-47.
15. Seo MJ., Suh S.Y., Bae Y.C., Jung J.S. Differentiation of human adipose stromal cells into hepatic lineage in vitro and in vivo // Bio-chem.Biophys.Res.Commun.- 2005.-Vol.328.- P. 258-264.
16. Aziz M.T.A., Atta H.M., Mahfouz S., Fouad H.H., Roshdy N.K., Ahmed H.H., Rashed L.A., Sabry D., Hassouna A.A., Hasan N.M. Therapeutic potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on experimental liver fibrosis // Clin. Biochem. -2007.-Vol. 40,- P. 893-899.
17. Fang В., Shi M., Liao L., Yang S., Liu Y.,Zhao R.C. Systemic infusion of FLK1+ mesenchymal stem cells ameliorate carbon tet-rachloride-induced liver fibrosis in mice//Transplant. - 2004. -Vol.78. - P.83-88.
18. Лукашик С.П., Цыркунов В.М., Андреев В.П., Кравчук Р.И., Абакарова В.А. Патогенетическая роль популяции звездчатых клеток Ито и клеточных коопераций в формировании фиброза при хроническом гепатите С // Инфекционные болезни. -2010. -8(2) - С. 7-12.
19. Friedman S.L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver// Physiol. Rev. - 2008.-Vol.88. - P. 125-172.
20. Asai K., Tamakawa S., Yamamoto M., Yoshie M., Tokusashi Y., Yaginuma Y., Kasai S., Ogawa K. Activated hepatic stellate cells overexpress p75 NTR after partial hepatectomy and undergo apoptosis on nerve growth factor stimulation // Liver Int. -2006,-Vol.26.- P.295-603.
21. Chen X., Li Y., Wang L., Katakowski M., Zhang L., Chen J., Xu Y., Gautam S.C., Chopp M. Is-chemic rat brain extracts induce human marrow stromal cell growth factor production // Neuro-pathol.- 2002.-Vol.22,- P. 275-279.
22. Trim N., Morgan S., Evans M., Issa R., Fine D., Afford S., Wilkins В., Iredale J. Hepatic stellate cells express the low affinity nerve growth factor receptor p75 and undergo apoptosis in response to nerve growth factor stimulation // Am. J. Pathol. - 2000. -Vol.156.- P. 1235-1243.
23. Zhao D.C., Lei J.X., Chen R.,Yu W.H.,Zhang X.M., Li S.N.,Xiang P. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells protect against experimental liver fibrosis in rat // World J. Gastroentrol. -2005,-Vol.11.- P. 3431-3440.
24. Parekkadan В., van Poll, D., Megeed Z., Kobayashi N.,Tilles A.W., Berthiaume F., Yarmush M.L. Immunomodulation of activated hepatic stellate cells by mesenchymal stem cells // Biochem. Bio-phys. Res. Commun.- 2007a. - Vol. 363.- P.247-252.
25. Murphy F.R., Issa R.,Zhou X., Ratnarajah S., Nagase H., Arthur MJ., Benyon C., iredale J.P. in-hibition of apoptosis of activated hepatic stellate cells by tissue inhibitor of metalloproteinase-1 is mediated via effects on matrix metalloproteinase inhibition // J. Biol.Chem.- 2002,-Vol.277.-P. 11069-11076.
26. Xu X.,Xu Z.,Xu Y.,Cui G.Effects of mesenchymal stem cell transplantation on extracellular ma-trix after myocardial infarction in rats //Corn. Artery. Dis. - 2005. -Vol. 16.- P. 245-255.
27. Долгих M.C. Перспективы терапии печеночной недостаточности с помощью стволовых клеток // Биомедицинская химия - 2008.- № 4.- С. 376-391.
28. Parekkadan В., van Poll D., Suganuma К., Carter E.A., Berthiaume F., Tilles A.W., Yarmush M.L. Mesenchymal stem cell-derived molecules reverse fulminant hepatic failure // PLoS One. - 2007.-Vol.7,-P. 1018-1028.
29. Carvalho A.B., Ouintannilha L.F., Dias J.V., Paredes B.D., Mannheimer E.G., Carvalho F.G., Asensi K.D., Gutfilen В., Fon-seca L.M., Resende C.M., Rezende G.F.,Takiya C.M., de Carvalho A.C., Goldenberg R.C. Bone marrow multipotent mesenchymal stem cells do not reduce fibrosis or improve function in a rat model of severe chronic liver injury// Stem Cells. - 2008.-Vol. 26,- P. 1307-1314.
30. Di Bonzo L.V., Ferrero I., Cravanzola C., Mareschi K., Rustichell D., Novo E., Sanavio F., Cannito S., Zamara E., Bertero M., Davit A., Francica S., Novelli F., Colombatto S., Fagioli F., Parola M. Human mesenchymal stem cells as a two-edged sword in hepatic regenerative medicine: engraftment and hepatocyte differentiation versus profibrogenic potential // Gut - 2008. -Vol.57. - P.223-231.
31. Russo F.P., Alison M.R., Bigger B.W.,Amofah E., Florou A., Amin F., Bou-Gharios G., Jeffery R., iredale J.P., Forbes SJ. The bone
marrow functionally contributes to liver fibrosis // Gastroenterol. - 2006. - Vol. 130. - P. 1807-1821.
32. Terai S., Ishikawa Т., Omori K.,Aoyama K., Marumoto Y., Urata Y., Yokoyama Y., Uchida K.,Yamasaki Т., Fujii Y., Okita K.,Sakaida I. improved liver function in patients with liver cirrhosis after autologous bone marrow cell infusion therapy // Stem Cells. -2006.-Vol. 24,- P. 2292-2298.
33. Mohamadnejad M., Namiri M., Bagheri M., Hashemi S.M., Ghanaati H.,Zare Mehrjardi N., Kazemi Ashtiani S., Malekzadeh R., Baharvand H. Phase 1 human trial of autologous bone marrow-hematopoietic stem cell transplantation in patients with decompensated cirrhosis // World J. Gastroenterol. - 2007. - Vol. 13,- P. 3359-3363.
34. Kharaziha P.,Hellstrom P.M., Noorinayer B.,Farzaneh F.,Agha-jani K., Jafari F., Telkabadi M., Atashi A., Honardoost M., Zali M.R., Soleimani M. improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection: a phase l-ll clinical trial// Eur. J. Gas-troenterol. Hepatol.
- 2009,-Vol.21. - P. 1199-1205.
35. Способ экспансии мезенхимальных стволовых клеток: пат. 11560 Респ. Беларусь от 10.27.2008 / Я. И. Исайкина, О.В. Олейникова: заявитель Респ. науч.-практ. центр детской онкологии и гематологии. - № а20070657; заяв. 31.05.2007; опубл. 25.02.2009//Афщыйны бюл. / Нац. цэнтр штэлектуал. уласнасцк - 2009. - № 1. - С. 93.
36. Millonig G.A. Advantages of a phosphate buffer for osmiumtetroxide solutions in fixation // J. Appl. Physics. - 1961. - Vol. 32,- P. 1637-1643.
37. Watson M.L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals // J. Biophys. Biochem. Cyt. - 1958. - Vol. 4.
- P. 475-478.
38. Reynolds E.S.The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy // J. Cell. Biol. - 1963. -Vol.17. - P.208-212.
Контактная информация
Лукашик Светлана Петровна — кандидат медицинских наук, доцент кафедры инфекционных болезней учреждения образования «Белорусский государственный медицинский университет». Контактная информация: Буе^апаЫкавЫк® mail.ru; 220116, Республика Беларусь, г. Минск, ул. Дзержинского, д. 83.
Цыркунов Владимир Максимович — доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой инфекционных болезней учреждения образования «Гродненский государственный медицинский университет». Контактная информации: [email protected]; Республика Беларусь, 230015, г. Гродно, ул. Горького, д. 80.
Исайкина Янина Ивановна — кандидат биологических наук, заведующая лабораторией клеточной биотехнологии и цитотерапии государственного учреждении «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии». Контактная информация: [email protected]; Республика Беларусь, 223053, Минская обл., Минский р-н, д. Боровляны,ул. Фрунзенская, д. 43.
Lukashyk Svetlana Petrovna — PhD, assistant of professor of infection diseases department of Belarusians state medical university. Contact information: [email protected]; 220116, Republic of Belarus, Minsk, Dzerzhinsky street, 83.
Tsirkunov Vladimir Maksimovich — MD, professor, head of the infectious diseases department of Grodno state medical university. Contact information: [email protected]; 230015, Republic of Belarus, Grodno, Gorkogo street, 80.
Isaikina Yanina Ivanovna — cand, head of the laboratory cell biotechnology and tsitoterapii of the State Institution «Belarusian Research Center for Pediatric Oncology, Hematology and Immunology». Contact information: yaninai@mail. ru; 223053, Republic of Belarus, Minsk region, v. Borovlyani, Frunzenskaya street, 43.
Романова Оксана Николаевна — доктор медицинских наук, заместитель директора по клинике государственного учреждения «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии». Контактная информация: [email protected]; Республика Беларусь, 223053, Минская обл., Минский р-н, д. Боровляны, ул. Фрунзенская, д. 43.
Шиманский Артур Тадеушевич — кандидат медицинских наук, заведующий операционным блоком государственного учреждения «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии». Контактная информация: Республика Беларусь, 223053, Минская обл., Минский р-н, д. Боровляны, ул. Фрунзенская, д. 43.
Алейникова Ольга Витальевна — член-корреспондент HAH РБ, доктор медицинских наук, профессор, директор государственного учреждения «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии». Контактная информация: aleinikova2004@mail. ru; Республика Беларусь, 223053, Минская обл., Минский р-н, д. Боровляны, ул. Фрунзенская, д. 43.
Кравчук Римма Ивановна — кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник Центральной научно-исследовательской лаборатории учреждения образования «Гродненский государственный медицинский университет». Контактная информации: Республика Беларусь, 230015, г. Гродно, ул. Горького, д. 80.
Romanova Oksana Nikolaevna — MD, deputy of director of the State Institution «Belarusian Research Center for Pediatric Oncology, Hematology and Immunology». Contact information: [email protected]; 223053, Republic of Belarus, Minsk region, v. Borovlyani, Frunzenskaya street, 43.
Shimanskiy Arthur Tadeushevich — PhD, head of the operating unit of the State Institution «Belarusian Research Center for Pediatric Oncology, Hematology and Immunology». Contact information: 223053, Republic of Belarus, Minsk region, v. Borovlyani, Frunzenskaya street, 43.
Aleinikova Olga Vitalyevna — Doctor of Medicine, corresponding member of the National Academy of Sciences of Belarus, MD, professor, director of the State Institution «Belarusian Research Center for Pediatric Oncology, Hematology and Immunology». Contact information: aleinikova2004@mail. ru; 223053, Republic of Belarus, Minsk region, v. Borovlyani, Frunzenskaya street, 43.
Kravchuk Rimma Ivanovna — cand, Leading Researcher central scientific research laboratory, Department of Grodno State Medical University. Contact information: 230015, Republic of Belarus, Grodno, Gorkogo street, 80.
