CC BY
48
УдК 612:59:577.151.042
дмитрий мардас
младший научный сотрудник лаборатории физиологии функциональных систем института физиологии НАН Беларуси
Перспективы применения трутовых грибов для повышения устойчивости к действию экстремальных факторов
В настоящее время наблюдается повышенный интерес к системе протеолиза. Во многом это обусловлено выполнением протеолитическими ферментами многообразных регуляторных функций. Протеиназы регулируют ход метаболизма, а также процессы адаптации и защиты [1, 4, 20].
исходя из позиции теории функциональных систем П. Анохина [5], можно предположить, что активность протеиназ является важным фактором, определяющим степень сопряженности работы этих систем организма в различных условиях. главная роль в ограничении протеолитических процессов принадлежит ингибиторам протеиназ, которые обнаружены практически во всех органах и тканях. данные ингибиторы играют важную роль в защите организма от развития инфекции, при экстремальных состояниях, кровотечении, шоке и т.д. [1, 5]. известно, что в норме существует определенное равновесие между протеолитическими ферментами и их ингибиторами [1, 13].
Несмотря на большое количество работ об изменении активности этих системных регуляторов при разных состояниях, большая их часть выполнена in vitro, влияние высокой температуры окружающей среды на эти показатели оставалось сложной и нерешенной проблемой. Последняя еще больше усложнялась при попытке рассмотреть роль протеиназ и их ингибиторов в аспекте возможных корреляций с функциональным состоянием щи-
товиднои железы и ее гормонов, а также гормонов коркового вещества надпочечников. Эти вопросы актуальны для многих стран мира, поскольку стресс после экстремальных ситуаций обязательно затрагивает корковое вещество надпочечников и щитовидную железу [19].
В предыдущие годы были получены данные о том, что выраженные сдвиги баланса трипсина и его основных ингибиторов — альфа-1-антитрипсина и альфа-2-макроглобулина, а также концентрации кортикостерона в крови у крыс в сторону нарушения физиологических функций происходят через 6 часов действия холодового и в большей степени теплового стрессоров [9, 10]. Закономерно возникал вопрос: каким образом можно предупреждать или ослаблять эти сдвиги и их выраженность.
В настоящее время многие страны переходят на использование лекарственных средств, полученных из природной среды: растений, животных и других для повышения устойчивости организма к действию неблагоприятных факторов. известно, например, что прием экспериментальными животными зеленого чая не приводит к сдвигам в системе «протеиназы—ингибито-ры протеиназ» [21]. доступные литературные источники умалчивают об использовании с этой целью других водных экстрактов. По данным некоторых авторов [14], трутовые грибы, к которым относится березовый гриб чага, обладают более выраженной
адаптогенной активностью по сравнению с широко применяемыми природными адап-тогенами типа аралии, женьшеня и элеутерококка. Кроме того, экстракты трутовых грибов отвечают всем критериям, предъявляемым к адаптогенам [14]. Активными веществами чаги считаются водорастворимые пигменты, образующие хромогенный полифенолкарбоновый комплекс [7, 17]. В 1955 г. после всесторонних клинических
и химических испытании, проведенных П. Якимовым и П. Булатовым, чага была разрешена к применению фармкомитетом министерства здравоохранения ссср [17]. По критериям общетоксического воздействия было установлено, что экстракт чаги не токсичен [3]. В. Переверзевым, Е. Переверзевой, А. Кубарко, и. семененей и другими (патент № 4871539/14) выявлено, что экстракт чаги повышает устойчивость к стрессам [11]. так, внутрибрюшинное введение мышам экстракта чаги за полчаса до их погружения в горячую воду с температурой 70°с увеличивает выживаемость лабораторных животных. однако данный способ не позволяет оценить взаимодействие отдельных систем организма, способствующих поддержанию гомеостазиса при перегревании с целью попытки коррекции возможных нарушений в условиях до и после введения экстракта чаги.
Целью работы было дать оценку балансу протеиназ трипсина (тр) и ингибиторов протеиназ альфа-1-антитрипсина (ААт) и альфа-2-макроглобулина (амг), а также концентрации гормонов кортикостерона (Кс), тироксина (т4) и трийодтиронина (т3) при перегревании организма после предварительного, в течение 7 дней, приема лабораторными животными экстракта чаги.
материалы и методы исследования
опыты выполнены на 16 ненаркотизиро-ваннных крысах-самцах массой 190—210 г. Животные были разделены на 2 группы, контрольную и опытную (в каждой по 8 особей). Крысам опытной группы в течение 7 дней добавляли в поилки вместо воды приготовленный экстракт трутового гриба чаги в объеме 1 мл на 100 мл питьевой воды. Контрольная группа крыс не получала экстракта чаги. Затем животные опытной группы были подвергнуты перегреванию в суховоздушной термокамере при температуре 35°с в течение 6 часов. После декапи-тации крыс полученную плазму использовали для определения активности тр и ингибиторов протеиназ аат и амг по методу и. Корягиной и соавторов [8]. для дополнительной оценки выраженности протеолиза определяли содержание в плазме крови молекул средней массы (мсм) [2]. Концентрацию гормонов Кс, т4 и т3 определяли в сыворотке крови методом твердофазного
иммуноферментного анализа с помощью стандартных тест-наборов. Калибровочные пробы были приготовлены из сыворотки крови крыс по методу А. Прядко и соавторов [15]. температуру тела измеряли ректально с помощью электронного термометра мт-1831. Все полученные цифровые данные статистически обработаны с помощью ^итерия стьюдента.
результаты и обсуждение
Установлено, что после предварительного приема экспериментальными животными в течение 7 дней раствора чаги, после 6 часов перегревания температура тела достоверно повысилась на 2,50±0,03°с.
Анализируя действие тепла на организм, необходимо учитывать два возможных пути развития в нем последующих изменений. Прежде всего приходится считаться с непосредственным влиянием теплового фактора на клетки, органы и ткани. В то же время перегревание организма, характеризующегося гомойотермностью, обусловливает включение различных механизмов адаптации с последующим влиянием тех сдвигов, которые происходят вследствие борьбы организма за постоянство температуры тела [18]. Поэтому только зная сущность происходящих при стрессе явлений, можно способствовать принятию мер, обеспечивающих последующую адаптацию, поддержание гомеостазиса и профилактику развития патологических изменений. На этом основании стресс, адаптацию и функциональные нарушения необходимо рассматривать как единую проблему.
основоположник теории стресса г. селье определил это явление как реакцию напряжения, неспецифический ответ организма на действие чрезвычайных, неблагоприятных факторов среды — стрессоров, какими являются физические факторы внешней среды, различные болезнетворные агенты и прочие воздействия [5]. По его мнению, стресс, как общий адаптационный синдром, формируется при обязательном участии гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ггНс) и способствует активации защитных механизмов для предотвращения патогенного действия на организм неблагоприятных факторов. Ученый выделял 3 стадии изменений при стрессе, закономерно сменяющих друг друга: тревоги,
резистентности и истощения. В работах отечественных исследователей представления о природе стресса и его системных проявлений получили свое дальнейшее развитие [5, 18].
Поскольку известно, что стресс при действии экстремальных факторов обязательно затрагивает корковое вещество надпочечников [12, 16, 19], были проведены эксперименты по определению концентрации кортикостерона как показателя активности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы. Установлено, что после предварительного приема водного экстракта чаги лабораторными животными в условиях перегревания наблюдается тенденция к повышению концентрации этого гормона на 66,7 % по сравнению с контролем. В последнем его концентрация составляла 12,87 нмоль/л (рис. 1). В опытах с перегреванием, проведенных ранее [10], где экстракт чаги не применялся, концентрация Кс понизилась спустя 6 часов теплового воздействия (рис. 2).
5 «
г* ?
«
1 15
I 8
О
Я ~впегревачив
Рис. 1. Изменение концентрации КС в сыворотке крови у крыс после предварительного приема раствора чаги при перегревании (6 часов)
эо ^
щ
1 ав
ш
15 10 1 О
г.
г
□ Чеччрони Я Перегревание
Рис. 2. Изменение концентрации КС в сыворотке крови у крыс без предварительного приема раствора чаги при перегревании (6 часов)
Поскольку стресс-реакция включает разные системы, изучение роли глюкокортикоидов
и их взаимосвязей с другими системами является конструктивным подходом.
Важно было выяснить, какие изменения на фоне повышения концентрации КС в условиях стресса произойдут в системе «про-теиназы—ингибиторы протеиназ» и содержании МСМ. Последние, как известно, являются не только маркерами выраженности усиливающегося при перегревании протеолиза, но и оказывают влияние на жизнедеятельность всех систем и органов, так как по своему строению близки к регуляторным пептидам. Они способны соединяться и блокировать рецепторы любой клетки, неадекватно влияя на ее метаболизм и функции [2].
Содержание МСМ в плазме крови после 6 часов перегревания и предварительного приема лабораторными животными раствора чаги повысилось незначительно, на 11,3 % (Р<0,005) по сравнению с контролем (1,68±0,03 г/л) (рис. 3).
□ Контроль
(чвгаО
Рис. 3. Изменение концентрации МСМ в плазме крови у крыс после предварительного приема раствора чаги при перегревании (6 часов), ** - Р<0,05
Активность ТР в контроле была 12,67± 1,37нмоль/(с*л), а через 6 часов теплового воздействия и приема экстракта чаги достоверно понизилась на 58,9 % (Р<0,001) (рис. 4).
с
| 9
; 6 в
I в
□ КокЕраяъ
■ 11(! г рЛиЛ ми* |члп)
Рис. 4. Изменение активности ТР в плазме крови у крыс после предварительного приема раствора чаги при перегревании (6 часов), *** — Р<0,001
В исследованиях, где экстракт чаги не применялся, активность этой протеиназы также достоверно понизилась через 6 часов перегревания крыс на 43,4 % (Р<0,05) по сравнению с контролем (рис.5).
^ 10 I ,
I 6
й 4
У
I 3
I О
"1
□ Клирад^
Рис. 5. Изменение активности ТР в плазме крови у крыс без предварительного приема раствора чаги при перегревании (6 часов), * — Р<0,05
В контроле активность ААТ и АМГ составляла соответственно 14,09±0,55 и 0,89± 0,06 мкмоль/(с*л). После приема экстракта чаги и последующего перегревания активность ААТ повысилась на 38,6 % (Р<0,001), а таковая АМГ понизилась на 28,3% (Р< 0,05) (рис. 6), тогда как в предыдущих исследованиях с перегреванием [10], где раствор чаги не применялся, достоверных изменений активности ингибиторов протеи-наз выявлено не было (рис. 7).
р зв- 5 15. нм □ Кшп роль
п (ига)
1 и.
а * т >
я % й *
« О,
Рис. 6. Изменение активности ингибиторов протеиназ крови ААТ и АМГ в плазме крови у крыс после предварительного приема раствора чаги при перегревании (6 часов), * — Р<0,05, *** — Р<0,001, соответственно
Через 6 часов перегревания достоверных изменений концентрации тиреоидных гормонов также выявлено не было. Известно, что данные гормоны выполняют жизненно важные функции, поскольку стимулируют метаболизм во всем организме, в частности синтез белка [16, 19]. Кортикостероиды в свою очередь оказывают противоположный эффект, стимулируя процессы катаболизма [19]. Хотя ме-
ханизмы, лежащие в основе разнообразных эффектов тиреоидных гормонов, до конца не изучены, возможно, ингибиторы протеиназ и КС в условиях перегревания ограничивают их стимулирующее влияние на синтез белка, вследствие чего концентрация ТЗ и Т4 достоверно не изменялась. Из литературы также известно, что сдвиги в изменении концентрации тиреоидных гормонов характерны для острого стресса [16]. Другими словами, немаловажное значение в изменении содержания тиреоидных гормонов при стрессе имеет и временной интервал.
Рис. 7. Изменение активности ингибиторов протеиназ крови ААТ и АМГ в плазме крови у крыс без предварительного приема раствора чаги при перегревании (6 часов)
В ранее проведенных исследованиях с перегреванием крыс, где экстракт чаги не применялся, как это было описано выше, через 6 часов действия высокой внешней температуры наступало истощение приспособительных реакций, о чем свидетельствовали показатели трипсина и ингибиторов протеиназ, а также пониженный уровень КС (рис. 2, 7). После приема раствора чаги сдвиги в изучаемых показателях изменились в сторону повышения резервных возможностей организма (рис. 1, 4, 6). Так, повышение активности ААТ расценивается большинством авторов как защитная реакция организма при разных состояниях, направленная на поддержание гомеостазиса [1, 4, 10]. Понижение же активности АМГ при перегревании на фоне повышения таковой ААТ и повышения концентрации КС связано, вероятно, с тем обстоятельством, что этот регулятор системного действия быстро выводится из сосудистого русла вследствие взаимодействия с протеи-назами всех известных 4-х классов [1]. Например, константа скорости реакции
тр с Амг, по данным литературы, в 6 раз выше таковой с ААт [1, 6].
В данных, полученных ранее Ф. Висмон-том [2] при эндотоксиновой лихорадке, вызываемой внутрибрюшинным введением крысам пирогенала, концентрация мсм возрастала по сравнению с контролем на 23,1%. Эти данные в сопоставлении с результатами настоящего исследования с перегреванием косвенным образом могут свидетельствовать о том, что предвари-
тельный прием раствора чаги в условиях теплового стресса ограничивает процессы протеолиза.
таким образом, после предварительного приема в течение 7 дней экспериментальными животными раствора чаги в условиях 6 часового перегревания наблюдается активация коркового вещества надпочечников и ингибитора протеиназ крови ААт, что свидетельствует о повышении резервных возможностей организма, т.е. данное средство способствует
Литература_
1. Веремеенко К.Н., Коваленко В.Н. Системная энзимотерапия. Теоретические основы, опыт клинического применения. — К.: Морион, 2000. — 320 с.
2. Висмонт Ф.И., Шуст О.Г. Роль функциональной недостаточности печени в патогенезе эндотоксиновой лихорадки // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2000, т. 130, № 7. С. 23—25.
3. Гапаненко Е.В. Медико-биологическая оценка нового продукта питания на основе березового гриба чаги. Автореферат дис. ... канд. мед. наук. 1995. — 20 с.
4. Гешелин С.А., Вовчук С.В, Близнюк Б.Ф., Вирбанец В.Ф. Активность про-теолитической системы у больных раком молочной железы // Вопросы онкологии. 1989, № 10. С. 1191—1198.
5. Гурин А.В. Ингибиторы протеиназ и цитокины крови в механизмах гипертермии при стрессе. — Мн.: Технопринт, 2003. — 124 с.
6. Дорофейков В.В., Фрейдлин Т.С., Щербак И.Г. Альфа-2-макроглобулин как главный цитокин-связывающий белок плазмы крови // Медицинская иммунология. 1999, т. 1, № 5. С. 5—12.
7. Калашникова Е.А. Изучение химического состава и стандартизация сырья чаги и лекарственного препарата «Бефунгин». Автореферат дис. ... канд. фарм. наук. 2003. — 22 с.
8. Корягина И.Ю., Зарембский Р.А., Балябина М.Д. Использование метода комплексного определения активности трипсиноподобных протеиназ, агантитрипсина и а2-макроглобулина в гастроэнтерологической практике // Лабораторное дело. 1990. № 1. С. 72—73.
9. Мардас д.К. Влияние охлаждения на активность ингибиторов протеиназ и концентрацию кортикостерона и тиреоидных гормонов в крови у крыс // Новости медико-биологических наук (News of Biomed. Sci.). 2004, № 2, С. 56—59.
10. Мардас Д.К. Изменение активности ингибиторов протеиназ и концентрации кортикостерона и йодсодержащих тиреоидных гормонов в крови у крыс при перегревании // Новости медико-биологических наук (News of Biomed. Sci.). 2004, № 3, С. 28—33.
11. Переверзев В.А., Переверзева Е.В., Кубарко А.И., Семененя И.Н., Новиков В.П., Бутько Л.В., Хоменко А.И., Головко А.И. Вещество, повышающее стрессоустойчивость //А.с. 1813446 А1 СССР, МКИ5 А61 К 35/78. — № 4871539/14; Заявлено 08.10.90; Опубл. 07.05.93, Бюл. № 17. — описание к А.с. —12 с.
12. Мари Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: В 2-х т. Т. 2: пер. с англ. — М.: Мир, 2004. — 414 с.
13. Митюкова Т.А., Агуркова Ж.А., Дрозд В.М. и др. Активность трипсинопо-
выходу организма на новый гомеостатиче-ский уровень, повышая его устойчивость в условиях напряжения функций.
На основании полученных данных можно заключить, что применение экстракта чаги положительно влияет на работу систем «протеиназы—ингибиторы протеиназ» и «гипоталамус—гипофиз—кора надпочечников», тем самым повышая устойчивость организма млекопитающих к действию экстремальных стимулов.
добных протеиназ и их ингибиторов в сыворотке крови детей и подростков с карциномой щитовидной железы в послеоперационном периоде // Экологич. антропология. Ежегодник: Материалы VIII Междунар. научно-практ. конф. «Экология человека в постчернобыльский период». 2002. С. 234—237.
14. Переверзев В.А. Фунгоадаптогены: источники получения, биологическая активность, механизмы действия, перспективы применения. — Мн.: БГМУ, 2003. — 92 с.
15. Прядко А.Г., Шкуматов Л.М., Горох Г.А., Багель И.М. Определение концентрации тироксина в крови крыс с помощью радиоиммунологических наборов, предназначенных для определения уровня гормона в крови человека // Пробл. эндокринологии. 2000, т. 46, № 3. С. 28—31.
16. Рослый И.М., Абрамов С.В. Гипотеза: Адаптивное значение ферменте-мии // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2003, № 4. С. 5—9.
17. Турищев С.Н. Чага в медицине // Врач. 2004, № 11. C. 63—64.
18. Фурдуй Ф.И. Современные представления о физиологических механизмах развития стресса. Сборник научных трудов: Механизмы развития стресса. — Кишинев: Штиинца, 1987. C. 8—33.
19. Циммерман М., Ениг В., Вутке В. и др. Физиология человека. Т. 2, пер. с англ. Под ред. Р. Шмидта и Г. Тевса. — М.: Мир, 1996. — 313 с.
20. Шутов Е.В. Протеиназы и их ингибиторы у больных хронической почечной недостаточностью. Автореферат дис. ... канд. мед. наук. 1993. — 22 с.
21. Skrzydlewska E., Roszkowska A., Makiela M., Skrzydlewski Z. The influence of green tea on the activity of proteases and their inhibitors in plasma of rats after ethanol treatment // Rocz. Akad. Med. Bialymst. 2001,vol. 46. P. 240—250.
SUMMMARY
New data were obtained that, after preliminary application for 7 days of Ino-notus obliquus extract, heating at 35° C for 360 min increased the activity of the hypothalamic-pituitary-adrenocortical system, and of alpha-1-antitrypsin and decreased that of alpha-2-macroglobulin (both are blood proteinase inhibitors), which probably led to limitation of proteolysis. The results indicate that application of Inonotus obliquus extract enhances the reserve capacity of the organism under the exposure to high ambient temperatures and, thus, increases the resistance of mammals to heating.
