CC BY
18© Коллектив авторов, 2014 УДК 616.233-002.2-085.31:547.96]-036.8-092.4:577.2
ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ ТЕТРАПЕПТИДА В ЛЕЧЕНИИ ХРОНИЧЕСКОГО БРОНХИТА: МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ
В.Х. Хавинсон1, 2, член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, Г.А. Рыжак2, доктор медицинских наук, профессор, Н.С. Линькова2, 5, кандидат биологических наук,
В.В. Ашапкин3, кандидат биологических наук, А.О. Дробинцева4, кандидат биологических наук, В.С. Башарина2, Б.Ф. Ванюшин3, член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор
Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Российская Федерация, 199034, Санкт-Петербург, набережная Макарова, д. 6; 2Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии, Российская Федерация, 197110, Санкт-Петербург, проспект Динамо, д. 3; 3НИИфизико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Российская Федерация, 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1; 4Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта Северо-Западного отделения РАН, Российская Федерация, 199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3 Санкт-Петербургский государственный политехнический университет, Российская Федерация, 195251, Санкт-Петербург, ул. Политехническая, д. 29
E-mail: miayy@yandex.ru
Введение. Хронический бронхит относится к группе социально-значимых заболеваний. В связи с этим одной из задач молекулярной медицины является поиск новых, более эффективных и безопасных средств лечения этой патологии.
Цель работы. Изучение эффективности и механизма бронхопротекторного действия тетрапептида AEDL.
Материал и методы. В работе использовали метод клеточных культур, иммуноцитохимию и ПЦР-анализ.
Результаты. В культурах клеток бронхиального эпителия человека тетрапептид AEDL регулирует синтез белков Ki67, Mcl-1, p53, CD79, NOS-3. Это способствует активации процессов клеточного обновления и повышению функциональной активности клеток бронхиального эпителия. Тетрапептид активирует экспрессию генов дифференцировки бронхиального эпителия Nkx2.1, SCGB1A1, SCGB3A2, FoxA1, FoxA2, а также генов MUC4, MUC5АС, SftpA1, снижение экспрессии которых коррелирует с развитием хронического бронхита. Пептид AEDL эффективен и безопасен при пероральном применении в комплексном лечении пациентов с хроническим бронхитом в стадии ремиссии. После применения тетрапептида у больных нормализуются показатели внешнего дыхания.
Заключение. Тетрапептид AEDL эпигенетически регулирует экспрессию генов и синтез белков, участвующих в дифферен-цировке и поддержании функциональной активности бронхиального эпителия, что лежит в основе его бронхопротекторного действия.
Ключевые слова: тетрапептид AEDL, бронхиальный эпителий, сигнальные молекулы, гены, хронический бронхит
PROSPECTS OF TETRAPEPTIDE APPLICATION IN TREATMENT OF CHRONIC BRONCHITIS: MOLECULAR MECHANISMS V.Kh. Khavinson1,2, G.A. Ryzhak2, N.S. Linkova2,5, V.V. Ashapkin3, A.O. Drobintseva4, V.S. Basharina2, B.F. Vanyushin3
1I.P. Pavlov Institute of Physiology of RAS, Russian Federation, 199034, Saint-Petersburg, Makarova embarcment, 6;
2Saint-Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology, Russian Federation, 197110, Saint-Petersburg, Dinamo prospect, 3;
3Lomonosov Moscow State University, Russian Federation, 119991, Moscow, Leninskie Gory, 1;
4D.O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, Russian Federation, 199034, Saint-Petersburg, Mendeleevskaya line, 3
5Saint-Petersburg State Polytechnical University, 195251, Saint-Petersburg, Polytechnicheskaya, 29
Introduction. Chronic bronchitis is one of the socially significant diseases. Accordingly, a search of the new more effective and safe bronchoprotective drugs is the one of aims of molecular medicine.
The aim of the study. The goal of our research was the investigation of bronchoprotective effects and molecular mechanisms of biological activity of the AEDL tetrapeptide
Methods. There were used cell cultures method, immunocytochemistry and PCR analysis.
Results. AEDL tetrapeptide regulates Ki67, Mcl-1, p53, CD79, NOS-3 proteins synthesis in the bronchial epithelium cell cultures. It contributes to the activation of the cell renewal processes as well as to the increase in the functional activity of bronchial epithelial cells. The
AEDL tetrapeptide activates the expression of genes involved in bronchial epithelium differentiation, namely Nkx2.1, SCGB1A1, SCGB3A2, FoxA1 and FoxA2, as well as of the genes MUC4, MUC5АС, SftpA1, whose reduced expression is known to be related with the development of chronic bronchitis. The AEDL peptide has been proved to be effective and safe in the oral use in complex treatment of patients with chronic bronchitis in remission. The pulmonary function indices in these patients normalized after the AEDL tetrapeptide administration.
Conclusion. Thus, the AEDL tetrapeptide epigenetically regulates the gene expression and synthesis of proteins, participating in differentiation and functional activity of bronchial epithelium. This lies at the base of the bronchoprotective effect of this tetrapeptide.
Key words: AEDL tetrapeptide, bronchial epithelium, signaling molecules, gene expression, chronic bronchitis
Хронический бронхит (ХБ) — наиболее распространенное заболевание из группы хронических неспецифических заболеваний легких (ХНЗЛ), составляющее около 90%. Распространенность ХБ в России колеблется от 10 до 20%, а рост заболеваемости ХНЗЛ составляет 6—7% в год. При этом ХБ как причина выхода на инвалидность составляет 42,4% среди ХНЗЛ (27,3% больным сразу устанавливают 2-ю группу инвалидности), при этом 58% из них — лица моложе 50 лет. В России смертность от ХБ и его осложнений равна таковой от рака легких и ежегодно возрастает на 1,6%. Стандартная терапия ХБ включает прием антибактериальных, муколитических и иммуномодулиру-ющих средств, обладающих побочными эффектами и вызывающих аллергические реакции [1]. Кроме того, общепринятая тактика лечения ХБ часто не может быть применена из-за сопутствующих заболеваний [2, 3]. В связи с этим важной задачей молекулярной медицины является поиск веществ, физиологически нормализующих функциональную активность клеток бронхиального эпителия, имеющих высокую специфичность, эффективных в отношении ткани легких, не обладающих побочными эффектами. Это актуально при создании лекарств для лечения легочной патологии.
Результаты многолетних исследований пептидных биорегуляторов позволяют заключить, что активность пептидов является селективной или тканеспецифи-ческой [4, 5]. Установлены главные преимущества коротких пептидов: они обладают высокой биологической активностью, тканеспецифичностью, у них отсутствуют видоспецифичность и иммуногенность [4, 6, 7]. Эффекты, вызываемые пептидами, позволяет полагать, что некоторые из них влияют на активность генов [5, 6, 8—10].
Ранее было установлено, что пептидный препарат эпифиза эпиталамин эффективен в комплексном лечении бронхиальной астмы [11]. Новым средством, восстанавливающим функции легких при различной патологии, является тетрапептид AEDL — бронхоген [12]. Эффективность этого тетрапептида установлена в моделях острого воспаления легких в результате бактериального повреждения, при хроническом фиброзном воспалительном процессе и сублетальном гипероксическом повреждении легких. Все перечисленные патологии характеризуются существенными изменениями морфологии легких и клеточного состава бронхоальвеолярной жидкости (БАЖ). Выявлено увеличение количества нейтрофилов, лимфоцитов и уменьшение числа альвеолярных макрофагов. В мо-
дели острого воспаления легких у крыс показано, что при введении тетрапептида на 6-е сутки происходит нормализация состава БАЖ, увеличение массы тела, снижение бронхообструкции, блокирование процессов перикисного окисления липидов, восстановление синтеза сурфактанта. Все это свидетельствует о его противовоспалительном действии. Установлено, что бронхоген способствует нормализации клеточного состава ткани бронхов при различных патологических процессах и индуцирует экспрессию некоторых сигнальных молекул в клетках бронхиального эпителия [13].
В связи с этим целью работы были выявление молекулярных мишеней действия тетрапептида в бронхиальном эпителии и изучение эффективности перо-рального применения бронхогена у больных ХБ.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Для выявления молекулярных мишеней действия тетрапептида использовали эмбриональные культуры клеток бронхиального эпителия линии FLECH (НИИ гриппа МЗ РФ, Россия) 1, 7 и 14-го пассажей. 1-й пассаж расценивали как «молодые» культуры, 7-й пассаж — как «зрелые» культуры, 14-й пассаж — как «старые» культуры в соответствии с рекомендацией Международной ассоциации исследований клеточных культур (США, Сан-Франциско, 2007). Культуры клеток для иммуноцитохимического исследования разделяли на контрольную (добавление физиологического раствора) и экспериментальную (добавление тетрапептида в концентрации 20 нг/мл) группы. Клетки культивировали в чашках Петри диаметром 3,5 см, обработанных раствором желатина («Биолот», Россия) в СО2-инкубаторе в стандартных условиях (5% CO2, 37°С) в среде, содержащей 15% фетальной бычьей сыворотки, 82,5% и МЕМ, 1,5% HEPES-буфера с добавлением L-глутамина и 1% раствора пенициллина-стрептомицина. Для пересева клеток в соотношении 3:1 использовали раствор трипсин-версена. Добавление пептидов в среду осуществляли при каждом пассаже.
Для иммуноцитохимического исследования использовали первичные моноклональные антитела к Ki67 (1:50, Dako), Mcl-1 (1:40, Novocastra), p53 (1:25, Dako), CD79 (1:150, Vectorlab), NOS-3 (1:40, Leica) и вторичные антитела — биотинилированные антимышиные иммуноглобулины (Novocastra). Пермеа-билизацию проводили с применением 0,1% тритона х100. Визуализация реакции выполнялась с применением пероксидазы хрена и диаминобензидина
(EnVision Detection System, Peroxidase/DAB, Rabbit, Mouse). Данные сигнальные молекулы были выбраны для исследования в связи с тем, что они отражают функциональную активность и процессы клеточного обновления в ткани легких. Так, белок Ki67 — неспецифический маркер пролиферации клеток, снижение которого верифицировано при ХБ [14]. Протеин Mcl-1 является антиапоптотическим фактором семейства Bcl-2, снижение которого в бронхиальном эпителии наблюдается при гипоксии [15]. Белок p53 — проапоптотический протеин, повышение экспрессии которого в бронхиальном эпителии возрастает при воздействии неблагоприятных факторов внешней среды (загрязнение воздуха) и патологии легких (ХБ, рак) [15—17].
Трансмембранный гликопротеин CD79 выбран в качестве маркера воспалительных процессов и показателя локального иммунитета, поскольку известно, что он экспрессируется на некоторых эпителиальных клетках и В-лимфоцитах [18]. Снижение его экспрессии коррелирует с развитием аутоиммунной патологии [19]. Фермент NO-синтаза (NOS-3) катализирует выработку оксида азота, который является модулятором клеточного ответа в различных тканях, в том числе в бронхиальном эпителии. В сосудистой системе NO образуется и выделяется из эндотелия, индуцирует вазодилатацию, ин-гибирует агрегацию тромбоцитов, предотвращает адгезию нейтрофилов и тромбоцитов к эндотелию сосудов, ингибирует пролиферацию и миграцию клеток гладкой мускулатуры, регулирует апоптоз клеток и поддерживает функцию эндотелиального клеточного барьера [20].
Оценку результатов иммуноцитохимического окрашивания проводили морфометрическим методом с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Nikon Eclipse E400, цифровой камеры Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4 и программного обеспечения Vidеotest Morphology 5.2. В каждом случае анализировали 10 полей зрения при увеличении ><200. Площадь экспрессии рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах. Данный показатель характеризует интенсивность синтеза исследуемых сигнальных молекул в клетках.
Для изучения экспрессии генов использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с регистрацией в реальном времени. Стабилизацию РНК в клетках полученных культур и последующую очистку суммарной РНК осуществляли с помощью реагента RNAprotect Cell Reagent и набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) по рекомендации фирмы-производителя. Полученные образцы РНК использовали для синтеза первой нити кДНК с помощью затравки oligo(dT)18 («Синтол», Москва) и набора обратной транскрипции Omniscript RT
Kit (Qiagen, Германия) по рекомендации фирмы-производителя набора.
В качестве матрицы на каждую реакцию обратной транскрипции объемом 20 мкл использовали 1 мкг очищенной суммарной РНК. Полученную реакционную смесь использовали непосредственно как матрицу для ПЦР из расчета 1 мкл смеси на реакцию объемом 25 мкл. Количественную ПЦР в присутствии интеркалирующего флюоресцентного красителя SYBR Green I проводили с помощью набора QuantiFast SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Германия) и термоциклера CFX96 Real-Time PCR Detection System (BioRad Laboratories, Inc., США).
Статистическую обработку результатов и построение диаграмм осуществляли в автоматическом режиме с помощью программного обеспечения CFX Manager Software. В качестве внутреннего стандарта использовали мРНК GAPDH. Ее концентрацию во всех образцах принимали за 1. В экспериментах использовали по 3 независимых образца клеток каждой группы (биологические параллели). Для каждого образца кДНК проводили минимум 3 параллельные ПЦР в соседних лунках прибора (технические параллели). Конструирование олигонуклеотидных прайме-ров осуществляли с помощью онлайн-сервиса NCBI Primer-Blast. При этом использовали пары прайме-ров, один из которых соответствовал участкам 2 соседних экзонов. Для эксперимента были синтезированы соответствующие олигонуклеотиды («Синтол», Москва).
Для изучения влияния тетрапептида на экспрессию генов были выбраны те из них, которые играют важную роль в дифференцировке клеток бронхи -ального эпителия и реализуют их функциональную активность. Так, белок, кодируемый геном Nkx2.1, является фактором дифференцировки ранних предшественников клеток бронхиального эпителия [21, 22]. Известно, что нарушение регуляции экспрессии этого гена, связанное с патологией miRNA 365, приводит к развитию рака легких [23, 24]. Гены SCGB1A1 и SCGB3A2 кодируют соответствующие секретогло-бины, продуцируемые клетками легких и идентичные у всех млекопитающих. Недостаток их экспрессии приводит к развитию хронических воспалительных процессов в легких.
Кроме того, белок SCGB3A2 служит маркером ранних предшественников клеток воздухоносных путей. Его экспрессия регулируется продуктами генов Noth1 и Nkx2.1 [25, 26]. Продукт гена FoxA1 представляет собой фактор терминальной дифференциров-ки альвеолярных эпителиальных клеток и участвует в регуляции экспрессии секретоглобина SCGB1A1 [27]. Другой ген этой группы — FoxA2 — кодирует фактор дифференцировки эмбриональных тканей в легкие, поджелудочную железу, печень и нервную ткань. Важно отметить, что белок FoxA2 регулирует активность генов путем взаимодействия с гистонами [28, 29]. Группа генов MUC4, MUC5АС, SftpA1 участвует в реализации функциональной активности клеток
бронхиального эпителия. Белки МиС4 и МиС5АС секретируются эпителиоцитами воздухоносных путей и участвуют в образовании муцина, выполняю -щего защитную функцию. Нарушение экспрессии генов этих белков приводит к развитию воспалительных процессов. Кроме того, снижение экспрессии МиС4 является маркером онкологических заболеваний легких [30]. Белок БР-А1 (продукт гена БЛрА1) стимулирует фагоцитоз, продукцию фактора некроза опухоли-а, ингибирует секрецию сурфактанта. Уровень экспрессии БйрА1 коррелирует с показателями дыхательной функции (жизненной емкостью легких и объемом выдоха за 1 с) у больных ХБ. Нарушение транскрипции этого гена приводит к развитию аде-нокарциномы легких [31].
Эффективность перорального применения брон-хогена оценивали у 78 больных (женщин — 44, мужчин — 34 в возрасте 34—65 лет) ХБ с астматическим компонентом в стадии ремиссии. Все пациенты перед началом обследования подписывали информированное согласие на участие в исследовании. У больных отмечались характерные жалобы на кашель с мокротой, преимущественно в утренние часы, общую слабость, потливость, одышку при физической нагрузке, периодически возникающие приступы удушья, нарушение сна, головную боль.
Пациенты методом стратификационной рандомизации были разделены на 2 группы — контрольную и основную. Больные контрольной группы (11 женщин и 9 мужчин в возрасте от 36 до 65 лет) получали стандартную терапию. Пациенты основной группы (33 женщины и 25 мужчин в возрасте от 34 до 65 лет) дополнительно к стандартной терапии получали бронхоген (предприятие-изготовитель ООО ХБО при РАН «Фирма Вита», Санкт-Петербург, СГР №77.99.23.3.У.906.2.08) - по 2 капсулы (содержание активного вещества в 1 капсуле 0,1 мг) 2 раза в день утром и вечером во время еды в течение 30 дней. В динамике оценивали жалобы больных, проводили микроскопическое исследование мокроты, анализировали функцию внешнего дыхания.
Статистическая обработка экспериментальных и клинических данных включала подсчет среднего арифметического и среднеквадратичного отклонения для каждой выборки и проводили в программе «БШ^БЙса 7,0». Для проверки нулевой гипотезы о нормальности распределения данных в выборках использовали коэффициент ассиметрии (skewness), эксцесс (киГ^Б) и критерий Шапиро-Уилка. Для оценки равенства дисперсий исследуемых выборок использовали критерий Левена. Для выявления различий между группами пациентов использовали многофакторный дисперсионный анализ (multifactorial-ANOVA) с повторными измерениями. Для выявления различий в группах культур клеток применяли многофакторный дисперсионный анализ для несвязанных выборок. Различия между группами считали статистически значимыми при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Тетрапептид способствовал увеличению площади экспрессии Ю67 в молодых (3-й пассаж), зрелых (7-й пассаж) и старых (14-й пассаж) культурах клеток бронхиального эпителия соответственно на 55%; в 2,44 и 3, 42 раза (табл. 1, см. рисунок). Тетрапептид повышал площадь экспрессии Мс1-1 в молодых культурах — на 41%, в зрелых и старых клетках — на 89% (см. табл. 1). Кроме того, бронхоген снижал уровень апоптоза в культурах бронхиальных эпителиоцитов, оцениваемый по площади экспрессии белка р53.
Этот показатель снижался под действием те-трапептида на 38, 28 и 32% соответственно в молодых, зрелых и старых культурах клеток (табл. 2). Поскольку при клеточном старении (увеличение номера пассажа с 3 до 14) в контрольных культурах экспрессия р53 возрастала, способность бронхогена снижать уровень апоптоза также может быть одним из его геропротекторных механизмов. Тетрапептид повышал экспрессию трансмембранного гли-копротеина CD79, что указывает на способность этого пептида регулировать реакции локального иммунитета. Под действием тетрапептида площадь экспрессии маркера CD79 возрастала в молодых, зрелых и старых культурах клеток бронхиального эпителия соответственно на 18, 85 и 41% (см. табл. 1). Тетрапептид снижал экспрессию N08-3 — фермента, являющегося модулятором клеточного ответа в старых культурах клеток бронхиального эпителия (см. табл. 1).
В ходе дальнейшего исследования мы изучали влияние тетрапептида на экспрессию генов ранней и поздней дифференцировки клеток бронхиального эпителия, а также генов, вовлеченных в осуществление функциональной активности клеток бронхов. Выявлено, что бронхоген активирует экспрессию этих генов в молодых и зрелых культурах клеток, но не влияет на их экспрессию в старых. Под действием тетрапептида в молодых культурах клеток экспрессия гена Шл 2.1 и SCGB1A1 возрастала соответственно на 54% и в 2,67 раза по сравнению с показателями в контроле (см. табл. 2). В зрелых культурах бронхиального эпителия под влиянием тетрапептида повышалась экспрессия всех изученных генов — Шх 2.1, SCGB1A1, SCGB3A2соответственно на 62,5, 33 и 77% (см. табл. 2).
Таким образом, тетрапептид эпигенетически стимулирует ранние этапы дифференцировки клеток бронхиального эпителия. Еще более выраженный стимулирующий эффект тетрапептид оказывал на экспрессию генов поздней дифференцировки бронхиального эпителия. Так, в молодых культурах клеток тетрапептид повышал экспрессию гена ЕохА2 в 15,5 раза, а в зрелых стимулировал экспрессию генов ЕохА1 и ЕохА2 соответственно на 53% и в 2, 2 раза (табл. 3). Важно отметить, что продукт гена ¥охА1 регулирует активность секретоглобина БСОВ1А1.
Возможно, тетрапептид влияет только на ГохЛ1, а наблюдаемое повышение экспрессии БСОБ1Л1 является вторичным эффектом. С другой стороны, не исключено, что тетрапептид непосредственно активирует оба указанных гена. Кроме того, эпигенетическая регуляция тетрапептидом экспрессии ЕохЛ2, участвующего в дифференцировке и развитии различных тканей, может затрагивать фундаментальные основы онтогенеза. Ранее были получены данные о том, что тетрапептид способен связываться с линкер-ными и коровыми гистонами, из которых некоторые взаимодействуют с ЕохЛ2 [8—10]. Все эти данные позволяют предположить, что в механизм пептидной регуляции экспрессии генов и синтеза белка вовлечены сигнальные каскады, и этот процесс может иметь несколько стадий реализации на генетическом, субклеточном и клеточном уровнях. Тетрапептид также активировал экспрессию генов, снижение актив-
Таблица 1
ВЛИЯНИЕ БРОНХОГЕНА НА ПЛОЩАДЬ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКОВ -МАРКЕРОВ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК БРОНХИАЛЬНОГО ЭПИТЕЛИЯ
Маркер Группа Площадь экспрессии, %
3-й пассаж 7-й пассаж 14-й пассаж
Ю67 Контроль 4,21+0,05 4,15+0,07 4,07+0,12
Бронхоген 6,52+0,07* 10,12+0,34* 13,92+0,41*
Мс1-1 Контроль 2,63+0,07 2,41+0,06 2,38+0,09
Бронхоген 3,72+0,06* 4,55+0,13* 4,51+0,11*
р53 Контроль 4,82+0,09 5,31+0,13 5,96+0,23
Бронхоген 3,01+0,07* 4,14+0,11* 4,07+0,17*
CD79 Контроль 0,61+0,05 0,33+0,06 0,54+0,07
Бронхоген 0,72+0,09* 0,61+0,07* 0,76+0,06*
N08-3 Контроль 8,72+0,06 9,04+0,07 9,13+0,08
Бронхоген 8,65+0,09 9,11+0,10 8,31+0,09*
Примечание. * — р<0,05 по сравнению с соответствующим контролем (здесь и в табл. 2, 3).
0 . '
%
- \
\ Г ' ^ *
Л '
«
* ч
Влияние бронхогена на экспрессию белка Мс1-1 в клетках бронхиального эпителия человека линии ЕЬЕСН, 14-й пассаж; а — контроль, б — тетрапептид. Иммуноцитохимическое исследование, х200
ности которых коррелирует с развитием различных легочных патологий [30, 31]. В молодых культурах клеток экспрессия генов МиС5АС и 8АрЛ1 под действием тетрапептида возрастала соответственно на 50 и 65% (табл. 2). Тетрапептид также стимулировал экспрессию генов МиС4 и 8АрЛ1 в зрелых культурах клеток соответственно в 2,23 раза и на 67% (см. табл. 2). Полученные данные особенно важны, так как снижение экспрессии гена МиС4 верифицировано при онкологических заболеваниях. Уменьшение экспрессии МиС5АС приводит к недостаточному синтезу муцина и нарушению защитных механизмов в ткани легких от инфекции. Изменение синтеза белка БР-А1 (продукт гена 8АрЛ1) коррелирует с показателями дыхательной функции у больных ХБ. Таким образом, тетрапептид, активируя экспрессию генов МиС4, МиС5АС и 5/!рЛ1, может препятствовать развитию легочной патологии.
Применение бронхогена в дополнение к средствам общепринятой терапии у 86% больных ХБ с астматическим компонентом способствовало улучшению самочувствия, снижению частоты приступов кашля и удушья, уменьшению количества отделяемой мокроты, повышению физической работоспособности. Аускультация легких в динамике свидетельствовала об исчезновении или снижении выраженности сухих хрипов. Брон-хоген способствовал улучшению показателей внешнего дыхания (см. табл. 3). После проведения стандартной терапии в сочетании с бронхогеном жизненная емкость, общая емкость и экспираторная форсированная емкость легких достоверно возрастали соответственно на 13,2, 10,4 и 38,7% по сравнению с показателями до лечения. При этом у пациентов, получавших только стандартную терапию, достоверно повышалась только экспираторная форсированная емкость легких (см. табл. 3).
После применения бронхоге-на уменьшалось количество микроскопических структур мокро -ты (лейкоцитов, эпителиальных клеток, спиралей Куршмана), что свидетельствует о снижении воспалительных и бронхостатических проявлений заболевания. В процессе применения бронхогена у пациентов не выявлено побочных проявлений, осложнений, противопоказаний и лекарственной зависимости.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Молекулярный механизм биологической активности тетрапептида связан с его способностью регулировать синтез широкого спектра белков в бронхиальном эпителии человека, что подтверждает полученные ранее данные [13]. Тетрапептид специфически регулирует процессы клеточного обновления в бронхиальном эпителии через воздействие на белки Ki67, Мс1-1, р53 и функциональное состояние клеток посредством воздействия на белки CD79 и NOS-3. Одни эффекты тетрапептида более выражены в молодых культурах клеток, другие — в старых. Возможно, данное обстоятельство объясняется не одновременным снижением уровня синтеза указанных белков при клеточном старении. Установлено, что тетрапептид эпигенетически регулирует экспрессию генов, участвующих в дифференцировке бронхиального эпителия: Nkx2.1, SCGB1A1, SCGB3A2, FoxAl, FoxA2. Поскольку продукты некоторых из них взаимно регулируют экспрессию друг друга и, кроме того, взаимодействуют с гистонами, также являющимися мишенями действия тетрапептида, можно предположить, что пептид имеет одну ключевую или несколько независимых точек приложения в соответствующих сигнальных каскадах. Тетрапептид, активируя экспрессию генов MUC4, MUC5AC, SftpAl — маркеров функциональной активности клеток бронхиального эпителия, может препятствовать развитию легочной патологии. Это открывает перспективы для его дальнейшего исследования в качестве вещества, нормализующего функции дыхательной системы.
Бронхоген является эффективным и безопасным средством
в комплексном лечении больных ХБ, что позволяет рекомендовать его пероральное применение в случае нарушения функций легких и бронхов при хронических заболеваниях органов дыхания различного происхождения, а также для поддержания функции дыхательной системы в старших возрастных группах.
Исследование молекулярных механизмов действия тетрапептида и его клинической эффективности позволяет сделать вывод, что бронхоген эпигенетически регулирует экспрессию генов и синтез белков, участвующих в дифференцировке и поддержании функциональной активности бронхиального эпителия.
Таблица 2
ВЛИЯНИЕ ТЕТРАПЕПТИДА НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ БРОНХИАЛЬНОГО ЭПИТЕЛИЯ
Ген Группа Экспрессия гена, у.е.
3-й пассаж 7-й пассаж
Nkx2.1 Контроль 1,10+0,10 0,82+0,10
Бронхоген 1,75+0,20* 1,35+0,20*
SCGB1A1 Контроль 0,60+0,05 0,60+0,10
Бронхоген 1,55+0,10* 0,85+0,10*
SCGB3A2 Контроль 1,75+0,20 0,60+0,10
Бронхоген 1,60+0,20 1,20+0,10*
FoxA1 Контроль 1,95+0,15 0,90+0,10
Бронхоген 1,90+0,20 1,35+0,10*
FoxA2 Контроль 0,15+0,02 0,60+0,10
Бронхоген 1,55+0,10* 1,30+0,10*
MUC4 Контроль 2,00+0,20 0,75+0,15
Бронхоген 1,70+0,20 1,65+0,10*
MUC5AC Контроль 1,20+0,10 1,00+0,10
Бронхоген 1,80+0,20* 1,05+0,10
SftpA1 Контроль 1,00+0,10 0,90+0,05
Бронхоген 1,65+0,10* 1,50+0,10*
Таблица 3
ВЛИЯНИЕ БРОНХОГЕНА НА ПОКАЗАТЕЛИ ВНЕШНЕГО ДЫХАНИЯ У БОЛЬНЫХ ХБ С АСТМАТИЧЕСКИМ КОМПОНЕНТОМ
Показатель До лечения После лечения
контрольная группа основная группа контрольная группа основная группа
Жизненная емкость легких, мл 3735,6+274,4 3650,5+295,4 3805,3+276,7 4130,4+121,1*
Общая емкость легких, мл 4854,3+246,8 4812,4+254,10 5120,2+156,3 5300,5+171,8*
Экспираторная форсированная жизненная емкость легких, мл 2850,0+135,3 2740,7+120,3 3210,9+136,6* 3800,7+116,1*
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Федосеев Г.Б., Трофимов Б.И., Рогачева Н.Н., Разумовская Т.С. Роль нейтрофилов и бактериальной инфекции респираторного тракта у больных бронхиальной астмой и хронической обструктивной болезнью легких. Российский аллергологический журнал. 2011; 2: 34-43.
[Fedoseev G.B., Trofimov B.I., Rogacheva N.N., Razumovskaya T.S. Role of neu-trophiles and bacterial infection of respiratory tract of patients with bronchial asthma and chronic obstructive lung diseases. Rossiiskii allergologicheskii journal. 2011; 2: 34-43 (in Russian)]
2. Чучалин А.Г. Хроническая обструктивная болезнь легких и сопутствующие заболевания. Пульмонология. 2008; 2: 5-14.
[Chuchalin A.G. Chronic obstructive lung diseases and coexist diseases. Pulmonolo-gia. 2008; 2: 5-14 (in Russian)]
3. Чучалин А.Г., Цой А.Н., Архипов В.В. Дианостика и лечение пневмоний с позиций медицины доказательств. Врачебный консилиум. 2012; 4 (12): 620-6. [Chuchalin A.G., Zhou A.N., Archipov V.V. Diagnostics and treatment of lung flever by evidentiary medicine. Vrachebnij konsilium. 2012; 4 (12): 620-6 (in Russian)]
4. Anisimov V.N., Khavinson V.Kh. Peptide bioregulation of aging: results and prospects. Biogerontology. 2010; 11: 139-49.
5. Huang H., Kozekov I.D., Kozekova A., Rizzo C.J., McCullough A.K., Lloyd S.R., Stone M. Minor Groove Orientation of the KWKK Peptide Tethered via the N-terminal Amine to the Acrolein-Derived 1,N2- -Hydroxy-propanodeoxyguanosine Lesion with a Trimethylene Linkage. Biochemistry. 2010; 49: 6155-64.
6. Khavinson V.Kh., Malinin V.V. Gerontologi-cal aspects of genome peptide regulation. Karger AG, Basel. 2005; 29-131.
7. Ryan K.K., Seeley R.J. Physiology. Food as a hormone. Science. 2013; 339: 918-9.
8. Fedoreeva L.I., Kireev I.I., Khavinson V.Kh., Vanyushin B.F. Penetration of short fluorescence labeled peptides into the nucleus in HeLa cells and in vitro specific interaction of the peptides with deoxyribooligonucle-otides and DNA. Biochemistry. 2010; 76: 1210-9.
9. Fedoreeva L.I., Vanyushin B.F. CNG site-specific and methyl-sensitive endonuclease WEN1 from wheat seedlings. Biochemistry. 2011; 76 (6): 651-7.
10. Khavinson V.Kh., Fedoreeva L.I., Vanyushin B.F. Short Peptides Modulate the Effect
of Endonucleases of Wheat Seedling. Doklady Biochemistry and Biophysics. 2011; 437:64-7.
11. Евсюкова Е.В., Федосеев Г.Б., Петрищев Н.Н., Хавинсон В.Х. Патогенез, диагностика и эффективное лечение пептидами эпифиза аспириновой бронхиальной астмы. Пульмонология. 2003; 6: 57-61.
[Evsukova E.V., Fedoseev G.B., Petrishev N.N., Khavinson V.Kh. Patogenesis, diagnostics and effective bronchial asthma treatment by pineal peptides. Pulmonolo-gia. 2003; 6: 57-61(in Russian)]
12. Khavinson V.Kh., Ryzhak G.A., Grigoriev E.I., Ryadnova I.Yu. Peptide substance restoring respiratory organs function. US Patent US 7, 625, 870. 2009.
13. Khavinson V.Kh., Linkova N.S., V.O. Polya-kova, O.V. Kheifets, S.I. Tarnovskaya, I.M. Kvetnoy Peptides Tissue-Specifically Stimulate Cell Differentiation during Their Aging. Bull. Exp. Biol. Med. 2012; 153 (1):148-51.
14. Chiappara G., Gjomarkaj M., Virzi A., Sciar-rino S., Ferraro M., Bruno A., Montalbano A.M., Vitulo P.,. Minervini M.I., Pipitone L., Pace E. The role of p21 Waf1/Cip1 in large airway epithelium in smokers with and without COPD. Biochim Biophys Acta. 2013; 1832 (10): 1473-81.
15. Liu X.H., Tang C.S. Protection against ischemia-reperfusion injury: from bench to bedside. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 2006; 34 (8): 677-9.
16. Kamdar O., Le W., Zhang J., Ghio A.J., Rosen G.D., Upadhyay D. Air pollution induces enhanced mitochondrial oxidative stress in cystic fibrosis airway epithelium. FEBS Lett. 2008; 582 (25-26): 3601-66.
17. Porebska I., Wyrodek E., Kosacka M., Ada-miak J., Jankowska R., Har ozi ska-Szmyrka A. Apoptotic markers p53, Bcl-2 and Bax in primary lung cancer. In Vivo. 2006; 20 (5): P. 599-604.
18. O'Neill S.K., Getahun A., Gauld S.B., Merrell K.T., Tamir I., Smith M.J., Dal Porto J.M., Li Q.Z., Cambier J.C. Monophosphorylation of CD79a and CD79b ITAM motifs initiates a SHIP-1 phosphatase-mediated inhibitory signaling cascade required for B cell anergy. Immunity. 2011; 35 (5): 746-56.
19. Nakken B., Munthe L.A., Konttinen Y.T., Sandberg A.K., Szekanecz Z., Alex P., Szodoray P. B-cells and their targeting in rheumatoid arthritis--current concepts and future perspectives. Autoimmun Rev. 2011; 11 (1): 28-34.
20. Nawa A., Fujita-Hamabe W., Nakamoto K., Tokuyama S. Nitric oxide synthase-mediat-
ed alteration of intestinal P-glycoprotein under hyperglycemic stress. Yakugaku Zasshi. 2011; 131 (4): 487-92.
21. Yang Z., Hikosaka K., Sharkar M.T., Tama-koshi T., Chandra A., Wang B., Itakura T., Xue X., Uezato T., Kimura W., Miura N. The mouse forkhead gene Foxp2 modulates expression of the lung genes. Life Sci. 2010; 87 (1-2): 17-25.
22. Yuan B., Li C., Kimura S., Engelhardt R.T., Smith B.R., Minoo P. Inhibition of distal lung morphogenesis in Nkx2.1(-/-) embryos. Dev. Dyn. 2000; 217 (2): 180-90.
23. Kang S.M., Lee H.J., Cho J.Y. MicroRNA-365 regulates NKX2-1, a key mediator of lung cancer. Cancer Lett. 2013; 335 (2): 487-94.
24. Qi J., Rice S.J., Salzberg AC, Runkle EA, Liao J, Zander DS, Mu D. MiR-365 regulates lung cancer and developmental gene thyroid transcription factor 1. Cell Cycle. 2012; l (11): 177-86.
25. Kurotani R., Kumaki N., Naizhen X., Ward J.M., Linnoila R.I., Kimura S. Secretoglobin 3A2/uteroglobin-related protein 1 is a novel marker for pulmonary carcinoma in mice and humans. Lung Cancer. 2011; 71 (1): 42-8.
26. Kurotani R., Tomita T., Yang Q., Carlson B.A., Chen C., Kimura S. Role of secretoglobin 3A2 in lung development. Am J Respir Crit Care Med. 2008; 178 (4): 389-8.
27. Kido T., Tomita T., Okamoto M., Cai Y., Matsumoto Y., Vinson C., Maru Y., Kimura S. FOXA1 plays a role in regulating secre-toglobin 1a1 expression in the absence of CCAAT/enhancer binding protein activities in lung in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2011; 300 (3) : 441-52.
28. Li Z., Gadue P., Chen K., Jiao Y., Tuteja G., Schug J., Li W., Kaestner KH. Foxa2 and H2A.Z mediate nucleosome depletion during embryonic stem cell differentiation. Cell. 2012; 151 (7): 1608-1616.
29. Madeddu P. FoxA2 hunting research identifies the early trail of mesenchymal differentiation. Stem Cell Res Ther. 2013; 4 (2): 40.
30. Kwon K.Y., Ro J.Y., Singhal N., Killen D.E., Sienko A., Allen T.C., Zander D.S., Barrios R., Haque A., Cagle P.T. MUC4 expression in non-small cell lung carcinomas: relationship to tumor histology and patient survival. Arch Pathol Lab Med. 2007; 131 (4): 593-8.
31. Van Diemen C.C., Postma D.S., Aulchenko Y.S., Snijders P.J., Oostra B.A., Van Duijn C.M., Boezen H.M. Novel strategy to identify genetic risk factors for COPD severity: a genetic isolate. Eur Respir J. 2010; 35 (4): 768-75.
Поступила 15 ноября 2013 г.
Новости науки
ПРИ КАЖДОМ ПОЦЕЛУЕ ПЕРЕДАЕТСЯ 80 МЛН БАКТЕРИЙ
Каждый раз при длительном поцелуе от партнера партнеру передается огромное число бактерий. Такие данные были получены в Амстердаме при изучении микрофлоры ротовой полости 21 пары. После того, как были взяты мазки до и после поцелуя давно живущих вместе пар, значительных изменений
не обнаружено. Не очень значительные изменения в микрофлоре после поцелуя были у пар, имеющих одинаковые пищевые привычки и примерно одинаковый уровень жизни. После того, как один из партнеров выпил перед поцелуем йогурт, содержащий живые пробиотики, было установлено, что при каждом поцелуе передается >80 млн бактерий.
[МкгоЫотв 2014, 2:41-43]
