CC BY
48DOI: 10.26442/00403660.2020.04.000634 © Коллектив авторов, 2020
Перспективы клеточной терапии инфаркта миокарда и сердечной недостаточности на основе клеток кардиосфер
К.В. Дергилев1, Ю.Д. Василец1, З.И. иоколаева1,2, Е.С. Зубкова1, Е.В. Парфенова1,3
'ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии» Минздрава России, Москва, Россия; 2Научно-исследовательский институт обшей реаниматологии им. В.А. Неговского ФГБНУ «Федеральный научно-клинический центр реаниматологии и реабилитологии», Москва, Россия;
3ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», Москва, Россия Аннотация
Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной заболеваемости и смертности населения во всем мире. В последние годы внимание исследователей привлечено к использованию клеточной терапии на основе трансплантации стволовых клеток и клеток-предшественников, что явилось многообещающей стратегией восстановления сердца после повреждения. Однако проведенные исследования с использованием внутрикоронарной или внутримиокардиальной трансплантации разных типов стволовых/прогениторных клеток в виде клеточной суспензии показали весьма умеренную эффективность. Это обусловлено низкой степенью интеграции и выживаемости клеток после трансплантации. Для преодоления этих ограничений предложена концепция использования многоклеточных сфероидов, моделирующих естественное микроокружение клеток, что позволяет поддерживать их жизнеспособность и терапевтические свойства. Большой интерес представляет использование так называемых кардиальных сфероидов (кардиосфер) - самопроизвольно формирующихся в низкоадгезивных условиях трехмерных структур, состоящих из гетерогенной популяции прогениторных клеток миокарда и белков внеклеточного матрикса. В обзоре представлены данные о способах создания кардиосфер, направленной регуляции их свойств и репаративного потенциала, а также результаты доклинических и клинических исследований по их применению для лечения заболеваний сердца.
Ключевые слова: кардиосферы, клеточная терапия, регенерация сердца, инфаркт миокарда.
Для цитирования: Дергилев К.В., Василец Ю.Д., Цоколаева З.И. и др. Перспективы клеточной терапии инфаркта миокарда и сердечной недостаточности на основе клеток кардиосфер. Терапевтический архив. 2020; 92 (4): 111-120. DOI: 10.26442/00403660.2020.04.000634
Perspectives of cell therapy for myocardial infarction and heart failure based on cardiosphere cells
K.V. Dergilev1, lu.D. Vasilets1, Z.I. Tsokolaeva12, E.S. Zubkova1, E.V. Parfenova1,3 1National Medical Research Center for Cardiology, Moscow, Russia;
2Negovsky Scientific Research Institute of General Reanimatology of the Federal Research and Clinical Center of Intensive Care Medicine
and Rehabilitology, Moscow, Rassia;
3Lomonosov Moscow State University, Moscow, Rassia
Cardiovascular diseases are the leading cause of morbidity and mortality worldwide. In recent years, researchers are attracted to the use of cell therapy based on stem cell and progenitor cells, which has been a promising strategy for cardiac repair after injury. However, conducted research using intracoronary or intramyocardial transplantation of various types of stem/progenitor cells as a cell suspension showed modest efficiency. This is due to the low degree of integration and cell survival after transplantation. To overcome these limitations, the concept of the use of multicellular spheroids modeling the natural microenvironment of cells has been proposed, which allows maintaining their viability and therapeutic properties. It is of great interest to use so-called cardial spheroids (cardiospheres) - spontaneously forming three-dimensional structures under low-adhesive conditions, consisting of a heterogeneous population of myocardial progenitor cells and extracellular matrix proteins. This review presents data on methods for creating cardiospheres, directed regulation of their properties and reparative potential, as well as the results of preclinical and clinical studies on their use for the treatment of heart diseases.
Key words: cardiosphere, cell therapy, heart regeneration, myocardial infarction.
For citation: Dergilev K.V., Vasilets lu.D., Tsokolaeva Z.I., et al. Perspectives of cell therapy for myocardial infarction and heart failure based on cardiosphere cells. Therapeutic Archive. 2020; 92 (4): 111-120. DOI: 10.26442/00403660.2020.04.000634
ЛЖ - левый желудочек
МРТ - магнитно-резонансная томография
ФВЛЖ - фракция выброса ЛЖ
ХСН - хроническая сердечная недостаточность
ЭМП - эпителиально-мезенхимальный переход
pFGF (basic fibroblast growth factor) - фактор роста фибробластов
Введение
Несмотря на совершенствование терапевтических, эндо-васкулярных и хирургических методов лечения, сердечнососудистые заболевания продолжают лидировать среди причин инвалидности и смертности во всем мире. Важную проблему составляет сердечная недостаточность, которая является следствием многих кардиологических заболеваний
EGF (epidermal growth factor) - эпидермальный фактор роста IGF-1 (insulin-like growth factor 1) - инсулиноподобный фактор роста-1
MHC (major histocompatibility complex) - главный комплекс гистосовместимости
TGFp - трансформирующий фактор роста р
и характеризуется крайне плохим прогнозом, сравнимым с таковым у онкологических больных. Так, ежегодная смертность среди пациентов с хронической сердечной недостаточностью (ХСН) достигает 60%, и только 1/2 менее тяжелых больных выживают в течение 5 лет с момента постановки диагноза. В значительной степени это обусловлено отсутствием средств и методов, которые могли бы обеспечить возможность замещения утраченных клеток миокарда и ак-
тивации эндогенных регенеративных механизмов. В этом направлении особое внимание привлечено к клеточной терапии, с которой связывались большие надежны на восстановление утраченных клеток сердца. Однако первоначальная концепция, основанная на представлениях о вне-сердечных стволовых клетках, прежде всего клетках костного мозга, как клетках, способных дифференцироваться в кардиомиоциты и восстанавливать миокард, не получила своего подтверждения, а регенеративные эффекты клеток объяснялись их паракринной активностью - способностью секретировать коктейль биологически активных факторов и высвобождать внеклеточные везикулы, переносящие в клетки сердца мРНК и регуляторные микроРНК, запускающие в них регенеративную программу [1-3]. Но для проявления всех этих эффектов трансплантированные клетки должны сохранять жизнеспособность в течение более-менее длительного времени после трансплантации. Однако оказалось, что способ введения клеток в виде суспензии, который использовался при проведении первого поколения клеточной терапии, приводил к гибели значительного количества клеток, что не позволяло реализоваться их регенеративным эффектам. При этом совершенно не учитывалось, что стволовые/прогениторные клетки не функционируют автономно, а в органах и тканях располагаются и функционируют в специфическом микроокружении - «клеточных нишах», которые регулируют их функции непосредственными взаимодействиями с компонентами внеклеточного матрикса и окружающими клетками [4]. Совокупность всех этих сигналов сохраняет активность стволовых клеток, поддерживает возможность обмена стимулами с внешней средой, тем самым обеспечивая клеточный гомеостаз и обновление ткани. В связи с этим для поддержания жизнеспособности и функционирования стволовых клеток после трансплантации необходима разработка методов их культивирования и трансплантации, сохраняющих микроокружение, моделирующее хотя бы отчасти «клеточную нишу» ex vivo.
В большинстве проведенных исследований для лечения заболеваний сердца использовались суспензии мононукле-арных клеток костного мозга или периферической крови или клетки мезенхимного фенотипа (мезенхимные стро-мальные клетки костного мозга и жировой ткани, скелетные миобласты и др.), культивированные в 2D-условиях, т.е. в состоянии, значительно отличающемся от их микроокружения in vivo. В условиях 2D-культивирования не может быть обеспечена более естественная для клеток пространственная 3D-организация матрикса, взаимодействие с клетками, направленное воздействие сил поверхностного натяжения кле-
Сведения об авторах:
Василец Юлия Дмитриевна - лаборант-исследователь лаб. ангиогенеза Института экспериментальной кардиологии ФГБУ «НМИЦ кардиологии». ORCID: 0000-0002-6367-3785
Цоколаева Зоя Ивановна - ст. науч. сотр. лаб. ангиогенеза Института экспериментальной кардиологии ФГБУ «НМИЦ кардиологии», НИИ общей реаниматологии им. В.А. Неговского ФНКЦ РР. ORCID: 00000003-2441-6062
Зубкова Екатерина Сергеевна - мл. науч. сотр. лаб. ангиогенеза Института экспериментальной кардиологии ФГБУ «НМИЦ кардиологии». ORCID: 0000-0002-0512-3670
Парфенова Елена Викторовна - рук. лаб. ангиогенеза, дир. Института экспериментальной кардиологии ФГБУ «НМИЦ кардиологии», лаб. постгеномных технологий в медицине фак-та фундаментальной медицины ФГБОУ ВО «МГУ им. М.В. Ломоносова». ORCID: 0000-00020969-5780
точной мембраны, а также градиентов кислорода и факторов роста. Следствием этого могут быть нарушение основополагающих функций стволовых/прогениторных клеток, уменьшение или полная утрата их репаративного потенциала. К тому же перед введением в сердце клетки переводились в суспензию с помощью обработки протеолитическими ферментами, что нарушало межклеточные взаимодействия и способствовало апоптозу. Последующее попадание суспензии клеток в поврежденную ишемизированную ткань также не обеспечивало поддержания их жизнеспособности. Все это могло стать одной из причин неудовлетворительного эффекта клеточной терапии [5-7]. Преодоление этих проблем возможно путем использования многоклеточных сфероидов, которые обеспечивают трехмерное микроокружение и сохранение естественных межклеточных контактов, метаболического и секреторного регулирования. В данном обзоре представлены результаты исследований уникальной гетерогенной популяции прогени-торных клеток миокарда, которые способны самопроизвольно воссоздавать 3D-микроокружение, подобное «клеточным нишам» миокарда, и формировать сфероиды (кардиосферы), служащие инструментом для научных целей и клеточной терапии. В обзоре описаны способ создания таких 3D-конструкций, основы регуляции их свойств и ре-паративного потенциала, а также результаты доклинических и клинических исследований по их использованию для лечения заболеваний сердца.
Получение кардиосфер и кардиосферообразуюших клеток
Кардиосферы представляют собой 3D-сфероиды, имеющие высокий уровень компактизации и состоящие из клеток и белков внеклеточного матрикса. Технология их получения имеет сходство с методикой формирования нейросфер -сфероидов на основе нейральных клеток [8]. Классический алгоритм получения кардиосфер включает культивирование образцов миокарда в течение 14-28 дней в первичной экс-плантной культуре с последующей ферментативной обработкой для получения кардиосферообразующих клеток. Затем полученную суспензию клеток высаживают в низкоадгезионные условия на чашки с поли^-лизином, что приводит к образованию самоорганизующихся клеточных сфероидов. В центральной части сфероида локализуются клетки, экспрессирующие маркеры стволовых клеток Ой4 и с-кк, которые окружены клетками мезенхимного фенотипа (CD105+, CD73+) и сосудистыми/кардиальными клетками-предшественницами (Gata4+, Ресат+, SMA+); рис. 1, см. на цветной вклейке. Такая организация клеток в составе сфероидов возникает в результате действия множества факторов. Процесс самоорганизации сфероидов приводит к образованию как внешнего градиента для факторов в среде культивирования клеток (например, питательные вещества, кислород, факторы роста и др.), так и внутреннего градиента клеточных метаболитов и паракринных факторов за счет барьерной функции клеток, а также разного уровня потребления и производства этих факторов [9]. Помимо этого сформированный сфероид создает микроокружение, подоб-
Контактная информация:
Дергилев Константин Владимирович - вед. науч. сотр. лаб. ангиогенеза Института экспериментальной кардиологии ФГБУ «НМИЦ кардиологии». Тел.: +7(916)659-39-40; e-mail: doctorkote@gmail.com; ORCID: 0000-0003-2712-4997
ное кардиальной микросреде in vivo, что обеспечивает более сложные межклеточные взаимодействия и межклеточные контакты, служащие для одновременной доставки дополнительных сигналов, включая механические и биохимические стимулы, которые могут влиять на форму клеток, подвижность, пролиферацию и дифференцировку, а также на экспрессию генов [10, 11]. Немаловажным условием правильной сборки сфероидов являются плотность исходной посадки кардиосферообразующих клеток и время культивирования, что позволяет манипулировать размером сфероидов, обеспечивая некоторую стандартизацию при подготовке клеточного препарата. Кардиосферы размером более 150 мкм при внутрикоронарном введении могут вызывать микрососудистую непроходимость, что существенно ограничивает возможности их применения. Увеличение плотности посадки клеток (с 0,25 до 1,5х106 клеток/75 см2 флакон) связано с более высокой долей сфероидов размером более 50 мкм, тогда как более длительное время культивирования в основном увеличивает процент очень крупных сфероидов (>150 мкм). Поэтому высокая плотность посева (20х103 КОК/см2) и короткая продолжительность культивирования (48 ч) считаются оптимальными для производства кардиосфер [12]. Вторым важным условием формирования сфероидов является состав среды культивирования, которая включает фетальную сыворотку теленка, эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (pFGF), тромбин и комплексную добавку B27, включающую витамины, антиоксиданты, незаменимые жирные кислоты и гормоны (инсулин, прогестерон, трийодтиронин), которые способствуют увеличению числа образовавшихся кардиосфер [13-17]. Следует также отметить, что в настоящий момент разработаны и активно используются методы получения сфероидов и кардиосферообразующих клеток в соответствии с принципами надлежащей производственной практики (GMPs) без применения ксеногенных добавок, например фетальной сыворотки теленка, которая несет риск заражения инфекционными вирусными/прионными агентами и возможной активации иммунного ответа после трансплантации [18, 19].
Регуляция состояния клеток в составе сфероидов
Если учесть структурную организацию сфероидов, то с определенной долей допущения можно предположить, что она моделирует соответствующее микроокружение, которое характерно для «клеточных ниш». В ее состав входят белки внеклеточного матрикса, формирующие каркас-вместилище для низкодифференцированных клеток, мезенхимных стро-мальных клеток, а также кардиомиоцитарных и васкулоген-ных клеток-предшественниц. Такая структурная организация обеспечивает взаимодействие этих компонентов между собой и регулирует индивидуальные функции каждой клетки, что характерно для «клеточных ниш» разных тканей, в том числе сердца. Наиболее сходные характеристики со сфероидами отмечаются в эпикардиальных «клеточных нишах», активность которых контролируется с помощью эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) - биологического процесса, который участвует в эмбриогенезе, воспалении, фиброзе, заживлении ран и канцерогенезе [20]. Образование сфероидов сопряжено с изменением функциональных и фенотипических свойств клеток в результате активации ЭМП [21]. В первичных и вторичных кардиосферах экспрессия генов, ассоциированных с ЭМП (SNAI1, TGFBR2 и SNAI2), значительно выше, чем в клетках, образующих
кардиосферы, но культивируемых в 2D-условиях. Добавление в среду культивирования мастер-регулятора ЭМП трансформирующего фактора роста в (TGFP) ускоряло сборку кардиосфер и увеличивало их количество, в то время как ингибирование TGFP-рецептора нарушало сферообра-зование и приводило к «разборке» уже существующих сфероидов [22]. Вероятно, активация ЭМП может способствовать приобретению клетками промиграционного фенотипа, развитию цитоскелета, который позволяет создать такую силу поверхностного натяжения, которая обеспечивает самую экономичную в энергетическом отношении шаровидную форму и минимизацию объема формирующегося сфероида. Формирование такой высококомпактной структуры способствует взаимодействию рецепторов на поверхности клеток с сигнальными молекулами, что приводит к изменению свойств и клеточного состава сфероидов. Оказалось, что сигнальный путь Notch, участвующий в регуляции ЭМП и свойств разных типов клеток, регулирует рост сфероидов. Рецепторы Notch 1 и 2-го типов расположены диффузно на поверхности клеток, в то время как лиганды Jaggedl и Delta-likel экспрессированы клетками, расположенными во внешнем слое сфер, что косвенно указывает на наличие высокоспецифичной организации в составе сферы клеток разных типов [23]. Стимуляция сигнального пути Notch растворимым лигандом Jagged1, а также обработка клеток аденоассоциированными вирусами, кодирующими N1ICD (эффекторный домен рецептора Notchl) и Jaggedl, вызывали значительное увеличение количества, размеров сфероидов и активацию кардиогенных генов. В то время как блокирование активности Notch-сигналинга путем ингиби-рования процессинга у-секретазы с помощью DAPT оказывало обратный эффект. Показано, что формирование CD117+ кардиосферообразующих клеток происходит в значительной степени за счет ЭМП [24]. При этом активация сигнального пути Notch сопровождается утратой низ-кодифференцированного состояния клеток и запуском дифференцировки. Эти данные хорошо согласуются с особенностями регуляции эпикардиальной «клеточной ниши», в которой передача сигналов Notch стимулирует ЭМП в клетках мезотелия [25, 26], что ведет к образованию CD117+ клеток и поддержанию их низкодифференцирован-ного состояния [27]. В регуляции ЭМП, процессов сборки сфероидов и их репаративных свойств участвуют в-адре-норецепторы. Показано, что добавление в среду культивирования в-адреноблокаторов увеличивает адгезивные свойства миокардиальных эксплантов, способствует увеличению кардиосферообразующих клеток и повышает эффективность сборки сфероидов [28]. Обработка кардиосферообразующих клеток в-адреноблокаторами in vitro способствовала повышению их миграционных свойств и способности к сферообразованию, что обусловлено активацией ЭМП. Более того, после такого воздействия клетки кардиосфер содержали более низкий процент CD90+ мезен-химных клеток, более высокое соотношение коллаген Ш/коллаген I, более низкий уровень провоспалительных ци-токинов, что указывало на высокий антифиброзный и терапевтический потенциал популяции кардиосфер. Помимо обеспечения условий для взаимодействия клеток между собой, с компонентами матрикса и секретируемыми факторами в регуляции состояния кардиосфер принимают участие физические и метаболические факторы. Во внешних клеточных слоях сфероида по направлению к «ядру» создаются градиент факторов и сниженное парциальное давление кислорода, что позволяет создавать уникальную микросреду, необходимую для сохранения свойств клеток.
Такой механизм регуляции указывает на общие черты с механизмами самоподдержания клеточного гомеостаза в «нишах» стволовых клеток разных тканей [18]. В условиях гипоксии происходят стабилизация а-субъединицы фактора, индуцируемого гипоксией, - HIF (hypoxia-induced factor), ее димеризация и последующий транспорт в ядро, где она регулирует широкий спектр генов, участвующих в процессах клеточного поведения. В условиях гипоксии усиливается выживаемость клеток, образующих сфероиды, они вступают в клеточный цикл, что ведет к увеличению числа прогениторных клеток (CD117+, Sca-1+, Abcg2+) и увеличению размеров сфероидов [29]. Учитывая важную роль гипоксии в регуляции TGFP-сигнального пути и ЭМП [30], возможно, именно такой тип трансформации ответствен за формирование малодифференцированных клеток [31]. Поскольку HIF-1 контролирует транскрипцию генов-регуляторов ангиогенеза, при культивировании кардиосфер в условиях низкого содержания кислорода (3% O2) наблюдается усиление секреции VEGF и HGF, что значительно увеличивает проангиогенную активность этих клеток [32]. Необходимо отметить, что первичные кардиосферы имеют ряд существенных отличий от вторичных (полученных после дополнительного этапа культивирования в 2D-усло-виях - разборки и повторной сборки кардиосфер) [33, 34]. Первичные кардиосферы характеризуются высоким уровнем секреции ангиогенных факторов VEGF и HGF, а также инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1). В то же время во вторичных кардиосферах секреция HGF и IGF-1 снижается, но повышается содержание низкодифференцирован-ных Oct4+ и CD117+ клеток [35]. Возможной причиной такого изменения свойств сфероидов после их разборки и повторной сборки является изменение активности ЭМП, что ведет к переключению между образованием мезенхим-ных CD105+ клеток и CD117+ прогениторных клеток [36]. Оказалось, что экспрессия мезенхимного маркера CD105 (эндоглина), являющегося рецептором цитокинов семейства TGFP, на поверхности клеток кардиосфер может регулировать активность ЭМП путем воздействия на Alk1/Alk5-сигнальные механизмы. Уменьшение количества CD105+ клеток ведет к снижению секреции всех проангиогенных факторов роста (за исключением VEGF) и подавлению про-ангиогенной активности сфероидов in vitro и in vivo [36]. Воздействуя на сигнальные пути, в частности на сигнальный путь ERK, можно манипулировать фенотипом кардиосфер. Ингибирование пути ERK за счет ингибирования рецептора тирозинкиназы-1 и TGFP приводило к увеличению экспрессии транскрипционного фактора Oct4 и уменьшению продукции VEGF клетками кардиосфер. И наоборот, при стимуляции пути ERK с помощью EGF, PFGF и VEGF наблюдалось увеличение секреторной активности клеток кардиосфер. Эффекты двух методов обработки подтверждены in vivo после трансплантации вторичных кардиосфер на модели инфаркта миокарда [37]. Таким образом, изменяя воздействие на кардиосферы в процессе их культивирования, можно влиять на их регенеративный потенциал, увеличивая либо паракринную активность, либо содержание низкодифференцированных клеток.
Обобщая изложенное, необходимо подчеркнуть, что сформированные из клеток кардиальных эксплантов сфероиды являются весьма динамичными структурами, обеспечивающими межклеточные взаимодействия и индивидуальную регуляцию активности ЭМП, приводящую к изменению фенотипа, поддержанию «стволовости» клеток в их составе и их паракринной активности.
Способы трансплантации кардиосфер и клеток кардиосфер
Использование трансплантации прогениторных клеток сердца в виде клеточных сфероидов - кардиосфер представляет собой альтернативный способ клеточной терапии, позволяющий трансплантировать клетки в составе своего микроокружения, что существенно повышает их выживаемость и, следовательно, эффективность такого вида лечения по сравнению с традиционной трансплантацией суспензии клеток, культивированных в 2D-условиях. На сегодняшний день проведены многочисленные доклинические исследования по трансплантации кардиосфер и кардиосферообразую-щих клеток как путем интракоронарного, системного и интрамиокардиального введения, так и эпикардиальной трансплантации тканеинженерных конструкций в виде пластов клеток, клеток в составе носителя (матрикса), а также введение клеток в комбинации с факторами роста, способствующими их выживаемости. Существующий опыт внут-рикоронарного введения сфероидов в ходе проведения стентирования [38] показал, что, несмотря на значительный размер сфероидов (от 20 до 150 мкм), не отмечалось развития каких-либо осложнений. Причем введение могло быть выполнено с использованием как методики «stop-flow», так и постоянного введения «сontinuous-flow» в один или несколько коронарных сосудов с сопоставимой эффективностью [12, 39]. Для обеспечения дополнительной безопасности и предотвращения микрососудистой окклюзии разработан протокол интракоронарного введения кардио-сфер или клеток кардиосфер в фосфатно-солевом буфере без ионов кальция с добавлением гепарина и нитроглицерина [40]. Альтернативными способами является трансплантация кардиосфер в составе синтетических носителей [41] или сформированных in vitro клеточных пластов («cell sheet»), состоящих из клеток кардиосфер и наработанного ими внеклеточного матрикса. Такие клеточные пласты, своеобразные клеточные пластыри, трансплантируются во время моделирования инфаркта у экспериментальных животных прямо на эпикардиальную поверхность сердца на область инфаркта, что приводит к значительной стимуляции ангио-генеза в периинфарктной зоне, уменьшению постинфарктного ремоделирования и повышению выживаемости животных, что обусловлено скорее всего паракринными эффектами клеток кардиосфер, которые длительно сохраняют свою жизнеспособность и функциональную активность при таком способе трансплантации. Выживаемость и функциональная активность клеток кардиосфер может быть дополнительно повышена путем их метаболического прекондиционирования - культивирования в условиях гипоксии [42]. Показано, что эпикардиальная трансплантация пластов из клеток кардиосфер приводит к более значительным улучшениям функции левого желудочка (ЛЖ), повышению уровня VEGF и уменьшению постинфарктного фиброза по сравнению с трансплантацией пластов из кар-диосфер, культивированных в нормоксических условиях.
Еще одним вариантом доставки клеток кардиосфер является их введение в полость перикарда, что рассматривается в качестве перспективного способа локального воздействия на эпикард при диффузных поражениях миокарда [43]. Такой способ доставки обеспечивает равномерное распределение кардиосфер или их клеток по поверхности сердца, длительное сохранение их жизнеспособности и паракринной активности.
Помимо самих кардиосфер большие перспективы в плане терапии заболеваний сердца связывают с использова-
нием продуктов их жизнедеятельности - так называемой клеточной терапией без клеток (cell therapy without cells). В основе ее лежит использование продуктов секреции кар-диосфер и высвобождаемых ими внеклеточных нановези-кул - экзосом, которые в значительной степени отвечают за их терапевтическую эффективность [33]. Секретом кар-диосфер богат многочисленными факторами роста и цито-кинами (VEGF, вFGF, PDGFBB, HGF, IGF-1, SDF-1 и др.), играющими важную роль в регенеративных процессах. Использование продуктов секреции клеток кардиосфер при доказанных регенеративных эффектах не сопровождается развитием каких-либо побочных реакций, что позволяет применять их для лечения не только поражений миокарда
[44], но и других патологий, включая мышечную дистрофию
[45], ишемический инсульт [46], поражения кожи [47, 48] и почек [49]. Особый интерес вызывает использование экзо-сом, высвобождаемых клетками кардиосфер. Введение этих экзосом в миокард мышей с инфарктом эффективно восстанавливало функцию сердца, увеличивало долю жизнеспособного миокарда и уменьшало область рубца, стимулировало репаративный ангиогенез, подавляло воспаление и увеличивало пролиферацию кардиомиоцитов [50]. Это действие было специфично для экзосом клеток кардио-сфер, так как экзосомы, полученные из сердечных фибро-бластов, не обладали подобными эффектами, которые обусловлены уникальным составом микроРНК в экзосомах кардиосфер, в частности высоким содержанием микроРНК 146а, регулирующей пролиферацию кардиомиоцитов, ан-гиогенез и воспаление. Следует подчеркнуть, что состав микроРНК экзосом кардиосфер значительно отличался от состава микроРНК экзосом сердечных фибробластов именно наличием тех микроРНК, которые задействованы в регуляции регенеративных процессов. Все это делает продукты секреции и внеклеточные везикулы кардиосфер крайне привлекательным новым «инструментом» для терапии заболеваний сердца. С учетом данных о том, что алло-генные кардиосферы обладают регенеративными свойствами и не вызывают тяжелых иммунных реакций, а также того, что кардиосферы могут быть получены и из постмортальных образцов ткани миокарда [51, 52], открываются перспективы создания аллогенных биомедицинских клеточных и бесклеточных продуктов на основе кардиосфер «on shelf».
Доклинические и клинические испытания клеточной терапии на основе кардиосфер
За последние 15 лет исследования регенеративных свойств кардиосфер и их клеток прошли долгий, сложный путь, включающий работы in vitro по оптимизации методов культивирования клеток, доклинические исследования на мелких животных (для доказательства концепции) и исследования на крупных животных (для подтверждения концепции, оптимизации дозировки, состава и способа доставки), прежде чем перейти к полноценному клиническому исследованию на пациентах с постинфарктной сердечной недостаточностью. Но перед началом рассмотрения эффектов терапии клетками кардиосфер необходимо остановиться на понятии «ремоделирование», которое сопутствует инфаркту миокарда. Ремоделирование ЛЖ рассматривается как универсальная компенсаторно-приспособительная реакция, включающая изменение компонентов внеклеточного мат-рикса, объема и функций кардиомиоцитов, архитектоники и геометрии полости ЛЖ, которые находятся под контролем
нейрогуморальных, механических и генетических факторов [53]. Патологическое ремоделирование является неотъемлемым компонентом развития постинфарктной ХСН, мишенями этого процесса служат компоненты внеклеточного матрикса, а также кардиомиоциты и клетки стромы. Выраженное нарушение процессов синтеза и деградации белков внеклеточного матрикса приводит к формированию «патологического микроокружения», которое нарушает естественные процессы репарации и ведет к нарушению структуры и изменению функции ЛЖ. Кроме того, скорость формирования сосудистой сети после инфаркта недостаточна для обеспечения адекватной перфузии миокарда, необходимой для удовлетворения потребностей гипертрофированной сохраненной стенки миокарда, что приводит к дальнейшей потере кардиомиоцитов и образованию фиброзной ткани [54]. Поэтому проангиогенные, анти-фибротические и антивоспалительные эффекты клеточной терапии выходят на первый план для замедления патологического ремоделирования, что необходимо для обеспечения эффективного лечения постинфарктной сердечной недостаточности. В доклинических исследованиях показано, что трансплантация кардиосфер приводит к уменьшению площади рубцовой ткани и увеличению зоны жизнеспособного миокарда [12]. Впечатляющие результаты по подавлению постинфарктного ремоделирования получены на моделях ХСН как у мелких (грызунов), так и у крупных животных (мини-свиней) [55, 56], что приводило к предотвращению прогрессирующей потери насосной функции сердца. Кроме того, наблюдались улучшение региональной сократимости стенки ЛЖ и уменьшение фиброза как в инфарктной области, так и в неповрежденных участках миокарда. Все это указывает на положительное влияние на неблагоприятное глобальное ремоделирование, а не только на уменьшение площади рубца в области инфаркта. Эти «глобальные» эффекты на ремоделирование ЛЖ и фиброз могут быть связаны с более высоким уровнем интеграции и выживаемости трансплантированных клеток кардиосфер. Длительное обеспечение жизнеспособности кардиосфер обусловлено сбалансированной комбинацией белков внеклеточного матрикса и клеток, которые упакованы в составе сфероида в достаточно высокой плотности, что позволяет реализоваться их регенеративным свойствам. Кроме того, клетки кардиосфер способны продуцировать ферменты-регуляторы гомеостаза компонентов матрикса - матриксные металлопротеиназы и растворимую форму эндоглина, который ингибирует TGFpl-индуцированный фиброз [32-34, 38, 57-59]. Доклинические исследования также демонстрируют мягкий, кратковременный иммунный ответ на аллогенные кардиосферы без какого-либо явного отторжения или реакции клеток памяти [56, 60]. Это может быть объяснено тем, что клетки кардиосфер несут на своей поверхности молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС) I, но не экспресси-руют МНС II и костимулирующие молекулы [51, 61]. Экспрессия МНС I важна, потому что данный антиген защищает клетки от уничтожения естественными киллерами ^К-клетками), в то время как отсутствие МНС II позволяет клеткам кардиосфер избежать прямого распознавания Т-хелперами. МНС I может активировать эффекторные Т-клетки, но при отсутствии костимулирующих молекул вторичный сигнал не будет задействован [62]. Кроме того, клетки кардиосфер экспрессируют на своей мембране ли-ганд рецептора программируемой клеточной гибели 1 (PD-L1), что определяет их иммуносупрессивные свойства [63]. При введении крысам аллогенных клеток кардиосфер наблюдалось снижение уровня провоспалительных и про-
фибротических цитокинов (MCP-1, IL-6, TNFa, TIMP-1), а также количества CD68+ макрофагов и CD45+ лейкоцитов, которые связаны с прогрессированием ХСН [64]. Секреция кардиосферами простагландина E2, действующего через ЕР4-рецептор на лимфоцитах, также способствовала подавлению развития иммунного ответа на аллогенные клетки [65]. Более того, клетки кардиосфер и высвобождаемые ими факторы стимулируют макрофагопосредованную кардиопротекцию путем специфического переключения фенотипа макрофагов с провоспалительного М^фенотипа на репаративный М2-фенотип [66, 67]. Такие выраженные им-муномодулирующие свойства позволили использовать кар-диосферы для лечения экспериментального аутоиммунного миокардита. Интракоронарное введение клеток кардиосфер уменьшало воспаление миокарда, инфильтрацию Т-клеток и фиброз, сохраняя сердечную функцию и структуру миокарда у крыс с моделью аутоиммунного миокардита [68]. Несмотря на способность формировать соответствующее микроокружение, противодействовать факторам воспаления и оксидативного стресса, обеспечивая выживаемость клеток кардиосфер после трансплантации, только крайне небольшая их часть способна вступать в дифференцировку с образованием новых кардиомиоцитов и клеток сосудов [33, 51]. Таким образом, терапевтический эффект кардиосфер обусловлен в значительной степени влиянием продуктов их секреции и высвобождаемыми ими везикулами, нежели их прямой дифференцировкой в направлении клеток миокарда [32, 33]. Именно уникальная паракринная функция кардио-сфер является основополагающей для запуска эндогенной «программы» регенерации путем стимулирования ангиоге-неза, подавления воспаления, аккумуляции эндогенных кар-диальных клеток-предшественниц и обеспечения выживаемости и пролиферации резидентных кардиомиоци-тов в периинфарктной области [33, 51, 69, 70]. В ряде работ убедительно доказано, что секреция кардиосферами таких факторов, как SDF-1, IGF1 и HGF, стимулирует мобилизацию циркулирующих и резидентных прогениторных клеток в поврежденном миокарде [33, 71], что в совокупности с проангиогенным действием VEGF [32] ведет к формированию новой сосудистой сети [58]. Помимо этого HGF и IGF1 активируют в кардиомиоцитах сигнальный путь Akt, подавляющий их апоптоз и обеспечивающий выживаемость [32, 33], поддержание энергетического баланса митохондрий [72] и пролиферацию кардиомиоцитов [58, 73]. Все это в совокупности способствует сохранению жизнеспособного миокарда после ишемического повреждения. Немаловажную роль играет также контактное взаимодействие кардиомио-цитов с клетками кардиосфер и наработанным ими матрик-сом, что может приводить к запуску их пролиферации через MEK- и Р13К-сигнальные механизмы [74]. Кроме того, как уже упомянуто, кардиосферы высвобождают экзосомы, обогащенные различными микроРНК, обеспечивающими активацию репаративной программы сердца [2, 50, 75]. Такими микроРНК являются: miR-146a и miR-181b с кардио-протективным действием, miR-210 с антиапоптотическим эффектом, miR-132 с проангиогенным эффектом, miR-497 и miR-590, участвующие в регуляции дифференцировки клеток [50, 75, 76].
Таким образом, экспериментальные работы убедительно показали (рис. 2, см. на цветной вклейке), что трансплантация кардиосфер и их клеток у животных с моделированием сердечной патологии предотвращает патологическое ремоделирование сердца, увеличивает глобальную и регионарную сократимость ЛЖ за счет формирования прорегенеративного микроокружения путем ре-
гуляции ремоделирования внеклеточного матрикса, модуляции воспалительного ответа, стимуляции выживаемости и функциональной активности сохраненных клеток миокарда, активации резидентных прогениторных клеток и механизмов репаративного ангиогенеза.
На сегодняшний день имеются результаты нескольких клинических исследований, в которых использовалась трансплантация клеток кардиосфер. Первой работой был проект CADUCEUS - CArdiosphere-Derived aUtologous Stem CElls to Reverse ventricUlar dysfunction (NCT00893360) [77]. В это проспективное рандомизированное исследование по оценке безопасности, выполнимости и эффективности включались пациенты на 2-4-й неделе после инфаркта миокарда с фракцией выброса 25-45%. Аутологичные клетки кардиосфер получали из эндомиокардиальной биопсии и после необходимого культивирования вводили в инфаркт-связанную артерию через 1,5-3 мес после инфаркта с рандомизацией 2:1 (стандартное лечение + клетки кардиосфер или стандартное лечение). В исследование включены 25 больных (17 - клетки кардиосфер, 8 - контроль). Никаких осложнений в течение 24 ч после инфузии не отмечено. Через 6 мес ни один пациент не умер, не наблюдалось развития опухолей сердца. Достоверных различий в частоте побочных эффектов в опытной и контрольной группах не отмечено. У больных, получивших инфузию клеток кардио-сфер, наблюдали достоверное уменьшение массы рубца и увеличение доли жизнеспособного миокарда, возрастание региональной сократимости и регионального утолщения стенки в систолу по сравнению с контрольной группой. Однако конечный диастолический и систолический объемы и фракции выброса ЛЖ (ФВЛЖ) не различались в опытной и контрольной группах. Таким образом, показано, что интра-коронарная инфузия аутологичных клеток кардиосфер после инфаркта миокарда безопасна и выполнима, способствует увеличению доли жизнеспособного миокарда, что косвенно указывает на терапевтическую регенерацию. Через 1 год в этих группах больных сохранялись те же различия: в группе с введением клеток кардиосфер были меньше размер рубца и больше доля жизнеспособного миокарда (магнитно-резонансная томография - МРТ), улучшалась региональная функция в области инфаркта [70], но общая ФВЛЖ достоверно не различалась с контрольной группой.
Безопасность и предварительная оценка эффективности трансплантации аутологичных клеток кардиосфер также оценивались в исследовании TICAP (Transcoronary Infusión of Cardiac Progenitor Cells in Patients with Single Ventricle Physiology; NCT01273857) [78] у педиатрических пациентов с синдромом гипоплазии левых отделов сердца. Клетки вводили в три основные коронарные артерии 10 пациентам в возрасте около 2 лет после паллиативной хирургии. Контроль - 8 аналогичных пациентов без введения клеток. Никаких осложнений процедуры не отмечено. Через 18 мес у пациентов с клеточной терапией зарегистрированы улучшение функции ЛЖ (МРТ), уменьшение симптомов сердечной недостаточности и увеличение массы тела по сравнению с контрольной группой.
Однако, несмотря на обнадеживающие результаты первых испытаний аутологичной клеточной терапии клетками кардиосфер, ее применение сопряжено с техническими и логистическими трудностями в получении клеточного материала, что делает актуальным разработку аллогенных клеточных продуктов на основе кардиосфер. Показано, что клетки кардиосфер обладают благоприятным иммунологическим антигенным профилем и гипоиммуногенны in vitro.
Преклинические исследования на иммунологически не совместимых животных продемонстрировали, что трансплантация аллогенных клеток кардиосфер без иммуносупрессии безопасна и эффективно стимулирует эндогенные регенеративные механизмы, так же как и аутологичная трансплантация. Потенциально клеточная терапия на основе аллогенных клеток кардиосфер имеет большие перспективы более широкого клинического применения, так как дает возможность получения высокостандартизированного аллоген-ного биомедицинского клеточного продукта «off-the-shelf» (прямо с полки). Два последующих клинических исследования тестировали безопасность и эффективность трансплантации аллогенных клеток кардиосфер - ALLSTAR и DYNAMIC.
ALLSTAR (ALLogeneic Heart STem Cells to Achieve Myocardial Regeneration; NCT01458405) [79] - многоцентровое рандомизированное двойное слепое плацебо-контро-лируемое исследование 1/2 фазы по оценке безопасности и эффективности в уменьшении размера инфаркта при внут-рикоронарном введении аллогенных клеток кардиосфер пациентам с инфарктом миокарда и дисфункцией ЛЖ ишемического генеза. Дизайн исследования предполагал последовательный переход от I ко II фазе. Сначала в I фазу, которая представляла собой открытое нерандомизированное исследование безопасности с возрастающими дозами клеточного препарата, включены 14 пациентов. Затем во II фазу, которая уже была двойным слепым плацебо-контролируемым исследованием, включались 120 пациентов (клетки/плацебо 2:1). Первичная конечная точка по безопасности определялась через 1 мес, по эффективности (II фаза) - через 12 мес, как изменение размера инфаркта (МРТ). Несмотря на то, что предварительная оценка показала уменьшение размера рубца и улучшение функции сердца после использования клеточного препарата, дальнейший набор пациентов прекращен без обоснования причин.
В одноцентровом открытом исследовании DYNAMIC (Dilated cardiomYopathy iNtervention With Allogeneic Myo-cardIally-regenerative Cells; NCT02293603) [80] оценивалась безопасность введения аллогенных клеток кардиосфер в несколько коронарных артерий у пациентов с сердечной недостаточностью и низкой фракцией выброса (HFrEF). В него включены 14 больных с ФВЛЖ<35% и тяжелой сердечной недостаточностью (NYHA III-IV), несмотря на проводимую максимальную медикаментозную терапию. Клетки вводили в три основные коронарные артерии в дозах 37,5-75 млн. Через 72 ч после введения не выявлено никаких побочных эффектов. Два пациента умерли через 9 и 12 мес от прогрессирующей сердечной недостаточности. У остальных пациентов (12 человек с исходной фракцией выброса 22,9%) через 1 год отмечалось достоверное увеличение фракции выброса до 26,8% наряду с уменьшением систолического объема, снижением класса NYHA и улучшением качества жизни.
В многоцентровом открытом рандомизированном контролируемом исследовании HOPE-Duchenne - фаза I/II (NCT02485938) [81] аллогенные клетки кардиосфер трансплантировали в коронарные артерии больных с миодистро-фией Дюшена и выраженным фиброзом миокарда. Включены 25 пациентов (13 - клеточная терапия и 12 -контроль). Частота развития побочных эффектов не различалась в исследуемых группах. Через 12 мес в группе клеточной терапии отмечены значимое уменьшение доли фиброза и увеличение систолического утолщения нижней стенки ЛЖ. Более того, у пациентов значимо улучшалась функция верхних конечностей.
Таким образом, имеющиеся данные по клинической оценке внутрикоронарной трансплантации клеток кардио-сфер (как аллогенных, так и аутологичных) у больных с инфарктом миокарда и сердечной недостаточностью в результате ишемической кардиомиопатии, врожденного порока сердца, фиброза миокарда при миодистрофии Дюшена показали хороший профиль безопасности и предварительные данные по эффективности в уменьшении размера инфаркта, увеличении доли жизнеспособного миокарда и улучшении региональной функции, снижении класса сердечной недостаточности. В то же время существенного улучшения ФВЛЖ по сравнению с контролем не обнаружено. Здесь необходимо отметить, что ФВЛЖ зависит от многих параметров, включающих нагрузку объемом, геометрию желудочков, характер электрической активации, и поэтому, возможно, не является наиболее подходящим суррогатным маркером для оценки эффективности клеточной терапии [82]. Необходимы новые более крупные исследования и более длительные наблюдения для оценки влияния этого метода лечения на смертность и сердечно-сосудистые осложнения.
Заключение
В настоящее время проведено множество исследований с разными типами стволовых/прогениторных клеток, которые, несмотря на безопасность такой терапии, продемонстрировали весьма скромные клинические результаты. Это позволило переосмыслить концепцию клеточной терапии и привело к пониманию того, что успешное восстановление тканей путем трансплантации клеток требует скоординированной активации сложной цепи взаимосвязанных клеточных и молекулярных событий. Оказалось, что для запуска процессов восстановления необходимо восполнить в составе миокарда естественное клеточное микроокружение, которое позволит стимулировать вхождение кардиомиоцитов в клеточный цикл, активировать воспроизведение сосудистых клеток и процессы неоангиогенеза, а также мобилизовать клетки-предшественницы. И уже сформированное микроокружение путем специализированных биологических сигналов будет координировать процессы ремоделирования и управлять функциями клеток. В связи с этим наличие 3D-моделей «сердечной ниши» ex vivo представляет собой уникальный инструмент не только для изучения биологии клеток сердца и понимания патогенеза заболеваний, но и для биотехнологического скрининга и в качестве инструмента для клеточной терапии. Кардиосферы являются уникальной системой, которая без использования внешних воздействий и синтетических компонентов способна выстроить самоорганизованную микроткань, которая с определенной долей допущения моделирует естественные «клеточные ниши» миокарда. В ней прекрасно реализованы возможность гипо-ксической и метаболической регуляции, аутокринная/пара-кринная активность, которая в совокупности с возможностью трансформации путем ЭМП позволяет регулировать клеточный состав и свойства сфероидов. Не следует забывать, что такая система сохраняет способность воспринимать сигналы внешнего воздействия, обеспечивая своевременный ответ и перестройку, что позволяет создавать как персонализированный инструмент для индивидуального пациента и стадии заболевания, так и сложные микротканевые платформы для диагностики и скрининга лекарств. В настоящее время получены данные о возможности создания кардиосфер на основе трансформации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток [83], что позво-
лит проводить обогащение состава сфероидов определенными типами клеток, например зрелыми или генетически отредактированными с помощью технологии CRISPR/Cas9 кардиомиоцитами, что позволит воспроизвести полноценную микросреду «кардиальных ниш». Учитывая возможности стандартизации алгоритма получения кардиосфер, перед учеными открываются значительные перспективы для формирования сфероидов строго определенного состава, размеров, с сохранением специфических характеристик, что позволит перейти к этапу тканевой инженерии с целью проведения тканезаместительной терапии. Несмотря на 15-летнюю историю изучения кардиосфер и многообещающие результаты клинических исследований, перед исследователями стоит ряд нерешенных вопросов, связанных с механиз-
мами их самоорганизации, регуляции их свойств и объяснением механизмов действия. В связи с этим только решение вышеуказанных задач, а также взаимовыгодное сотрудничество фундаментальных исследователей и клиницистов позволят убедиться в безопасности и откроет возможность перехода на следующий уровень - персонифицированной тканевой инженерии сердечной ткани с использованием клеток кардиосфер.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта
РФФИ 18-015-00430.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
AMTEPATYPA/REFERENCES
1. Ashur C, Frishman WH. Cardiosphere-Derived Cells and Ischemic Heart Failure. Cardiol Rev. 2018;26(1):8-21. doi: 10.1097/CRD.0000000000000173
2. Barile L, Gherghiceanu M, Popescu LM, et al. Ultrastructural evidence of exosome secretion by progenitor cells in adult mouse myocardium and adult human cardiospheres. J Biomed Biotechnol. 2012;2012:354605. doi: 10.1155/2012/354605
3. Bernardo BC, Ooi JY, Lin RC, McMullen JR. miRNA therapeutics: a new class of drugs with potential therapeutic applications in the heart. Future Med Chem. 2015;7(13):1771-92. doi: 10.4155/fmc.15.107
4. Khodayari S, Khodayari H, Amiri AZ, et al. Inflammatory Microenvironment of Acute Myocardial Infarction Prevents Regeneration of Heart with Stem Cells Therapy. Cell Physiol Biochem. 2019;53(5):887-909. doi: 10.33594/000000180
5. Menasché P. Cell therapy trials for heart regeneration - lessons learned and future directions. Nat Rev Cardiol. 2018;15(11):659-71. doi: 10.1038/s41569-018-0013-0
6. Zuppinger C. 3D culture for cardiac cells. Biochim Biophys Acta. 2016;1863(7 Pt B):1873-81. doi: 10.1016/j.bbamcr.2015.11.036
7. Afzal MR, Samanta A, Shah ZI, et al. Adult Bone Marrow Cell Therapy for Ischemic Heart Disease: Evidence and Insights From Randomized Controlled Trials. Circ Res. 2015;117(6):558-75. doi: 10.1161/ CIRCRESAHA.114.304792
8. Gil-Perotín S, Duran-Moreno M, Cebrián-Silla A, et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay. Anat Rec (Hoboken). 2013;296(9):1435-52. doi: 10.1002/ ar.22746
9. Griffith LG, Swartz MA. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006;7(3):211-24. doi: 10.1038/nrm1858
10. Pampaloni F, Reynaud EG, Stelzer EH. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007;8(10):839-45. doi: 10.1038/nrm2236
11. Pedersen JA, Swartz MA. Mechanobiology in the third dimension. Ann Biomed Eng. 2005;33(11):1469-90. doi: 10.1007/s10439-005-8159-4
12. Gallet R, Tseliou E, Dawkins J, et al. Intracoronary delivery of self-assembling heart-derived microtissues (cardiospheres) for prevention of adverse remodeling in a pig model of convalescent myocardial infarction. Circ Cardiovasc Interv. 2015;8(5):e002391. doi: 10.1161/ CIRCINTERVENTIONS .115.002391
13. Afzal J, Chan A, Karakas MF, et al. Cardiosphere-Derived Cells Demonstrate Metabolic Flexibility That Is Influenced by Adhesion Status. JACC Basic Transl Sci. 2017;2(5):543-60. doi: 10.1016/j.jacbts. 2017.03.016
14. Aghila Rani KG, Kartha CC. Effects of epidermal growth factor on proliferation and migration of cardiosphere-derived cells expanded from adult human heart. Growth Factors. 2010;28(3):157-65. doi: 10.3109/08977190903512628
15. Chimenti I, Gaetani R, Forte E, et al. Serum and supplement optimization for EU GMP-compliance in cardiospheres cell culture. J Cell Mol Med. 2014;18(4):624-34. doi: 10.1111/jcmm.12210
16. Messina E, De Angelis L, Frati G, et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 2004;95(9):911-21. doi: 10.1161/01.RES.0000147315.71699.51
17. Fabrizi C, Angelini F, Chimenti I, et al. Thrombin and thrombin-derived peptides promote proliferation of cardiac progenitor cells in the form of cardiospheres without affecting their differentiation potential. J Biol Regul Homeost Agents. 2011;25(2 Suppl.):43-51.
18. Chimenti I, Massai D, Morbiducci U, et al. Stem Cell Spheroids and Ex Vivo Niche Modeling: Rationalization and Scaling-Up. J Cardiovasc Transl Res. 2017;10(2):150-66. doi: 10.1007/s12265-017-9741-5
19. Jochems CE, van der Valk JB, Stafleu FR, Baumans V. The use of fetal bovine serum: ethical or scientific problem? Altern Lab Anim. 2002;30(2):219-27. doi: 10.1177/026119290203000208
20. Chen T, You Y, Jiang H, Wang ZZ. Epithelial-mesenchymal transition (EMT): A biological process in the development, stem cell differentiation, and tumorigenesis. J Cell Physiol. 2017;232(12):3261-72. doi: 10.1002/jcp.25797
21. Forte E, Chimenti I, Rosa P, et al. EMT/MET at the Crossroad of Sternness, Regeneration and Oncogenesis: The Ying-Yang Equilibrium Recapitulated in Cell Spheroids. Cancers (Basel). 2017;9(8):98. doi: 10.3390/cancers9080098
22. Forte E, Miraldi F, Chimenti I, et al. TGFß-dependent epithelial-to-me-senchymal transition is required to generate cardiospheres from human adult heart biopsies. Stem Cells Dev. 2012;21(17):3081-90. doi: 10.1089/scd.2012.0277
23. Secco I, Barile L, Torrini C, et al. Notch pathway activation enhances cardiosphere in vitro expansion. J Cell Mol Med. 2018;22(11):5583-95. doi: 10.1111/jcmm.13832
24. Zakharova L, Nural-Guvener H, Gaballa MA. Cardiac explant-derived cells are regulated by Notch-modulated mesenchymal transition. PLoS One. 2012;7(5):e37800. doi: 10.1371/journal.pone.0037800
25. Nemir M, Pedrazzini T. Functional role of Notch signaling in the developing and postnatal heart. J Mol Cell Cardiol. 2008;45(4):495-504. doi: 10.1016/j.yjmcc.2008.02.273
26. Grieskamp T, Rudat C, Lüdtke TH, et al. Notch signaling regulates smooth muscle differentiation of epicardium-derived cells. Circ Res. 2011;108(7):813-23. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.110.228809
27. Urbanek K, Torella D, Sheikh F, et al. Myocardial regeneration by activation of multipotent cardiac stem cells in ischemic heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(24):8692-7. doi: 10.1073/pnas.0500169102
28. Chimenti I, Pagano F, Cavarretta E, et al. B-blockers treatment of cardiac surgery patients enhances isolation and improves phenotype of car-diosphere-derived cells. Sci Rep. 2016;6:36774. doi: 10.1038/srep36774
29. Amirrasouli MM, Shamsara M. Comparing the in vivo and in vitro effects of hypoxia (3% O2) on directly derived cells from murine cardiac explants versus murine cardiosphere derived cells. J Stem Cells Regen Med. 2017;13(2):35-44.
30. Gonzalez DM, Medici D. Signaling mechanisms of the epithelial-me-senchymal transition. Sci Signal. 2014;7(344):re8. doi: 10.1126/ scisignal.2005189
31. Tan SC, Gomes RS, Yeoh KK, et al. Preconditioning of Cardiosphere-Derived Cells With Hypoxia or Prolyl-4-Hydroxylase Inhibitors Increases Sternness and Decreases Reliance on Oxidative Metabolism. Cell Transplant. 2016;25(1):35-53. doi: 10.3727/096368915X687697
32. Hosoyama T, Samura M, Kudo T, et al. Cardiosphere-derived cell sheet primed with hypoxia improves left ventricular function of chronically infarcted heart. Am J Transl Res. 2015;7(12):2738-51.
33. Chimenti I, Smith RR, Li TS, et al. Relative roles of direct regeneration versus paracrine effects of human cardiosphere-derived cells transplanted into infarcted mice. Circ Res. 2010;106(5):971-80. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.109.210682
34. Li TS, Cheng K, Lee ST, et al. Cardiospheres recapitulate a niche-like microenvironment rich in stemness and cell-matrix interactions, rationalizing their enhanced functional potency for myocardial repair. Stem Cells. 2010;28(11):2088-98. doi: 10.1002/stem.532
35. Cho HJ, Lee HJ, Youn SW, et al. Secondary sphere formation enhances the functionality of cardiac progenitor cells. Mol Ther. 2012;20(9):1750-66. doi: 10.1038/mt.2012.109
36. Redgrave RE, Tual-Chalot S, Davison BJ, et al. Cardiosphere-Derived Cells Require Endoglin for Paracrine-Mediated Angiogenesis. Stem Cell Reports. 2017;8(5):1287-98. doi: 10.1016/j.stemcr.2017.04.015
37. Lee HJ, Cho HJ, Kwon YW, et al. Phenotypic modulation of human cardiospheres between stemness and paracrine activity, and implications for combined transplantation in cardiovascular regeneration. Biomaterials. 2013;34(38):9819-29. doi: 10.1016/j.biomaterials.2013.09.013
38. Lee ST, White AJ, Matsushita S, et al. Intramyocardial injection of auto-logous cardiospheres or cardiosphere-derived cells preserves function and minimizes adverse ventricular remodeling in pigs with heart failure post-myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 2011;57(4):455-65. doi: 10.1016/j .jacc .2010.07.049
39. Tseliou E, Kanazawa H, Dawkins J, et al. Widespread Myocardial Delivery of Heart-Derived Stem Cells by Nonocclusive Triple-Vessel In-tracoronary Infusion in Porcine Ischemic Cardiomyopathy: Superior Attenuation of Adverse Remodeling Documented by Magnetic Resonance Imaging and Histology. PLoS One. 2016;11(1):e0144523. doi: 10.1371/journal.pone.0144523
40. Johnston PV, Sasano T, Mills K, et al. Engraftment, differentiation, and functional benefits of autologous cardiosphere-derived cells in porcine ischemic cardiomyopathy. Circulation. 2009;120(12):1075-83. doi: 10.1161/CIRCULATI0NAHA.108.816058
41. Cheng K, Blusztajn A, Shen D, et al. Functional performance of human cardiosphere-derived cells delivered in an in situ polymerizable hyalu-ronan-gelatin hydrogel. Biomaterials. 2012;33(21):5317-24. doi: 10.1016/j .biomaterials .2012.04.006
42. Tanaka Y, Hosoyama T, Mikamo A, et al. Hypoxic preconditioning of human cardiosphere-derived cell sheets enhances cellular functions via activation of the PI3K/Akt/mTOR/HIF-1 a pathway. Am J Transl Res. 2017;9(2):664-73.
43. Blazquez R, Sanchez-Margallo FM, Crisostomo V, et al. Intrapericardial Delivery of Cardiosphere-Derived Cells: An Immunological Study in a Clinically Relevant Large Animal Model. PLoS One. 2016;11(2):e0149001. doi: 10.1371/journal.pone.0149001
44. Gallet R, Dawkins J, Valle J, et al. Exosomes secreted by cardiosphere-derived cells reduce scarring, attenuate adverse remodelling, and improve function in acute and chronic porcine myocardial infarction. Eur Heart J. 2017;38(3):201-11. doi: 10.1093/eurheartj/ehw240
45. Rogers RG, Fournier M, Sanchez L, et al. Disease-modifying bioactivity of intravenous cardiosphere-derived cells and exosomes in mdx mice. JCIInsight. 2019;4(7):e125754. doi: 10.1172/jci.insight.125754
46. Lapchak PA, Boitano PD, de Couto G, Marban E. Intravenous xenoge-neic human cardiosphere-derived cell extracellular vesicles (exosomes) improves behavioral function in small-clot embolized rabbits. Experimental Neurology. 2018;307:109-17. doi: 10.1016/j.expneurol. 2018.06.007
47. Tseliou E, Fouad J, Reich H, et al. Fibroblasts Rendered Antifibrotic, Antiapoptotic, and Angiogenic by Priming With Cardiosphere-Derived Extracellular Membrane Vesicles. J Am Coll Cardiol. 2015;66(6):599-611. doi: 10.1016/jjacc.2015.05.068
48. Grigorian-Shamagian L, Liu W, Fereydooni S, et al. Cardiac and systemic rejuvenation after cardiosphere-derived cell therapy in senescent rats. Eur Heart J. 2017;38(39):2957-67. doi: 10.1093/eurheartj/ehx454
49. Cambier L, Giani JF, Liu W, et al. Angiotensin II-Induced End-Organ Damage in Mice Is Attenuated by Human Exosomes and by an Exoso-mal Y RNA Fragment. Hypertension. 2018;72(2):370-80. doi: 10.1161/HYPERTENSI0NAHA.118.11239
50. Ibrahim AG, Cheng K, Marban E. Exosomes as critical agets of cardiac regeneration triggered by cell therapy. Stem Cell Reports. 2014;2(5):606-19. doi: 10.1016/j.stemcr.2014.04.006
51. Malliaras K, Li TS, Luthringer D, et al. Safety and efficacy of allogeneic cell therapy in infarcted rats transplanted with mismatched cardiosp-here-derived cells. Circulation. 2012;125(1):10-2. doi: 10.1161/ CIRCULATIONAHA.111.042598
52. Hodgkiss-Geere HM, Argyle DJ, Corcoran BM, et al. Characterisation and cardiac directed differentiation of canine adult cardiac stem cells. Vet J. 2012;191(2):176-82. doi: 10.1016/j.tvjl.2010.12.033
53. Cohn JN, Ferrari R, Sharpe N. Cardiac remodeling - concepts and clinical implications: a consensus paper from an international forum on cardiac remodeling. Behalf of an International Forum on Cardiac Remodeling. J Am Coll Cardiol. 2000;35(3):569-82. doi: 10.1016/s0735-1097(99)00630-0
54. Wu QQ, Xiao Y, Yuan Y, et al. Mechanisms contributing to cardiac remodelling. Clinical Science. 2017;131(18):2319-45. doi: 10.1042/ cs20171167
55. Zhang J, Wu Z, Fan Z, et al. Pericardial application as a new route for implanting stem-cell cardiospheres to treat myocardial infarction. J Physiol. 2018;596(11):2037-54. doi: 10.1113/JP275548
56. Yee K, Malliaras K, Kanazawa H, et al. Allogeneic cardiospheres delivered via percutaneous transendocardial injection increase viable myocardium, decrease scar size, and attenuate cardiac dilatation in porcine ischemic cardiomyopathy. PLoS One. 2014;9(12):e113805. doi: 10.1371/journal.pone.0113805
57. Tseliou E, Reich H, de Couto G, et al. Cardiospheres reverse adverse remodeling in chronic rat myocardial infarction: roles of soluble endo-glin and Tgf-P signaling. Basic Res Cardiol. 2014;109(6):443. doi: 10.1007/s00395-014-0443-8
58. Tseliou E, de Couto G, Terrovitis J, et al. Angiogenesis, cardiomyocyte proliferation and anti-fibrotic effects underlie structural preservation post-infarction by intramyocardially-injected cardiospheres. PLoS One. 2014;9(2):e88590. doi: 10.1371/journal.pone.0088590
59. Davis DR, Zhang Y, Smith RR, et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 2009;4(9):e7195. doi: 10.1371/journal.pone.0007195
60. Kanazawa H, Tseliou E, Dawkins JF, et al. Durable Benefits of Cellular Postconditioning: Long-Term Effects of Allogeneic Cardiosphere-De-rived Cells Infused After Reperfusion in Pigs with Acute Myocardial Infarction. J Am Heart Assoc. 2016;5(2):e002796. doi: 10.1161/ JAHA.115.002796
61. Tseliou E, Pollan S, Malliaras K, et al. Allogeneic cardiospheres safely boost cardiac function and attenuate adverse remodeling after myocar-dial infarction in immunologically mismatched rat strains. J Am Coll Cardiol. 2013;61(10):1108-19. doi: 10.1016/j.jacc.2012.10.052
62. Wood KJ, Issa F, Hester J. Understanding Stem Cell Immunogenicity in Therapeutic Applications. Trends Immunol. 2016;37(1):5-16. doi: 10.1016/j.it.2015.11.005
63. Lauden L, Boukouaci W, Borlado LR, et al. Allogenicity of human cardiac stem/progenitor cells orchestrated by programmed death ligand 1. Circ Res. 2013;112(3):451-64. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.112.276501
64. Gallet R, de Couto G, Simsolo E, et al. Cardiosphere-derived cells reverse heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) in rats by decreasing fibrosis and inflammation. JACC Basic Transl Sci. 2016;1(1-2):14-28. doi: 10.1016/j.jacbts.2016.01.003
65. Dutton LC, Dudhia J, Catchpole B, et al. Cardiosphere-derived cells suppress allogeneic lymphocytes by production of PGE2 acting via the EP4 receptor. Sci Rep. 2018;8(1):13351. doi: 10.1038/s41598-018-31569-1
66. de Couto G, Liu W, Tseliou E, et al. Macrophages mediate cardiopro-tective cellular postconditioning in acute myocardial infarction. J Clin Invest. 2015;125(8):3147-62. doi: 10.1172/JCI81321
67. Hasan AS, Luo L, Yan C, et al. Cardiosphere-Derived Cells Facilitate Heart Repair by Modulating M1/M2 Macrophage Polarization and Ne-utrophil Recruitment. PLoS One. 2016;11(10):e0165255. doi: 10.1371/journal.pone.0165255
68. Nana-Leventaki E, Nana M, Poulianitis N, et al. Cardiosphere-Derived Cells Attenuate Inflammation, Preserve Systolic Function, and Prevent Adverse Remodeling in Rat Hearts With Experimental Autoimmune Myocarditis. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2019;24(l):70-7. doi: 10.1177/1074248418784287
69. Malliaras K, Terrovitis J. Cardiomyocyte proliferation vs progenitor cells in myocardial regeneration: The debate continues. Glob Cardiol Sci Pract. 2013;2013(3):303-15. doi: 10.5339/gcsp.2013.37
70. Malliaras K, Makkar RR, Smith RR, et al. Intracoronary cardiosphere-de-rived cells after myocardial infarction: evidence of therapeutic regeneration in the final 1-year results of the CADUCEUS trial (CArdiosphere-Derived autologous stem CElls to reverse ventricUlar dySfunction). J Am Coll Cardiol. 2014;63(2):110-22. doi: 10.1016/jjacc.2013.08.724
71. Maguire G, Friedman P. The Systems Biology of Stem Cell Released Molecules - Based Therapeutics. ISRN Stem Cells. 2013;1-12. doi: 10.1155/2013/784541
72. Marunouchi T, Yano E, Tanonaka K. Effects of cardiosphere-derived cell transplantation on cardiac mitochondrial oxygen consumption after myocardial infarction in rats. BiomedPharmacother. 2018;108:883-92. doi: 10.1016/j .biopha.2018.09.117
73. Tang XL, Rokosh G, Sanganalmath SK, et al. Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction. Circulation. 2010;121(2):293-305. doi: 10.1161 /CIRCULATIONAHA .109.871905
74. Xie Y, Ibrahim A, Cheng K, et al. Importance of cell-cell contact in the therapeutic benefits of cardiosphere-derived cells. Stem Cells. 2014;32(9):2397-406. doi: 10.1002/stem.1736
75. Barile L, Lionetti V, Cervio E, et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovasc Res. 2014;103(4):530-41. doi: 10.1093/cvr/cvu167
76. Jafarzadeh M, Mohammad Soltani B, Ekhteraei Tousi S, Behmanesh M. Hsa-miR-497 as a new regulator in TGF|3 signaling pathway and cardiac
differentiation process. Gene. 2018;675:150-6. doi: 10.1016/ j.gene.2018.06.098
77. Makkar RR, Smith RR, Cheng K, et al. Intracoronary cardiosphere-de-rived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 2012;379(9819):895-904. doi: 10.1016/S0140-6736(12)60195-0
78. Tarui S, Ishigami S, Ousaka D, et al. Transcoronary infusion of cardiac progenitor cells in hypoplastic left heart syndrome: Three-year follow-up of the Transcoronary Infusion of Cardiac Progenitor Cells in Patients With Single-Ventricle Physiology (TICAP) trial. J Thorac Cardiovasc Surg. 2015;150(5):1198-207,1208.e1-2. doi: 10.1016/ j.jtcvs.2015.06.076
79. Chakravarty T, Makkar RR, Ascheim DD, et al. ALLogeneic Heart STem Cells to Achieve Myocardial Regeneration (ALLSTAR) Trial: Rationale and Design. Cell Transplant. 2017;26(2):205-14. doi: 10.3727/096368916X692933
80. Chakravarty T, Makkar R, Henry T, et al. Multivessel intracoronary infusion of allogeneic derived cardiosphere cells in cardiomyopathy: long term outcomes of the dilated cardiomyopathy intervention with alloge-neic myocardially regenerative cells (DYNAMIC STUDY). J Am Coll Cardio. 2016;68(18):B332. doi: 10.1016/j.jacc.2016.09.848
81. Taylor M, Jefferies J, Byrne B, et al. Cardiac and skeletal muscle effects in the randomized HOPE-Duchenne trial. Neurology. 2019;92(8):e866-e878. doi: 10.1212/WNL.0000000000006950. PMID: 30674601.
82. Dorobantu M, Popa-Fotea NM, Popa M, et al. Pursuing meaningful endpoints for stem cell therapy assessment in ischemic cardiac disease. World J Stem Cells. 2017;9(12):203-18. doi: 10.4252/wjsc.v9.i12.203
83. Fischer B, Meier A, Dehne A, et al. A complete workflow for the differentiation and the dissociation of hiPSC-derived cardiospheres. Stem Cell Res. 2018;32:65-72. doi: 10.1016/j.scr.2018.08.015
Поступила 13.02.2020
