CC BY
62
2012
Известия ТИНРО
Tom 169
УДК 664.959 А.И. Чепкасова, Н.Б Аюшин, М.И. Юрьева, Ю.М. Позднякова, Н.Н. Ковалев*
Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр, 690091, г. Владивосток, пер. Шевченко, 4
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПЕЧЕНИ ЛОСОСЕВЫХ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ КОМПОНЕНТОВ
Показаны аминокислотный состав, жирнокислотный состав и антиоксидантная активность сырой и высушенной печени горбуши, водорастворимого препарата, выделенного из нее, а также хитозан-липидного комплекса, полученного в процессе приготовления препарата. Проведено сравнение препарата из печени горбуши с коммерческим препаратом “Гепатосан”. Установлено, что препарат из печени горбуши обладает высокой антиоксидантной активностью, которая снижается после длительного морозильного хранения исходного сырья. Содержание белковых аминокислот в свежей обезвоженной печени и продуктах из нее выше, чем в печени, высушенной на распылительной сушке и соответствующих продуктах и почти не отличается от содержания аминокислот в гепатосане. Процесс экстрагирования и сублимирования водорастворимых компонентов печени приводит к концентрированию свободных нингидринположительных соединений в 7 раз по сравнению с сырьем. Водорастворимый препарат характеризуется высоким содержанием p-Ser, Asp, Glu, Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Trp и таких физиологически важных для человека веществ, как Tau, Ans, Car. Обнаружено, что при формировании хитозан-липидных комплексов происходит концентрирование мононенасы-щенных и полиненасыщенных жирных кислот. В то же время хитозан связывает до 60 % насыщенных жирных кислот печени горбуши. Особенности аминокислотного состава и состава свободных нингидринположительных соединений в совокупности с данными по антиоксидантной активности водных экстрактов печени горбуши позволяют сделать предположение о перспективности их использования в качестве БАД к пище. Высокое содержание ненасыщенных жирных кислот в составе хитозан-липидных комплексов, полученных из печени горбуши, предполагает возможность их использования в качестве гепатопротекторного средства.
Ключевые слова: лососевые, горбуша, печень, липиды, аминокислоты, хи-тозан-липидный комплекс, антиоксидантная активность, биологически активные добавки к пище.
* Чепкасова Анна Ивановна, младший научный сотрудник, e-mail: kovalevnn@ tinro.ru; Аюшин Николай Буданович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, e-mail: [email protected]; Юрьева Марина Иннокентьевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, e-mail: [email protected]; Позднякова Юлия Михайловна, кандидат биологических наук, научный сотрудник, e-mail: pozdnyakovajm@ tinro.ru; Ковалев Николай Николаевич, доктор биологических наук, заведующий лабораторией, e-mail: [email protected].
Chepkasova A.I., Ayushin N.B., Yureva M.I., Pozdnyakova Yu.M., Kovalev N.N. Prospects of salmon liver processing for receiving of biologically active compounds // Izv. TINRO. — 2012. — Vol. 169. — P. 230-237.
Amino acid composition, fatty acid composition, and antioxidant activity is investigated for fresh and dried liver of pink salmon, its water-soluble preparation and the chitosan-lipid complex that is a by-product of this preparation producing. The preparation form salmon liver is compared with the commercial substance Hepatosan. The water-soluble preparation from fresh liver has high antioxidant activity that decreases after long-term storage of frozen liver. Total amount of protein amino acids in the fresh dehydrated liver and products of it is higher than in dried liver and its products and is similar to their amount in Hepatosan; besides, the amino acids from fresh liver have antioxidant activity. Amount of free ninhydrin-positive compounds increases in 7 times in the process of extraction and sublimation of fresh materials. The water-soluble preparation has high content of p-Ser, Asp, Glu, Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, as well as such important for human physiology substances as Tau, Ans, and Car. Concentration of mono- and polynonsaturated fatty acids increased in the process of chitosan-lipid complexes formation; chitosan binds up to 60% of saturated fatty acids. Features of protein amino acids composition, composition of free nynhydrin-positive substances, high antioxidant activity of water-soluble preparation allow to recommend this preparation as BASF. The chitosan-lipid complexes may be used as hepatoprotectors because of high amount of nonsaturated fatty acids.
Key words: salmon, pink salmon, liver, lipid, amino acid, BASF, chitosan-lipid complex, antioxidant activity.
Введение
Обоснование комплексной переработки объектов морского промысла является актуальной задачей современной биотехнологии. Безотходная переработка гидробионтов позволяет определить основные пути решения ряда проблем: увеличение номенклатуры выпускаемой продукции, создание высокотехнологических производств, утилизация неиспользуемых отходов, обеспечивающая экологическую чистоту производства.
Один из массовых объектов промысла на дальневосточном бассейне — рыбы лососевых пород. Основные принципы и подходы использования отходов переработки лососевых были освещены в печати ранее (Ковалев, Пивненко, 2008), однако сведений о переработке печени лососевых нами не обнаружено.
Печень горбуши является неиспользуемым сырьем, из которого можно получать биологически активные компоненты различной химической природы. В общей структуре вылова лососевых на Дальнем Востоке доля горбуши составляет не менее 60 %, в 2008 г. было выловлено 147660 т, в 2009 г. — 393562, в 2010 г. — 168214 т (Сведения ..., 2010, 2011). Ранее (Пат. № 2409291) была обоснована технология извлечения из печени лососевых водорастворимых компонентов. Установлено, что печень горбуши характеризуется невысоким значением содержания жира (менее 5 %), в котором полиненасыщенные жирные кислоты составляют 17,6 %. Водорастворимый препарат и хитозан-липидные комплексы из печени кеты также были охарактеризованы ранее (Чепкасова и др., 2009). Проведенные исследования показали различия в составах белковых компонентов водорастворимого препарата и коммерческого препарата “Гепатосан”. В модельных экспериментах на животных было показано, что хитозан-липидные комплексы и водорастворимый препарат из печени кеты проявляют гепатопро-текторное действие.
Исследования состава биологически активных компонентов водорастворимого препарата и хитозан-липидных комплексов, полученных при переработке печени горбуши, ранее не проводились.
Задачей данной работы было изучение состава биологически активных компонентов, полученных из печени горбуши.
Материалы и методы
Печень горбуши Oncorhynchus gorbuscha была заготовлена и заморожена в сыром виде прямо на месте вылова (о. Сахалин). После доставки в ТИНРО-центр часть материала хранили до использования в блоках при температуре -18 0С, часть высушивали на вакуумной ротационной сушке и хранили в плотно закрытой таре при температуре 4-6 0С. Печень кеты O. keta была заготовлена в ТИНРО-центре, куда рыбу доставили в охлажденном виде сразу же после вылова в р. Занадворовка (Приморский край).
Аминокислотный анализ проводили на скоростном аминокислотном анализаторе L-8800 (“Hitachi”, Япония). Антиоксидантную активность определяли по методу Глевинда (Владимиров, Арчаков, 1972) с использованием а-дифенил-а-пикрилгидразина (получен от фирмы ICN, США).
Экстракцию липидов из тканей проводили по методу Блайя-Дайэра, используя смесь растворителей метанол-хлороформ 1 : 2 (об/об) (Fokh et al., 1957).
Анализ состава жирных кислот липидов проводили на хроматографе “Shimadzu-14B” (Япония) с пламенно-ионизационным детектором. Условия анализа: капиллярная колонка “Supelcowax-10”, 30 м х 0,25 мм, газ-носитель — гелий, температура инжектора — 240 0С, температура детектора — 240, температура термостата — 210 0С. Метиловые эфиры жирных кислот идентифицировали на основании расчета индексов удерживания Ковача ECL (Christie, 1988).
Печень горбуши обрабатывали способом, разработанным авторами ранее (Пат. № 2409291). Материал размораживали, измельчали и проводили водную экстракцию при низких значениях рН. Твердую фракцию отделяли, а экстракт обрабатывали раствором хитозана. Суспензию разделяли, фильтрат высушивали на распылительной сушке, а хитозановый осадок сублимировали.
Фармацевтическое средство “Гепатосан”, представляющее собой сублимированные гепатоциты печени свиньи, приобретено в аптечной сети г. Владивосток.
Результаты и их обсуждение
Проведенными ранее исследованиями (Чепкасова и др., 2009) было установлено, что содержание белков, преимущественно с молекулярной массой 3060 кДа, в водорастворимых препаратах, полученных из мороженой и сушеной печени горбуши, составляет соответственно 40 и 43 %.
В образцах замороженной и высушенной печени горбуши, а также полученных из них водорастворимых фракциях и хитозановых осадках определяли состав белковых аминокислот. Поскольку в процессе подготовки проб для аминокислотного анализа печень, до того сохранявшаяся в замороженном виде, дважды обрабатывается ацетоном и таким образом полностью обезвоживается, сравнение результатов, полученных для замороженной и для высушенной печени, представляется корректным. Результаты представлены в табл. 1. Данные для коммерческого препарата “Гепатосан” приводятся для сравнения.
Из данных табл. 1 видно, что белковые аминокислоты в сушеной и мороженой печени горбуши содержатся в сопоставимых количествах. Анализ аминокислотного состава водорастворимых препаратов, полученных из сушеной и мороженой печени горбуши, показывает, что экстрактивность белкового материала (по сумме белковых аминокислот) из мороженой печени значительно выше, чем из сушеной. Общая экстрактивность белкового материала (по сумме аминокислот) при получении водорастворимого препарата из сырья составляла для сушеной печени 55,4 %, а для мороженой — 61,5 %. Представляло интерес проведение исследования состава белковых аминокислот в фармацевтическом препарате “Гепатосан” и водорастворимых препаратах, полученных из печени лососевых. Гепатосан — препарат сублимационно высушенных клеток печени донорской свиньи, представляющий собой порошок от светло-бежевого до светло-коричне-
Таблица 1
Белковые аминокислоты печени горбуши и препаратов из нее, мг аминокислоты/г материала
Table 1
Protein amino acids from the pink salmon liver and its preparations, mg of amino acid per g of raw material
Амино- кислота Печень сушеная Печень мороженая, обезвоженная ацетоном Водорастворимый препарат из из моросушеной женой печени печени Хитозановый осадок после получения водорастворимого препарата из из моросушеной женой печени печени Гепато- сан
Thr 29,3 Незаменимые 38,5 15,7 аминокислоты 24,2 26,9 32,2 19,4
Val 43,6 45,7 20,6 27,3 42,0 29,4 46,9
Met 3,3 4,7 2,7 4,9 - 4,6 12,4
Ile 33,4 35,3 12,2 17,9 29,2 21,1 37,0
Leu 61,0 70,8 24,3 32,4 51,4 56,0 80,0
Phe 32,9 38,0 12,0 21,9 27,5 30,0 41,7
Lys 56,4 65,3 30,1 40,7 53,7 48,4 57,3
Сумма незаме-
нимых 259,9 298,3 117,6 169,3 230,7 221,7 294,7
Tyr 21,8 Заменимые 28,2 7,7 аминокислоты 12,2 20,0 25,8 17,9
Ser 25,0 35,1 15,6 22,8 21,5 30,7 7,4
Asp 57,9 72,8 31,7 44,6 53,0 62,9 75,3
Glu 91,4 108,7 80,7 85,2 74,1 85,0 108,2
Gly 38,1 40,8 26,7 29,0 36,6 31,2 42,9
Ala 54,3 59,9 35,0 47,4 44,7 44,4 44,6
His 22,4 26,7 8,3 12,1 25,3 20,2 23,3
Arg 38,7 46,1 9,4 16,0 38,8 39,5 51,0
Pro 52,3 52,3 27,4 33,9 39,1 60,2 64,7
Cys - - 6,6 - - - 7,1
Сумма замени-
мых 401,9 470,6 249,1 303,2 399,9 353,1 442,4
Всего 661,8 768,9 366,7 472,5 621,6 583,2 737,1
вого цвета. Гепатосан как гепатопротекторное средство рекомендуется к применению при циррозе печени различной этиологии, хронической гепатопатии (гепатиты, гепатозы), острой и хронической печеночной недостаточности, лекарственном и алкогольном поражении печени, отравлении, нарушениях процесса пищеварения. Препарат содержит аминокислоты, микроэлементы, витамины, эссенциальные фосфолипиды, мезенхимальные ферменты, цитохромы.
Проведенное исследование показало, что количественное содержание белковых аминокислот в гепатосане сравнимо с таковым в сублимированной и мороженой печени горбуши. Сравнение содержания аминокислот в гепатосане и водорастворимых препаратах показывает, что препараты из печени горбуши содержат на 37-51 % меньше белковых аминокислот. Более детальный анализ показывает, что в гепатосане на 42-60 % больше незаменимых и на 34-46 % больше заменимых аминокислот.
Анализ аминокислотного состава хитозановых осадков показал, что по суммарному показателю количественного содержания белковых аминокислот препараты, полученные из сушеной и мороженой печени горбуши, не различались. Достоверно не различалось и количественное содержание заменимых и незаменимых аминокислот. Хорошо заметно, что доля белковых аминокислот на едини-
цу массы сухого продукта в хитозановых осадках значительно выше, чем в водорастворимых препаратах. По-видимому, хитозан, как природный поликатион, способен эффективно сорбировать низкомолекулярные белки с массой 3060 кДа.
Известно, что препараты, богатые свободными аминокислотами и родственными им низкомолекулярными веществами, растворимыми в воде, обладают рядом полезных свойств, в том числе антиоксидантным действием (Давидович, Пивненко, 2001). В связи с этим представляло интерес выяснить содержание названных веществ в печени горбуши и полученном из нее высушенном водном экстракте и провести сравнение с гепатосаном (хитозановые осадки по понятным причинам водорастворимого материала не содержат). Результаты приведены в табл. 2.
Таблица 2
Содержание свободных аминокислот и других низкомолекулярных нингидринположительных соединений в печени горбуши, водном экстракте из нее и гепатосане, мг/г
Table 2
Content of free amino acids and other low-molecular ninhydrin-positive compounds in the pink salmon liver, its water-soluble preparation, and Hepatosan, mg/g
Соединение Печень мороженая* Водный экстракт мороженой печени* Гепатосан
p-Ser 0,03 13,28 0,68
Tau 2,50 5,04 1,10
Asp 0,32 4,69 0,37
Thr 0,42 4,05 0,34
Ser 0,37 4,18 0,37
Glu 1,75 10,75 2,85
Sar 0,01 - 0,03
a-AAA 0,03 - 0,12
Gly 0,69 2,83 1,46
Ala 1,00 7,66 0,97
Cit 0,02 0,08 -
a-ABA 0,02 - 0,01
Val 0,43 5,21 0,28
Cys 0,08 - 0,25
Met 0,21 1,85 -
Cystin 0,04 0,96 0,05
Ile 0,24 4,67 0,18
Leu 0,48 8,49 0,38
Tyr 0,26 2,77 0,31
Phe 0,24 3,90 0,17
b-Ala 0,08 1,99 0,09
b-Aiba - 0,15 0,09
g-ABA 0,05 0,70 0,02
Trp 0,04 1,05 0,01
HyLys 0,02 0,37 0,08
Orn 0,25 0,17 0,27
Lys 0,60 3,83 0,38
His 0,12 0,93 0,06
Ans 0,31 1,47 0,26
Car 0,06 0,38 0,07
Arg 0,04 3,80 0,02
Pro 3,46 6,06 0,35
Всего 14,17 101,31 11,62
* Данные по А.И. Чепкасовой с соавторами (2009).
Из данных табл. 2 видно, что процесс экстрагирования и высушивания водорастворимых компонентов печени приводит к концентрированию нингидрин-
положительных соединений в 7 раз больше по сравнению с сырьем. Сублимированный водный экстракт характеризуется высоким содержанием таких аминокислот, как p-Ser, Asp, Glu, Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, и таких физиологически важных для человека веществ, как Tau, Ans, Car. Процесс концентрирования разных соединений различался количественно. Так, в 10 раз и более увеличивалась концентрация таких аминокислот, как Asp, p-Ser, Trh, Ser, Val, Ile, Leu, Tyr, b-Ala, Trp. Сравнение скора нингидринположительных соединений сублимированного экстракта печени горбуши и гепатосана свидетельствует, что препараты по данному показателю различаются в 9 раз. Привлекает внимание 100-кратное повышение содержания таких аминокислот, как Trp и Arg, в препарате из печени горбуши по сравнению с мороженой печенью. Десятикратное увеличение отмечается также для Asp, Thr, Ser, Ile, Leu, b-Ala, Pro. Особо следует отметить 5-кратное повышение содержания в препарате из печени горбуши таких физиологически важных соединений, как Tau, Ans, Car.
Сравнивали также антиоксидантную активность высушенного водного экстракта без обработки хитозаном и водорастворимого препарата из сыромороженой печени горбуши разных сроков хранения и гепатосана. Кроме того, исследовали активность необработанного водного экстракта и водорастворимого препарата из печени свежевыловленной кеты. Активность препарата из свежей печени горбуши (хранилась в замороженном состоянии не более месяца с момента вылова) соответствовала для 1 мг активности 5,8 мг стандартного антиоксиданта карнозина (использование аминокислоты в качестве стандарта сравнения представляется более корректным). Аналогичный препарат был также приготовлен из замороженной печени горбуши, хранившейся 2 года при минус 18 0С. Антиоксидантная активность 1 мг такого препарата соответствовала активности 1,7 мг чистого карнозина, что, несмотря на троекратное уменьшение активности в процессе хранения, может быть признано весьма высоким, следовательно, сырье длительного срока хранения может быть использовано для получения препаратов антиоксидантного действия. Гепатосан антиоксидантной активности не проявил (табл. 3).
Таблица 3
Антиоксидантная активность высушенных водных экстрактов печени горбуши и гепатосана
Table 3
Antioxidant activity of sublimated water extracts from liver of pink and chum salmons
and Hepatosan
Препарат Антиоксидантная активность в 1 мг сухого препарата, соответствующая активности карнозина, мг Горбуша Кета
Без обработки хитозаном Экстракт свежей печени 0,9 4,2
С обработкой хитозаном 5,8 5,2
Экстракт печени после 2 лет хранения при -18 °С
Без обработки хитозаном 0,8 Н.о
С обработкой хитозаном 1,7 Н.о
Гепатосан Активности нет
Следует отметить, что водорастворимый препарат из мороженой печени кеты, полученный после обработки хитозаном, был равноэффективен препарату из печени горбуши. Отмечаются значительные различия антиоксидантной активности экстрактов печени исследованных видов лососевых рыб без обработки хитозаном.
Известна способность хитозана связывать липиды. Данное свойство хитоза-на как сорбента широко используется в технологии продуктов питания и в кли-
нической практике для применения его как гиполипидемического средства (Ха-сина и др., 2005).
Нами проведено определение состава жирных кислот печени горбуши, хранившейся в замороженном состоянии не более месяца, и полученных из нее хитозан-липидных комплексов (табл. 4).
Таблица 4
Состав жирных кислот печени и хитозан-липидных комплексов горбуши,
% от суммы ЖК
Table 4
Fatty acids composition of the pink salmon liver and its chitosan-lipid complexes,
% of total fatty acids content
Жирная кислота Печень ХЛК
Миристиновая (14:0) 0,5 1,9
Пальмитиновая (16:0) 32,1 28,1
Пальмитоолеиновая (16:1п-7) 2,8 3,2
Стеариновая (18:0) 15,8 1,9
Олеиновая (18:1п-9) 17,7 19,1
Вакценовая (18:1п-7) 3,2 14,3
Цис- 13-октодекановая (18:11п-5) 0,7 2,3
Линолевая (18:2 п-6) 0,7 1,0
Гондоиновая (20:1 п-9) 0,9 1,9
Арахидоновая (20:4п-6) 1,4 1,5
Эйкозатетраеновая (20:4 п-3) 0,4 0,6
Эйкозапентаеновая (20:5п-3) 6,0 5,8
Эруковая (22:1п-9) 0,3 0,5
Докозапентаеновая (22:5п-3) 1,4 1,6
Докозагексаеновая (22:6п-3) 5,6 9,5
Сумма насыщенных ЖК 56,8 35,3
Сумма мононенасыщенных ЖК 25,6 42,6
Сумма полиненасыщенных ЖК 17,6 22,1
Примечание. Приведены преобладающие ЖК.
Из приведенных в табл. 4 данных видно, что хитозан проявляет определенную специфичность сорбции по отношению к жирным кислотам печени горбуши. При формировании хитозан-липидных комплексов происходит концентрирование мононенасыщенных и полиненасыщенных жирных кислот; насыщенные жирные кислоты связываются слабее. Выявленная специфичность сорбции жирных кислот может служить основанием для разработки на основе хитозановых осадков комплексных препаратов с повышенным содержанием ненасыщенных жирных кислот.
Следует отметить, что липиды печени лососевых рыб плохо переносят длительное хранение. Так, для печени свежеразделанной кеты кислотное число составляло 4,4 мг КОН/г жира (норма — 4,0), а перекисное — 7,6 моль 02/кг (норма — 10,0). В течение месяца значения и кислотного, и перекисного чисел увеличивались более чем в 2 раза.
Заключение
Выявленные в ходе исследования особенности аминокислотного состава и состава свободных нингидринположительных соединений в совокупности с данными по антиоксидантной активности водных экстрактов печени горбуши позволяют сделать предположение о перспективности их использования в качестве БАД к пище. Высокое содержание ненасыщенных жирных кислот в составе хи-тозан-липидных комплексов, полученных из печени горбуши, предполагает возможность их использования в качестве гепатопротекторного средства при условии использования в качестве сырья печени свежевыловленной рыбы.
Таким образом, на основании проведенного исследования показано, что печень горбуши может являться потенциальным сырьем для получения биологически активных веществ и их комплексов.
Список литературы
Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах : монография. — М., 1972. — 252 с.
Давидович В.В., Пивненко Т.Н. Аминокислоты двустворчатых моллюсков: биологическая роль и применение в качестве БАД // Изв. ТИНРО. — 2001. — Т. 129. — С. 146-153.
Ковалев Н.Н., Пивненко Т.Н. Биологически активные добавки к пище при комплексной переработке гидробионтов // 2-я Междунар. науч.-практ. конф. “Повышение эффективности использования водных биологических ресурсов”. — М. : ВНИ-РО, 2008. — С. 273-275.
Пат. № 2409291. Способ получения водорастворимого полипептидного комплекса из печени рыб лососевых пород / А.И. Чепкасова, Н.Б. Аюшин, Н.Н. Ковалев. — Заявл. 17.08.09; Опубл. 20.01. 11.
Сведения об улове рыбы, добыче других водных биоресурсов и производстве рыбной продукции за январь-декабрь 2009 года (нарастающим итогом): Федеральное Государственное статистическое наблюдение. http://www.fish.gov.ru/ activities/documents/2582pdf. 9 ноября 2010 г.
Сведения об улове рыбы, добыче других водных биоресурсов и производстве рыбной продукции за январь-декабрь 2009 года (нарастающим итогом): Федеральное Государственное статистическое наблюдение. http://www.fish.gov.ru/ activities/documents/f407-0.pdf. 19 мая 2011 г.
Хасина Э.И., Сгребнева М.Н., Ермак И.М., Горбач В.И. Хитозан и неспецифическая резистентность организма // Вестн. ДВО РАН. — 2005. — № 1. — С. 62-71.
Чепкасова А.И., Аюшин Н.Б., Юрьева М.И. и др. Технохимическая характеристика печени лососевых рыб и перспективы ее использования // Изв. ТИНРО. — 2009. — Т. 159. — С. 325-336.
Christie W.W. Equivalent chain-lengths of methyl ester derivatives of fatty acids on gas-chromatography — a reappraisal // J. Chromatogr. A. — 1988. — Vol. 447, № 2. — P. 305-314.
Folch J., Lees M., Sloane Stanley G.H. Method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J. Biol. Chem. — 1957. — Vol. 226, № 1. — P. 497-509.
Поступила в редакцию 28.03.12 г.
