CC BY
55
УДК 612.017.1:615.37
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МОДЕЛЕЙ ИММУННЫХ ПРОЦЕССОВ IN VITRO ДЛЯ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ СРЕДСТВ ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ
В.Ю. Талаев, М.В. Плеханова, Е.И. Ефимов,
ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной»
Талаев Владимир Юрьевич - e-mail: talaev@inbox.ru
В данной статье кратко обозначены ключевые достижения иммунологии и описаны новые возможности прикладных исследований, направленных на совершенствование средств специфической иммунопрофилактики инфекционных заболеваний.
Ключевые слова: вакцина, антигены, адъюванты, дендритные клетки.
The article briefly gives key achievements of immunology and describes the new potentials of applied researches aimed at the improvement of means of specific immunoprophylaxis of infectious diseases.
Введение
Вакцинация является одним из самых эффективных методов профилактики многих инфекционных заболеваний, а расширение спектра вакцин и создание новых, более эффективных и безопасных вакцин - актуальной задачей современной иммунологии. Для решения этой задачи иммунологи разрабатывают новые методические подходы, в которых используются последние достижения фундаментальной науки - клеточной и молекулярной иммунологии. В данной статье кратко обозначены ключевые достижения иммунологии и описаны новые возможности прикладных исследований, направленных на совершенствование средств специфической иммунопрофилактики инфекционных заболеваний.
Значение фундаментальных исследований механизмов иммунного ответа для решения прикладных задач по совершенствованию вакцин.
Два последних десятилетия обогатили иммунологию принципиально новыми положениями, существенно расши-
Key words: vaccine, antigens, adjuvants, dendritic cells.
ряющими наши представления о механизмах иммунного ответа. По нашему мнению, наиболее важными из этих новых положений являются:
1. Открытие уникальной системы распознавания типовых молекул патогенов антигенпрезентирующими клетками [1].
Это открытие позволило отказаться от представления о системе врожденного (естественного) иммунитета как о второстепенной и вспомогательной части иммунной системы. ^
2. Концепция о ключевой роли особой группы антигенпре-зентирующих клеток - дендритных клеток (ДК), в запуске и регуляции адаптивного иммунного ответа [2].
3. Формирование представлений о пространственных параметрах иммунных реакций и о путях миграции иммуно-цитов [3, 4, 5].
4. Расширение и уточнение представлений о дифферен-цировке субпопуляций Т-лимфоцитов, определяющих тип иммунного ответа [6] и открытие регуляторных Т-клеток (Трег), играющих ключевую роль в индукции иммунной толерантности [7].
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
По современным представлениям общая схема первичного иммунного ответа на внедрение в организм возбудителя инфекции выглядит следующим образом [8]. Первичное распознавание чужеродных агентов осуществляют клетки врожденного иммунитета: макрофаги и ДК. Эти клетки с помощью своих То11-подобных рецепторов (Т1_Ю и рецепторов, ассоциированных с фагоцитозом, распознают ограниченное количество молекул, наиболее типичных для возбудителей инфекционных заболеваний - т. н. молекулярных паттернов патогенов [9]. Распознавание паттернов патогенов приводит к активации макрофагов, что проявляется в продукции провоспалительных цитокинов и активации фагоцитоза. Реакция ДК на распознавание молекул микроорганизмов совершенно иная. Поглощение микроорганизмов, и, соответственно, распознавание их паттернов подавляет фагоцитоз, усиливает экспрессию молекул, необходимых для презентации антигенов поглощенных микроорганизмов и индуцирует миграцию ДК с током лимфы в Т-клеточные зоны дренирующих лимфатических узлов [2, 5, 10, 11].
В лимфатических узлах ДК представляют собранный материал наивным Т-лимфоцитами, путь рециркуляции которых проходит по маршруту: кровь - Т-клеточная зона лимфоидных органов - оттекающая лимфа - кровь [3, 4, 12]. Т-лимфоциты по сравнению с клетками естественного иммунитета обладают несравненно более широкими возможностями распознавания чужеродных объектов, поскольку они распознают практически любые чужеродные макромолекулы - антигены [8]. Распознавание антигена наивным Т-лимфоцитом приводит к его активации и запуску процесса созревания и функциональной дифференцировки. При ^ этом выбор направления дифференцировки будет зависеть от дополнительных сигналов (цитокинов и мембранных молекул), которыми ДК снабдит Т-лимфоцит, а этот набор стимуляторов, в свою очередь, определяется паттернами патогенов, которые распознала ДК [13, 14]. В результате СЭ4+ Т-лимфоцит хелпер может дифференцироваться в Т-хелпер первого типа (ТХ1) - стимулятор клеточных форм иммунных реакций и воспаления, в ТХ2, который будет стимулировать В-лимфоциты к продукции антител или в ТХ17 - стимулятор воспаления и, в первую очередь, нейтрофильной инфильтрации [8].
Функциональное созревание Т-лимфоцитов, запущенное
дендритной клеткой, сопровождается изменением набора молекул хоминга, определяющих путь миграции Т-клетки в организме. В результате большинство размножившихся и функционально активных потомков наивного Т-лимфоцита будут выходить из кровотока не в Т-клеточные зоны лимфатических узлов, а в очаг воспаления, проявляя при этом * большее сродство к тому типу ткани, откуда мигрировала ДК, запустившая весь этот процесс [15]. После завершения иммунного ответа остается значительное количество функционально зрелых антигенспецифических Т- и В-лимфоцитов, которые будут обеспечивать иммунологическую память [8].
Таким образом, формирование иммунологической памяти является результатом сложного многостадийного процесса, с участием различных типов клеток иммунной системы, поэтапно включающихся в реакцию и изменяющих не только свои функциональные свойства, но и локализацию в организме. Не вызывает сомнения, что вакцинация, целью
которой является формирование иммунологической памяти, должна, подобно инфекционному агенту, запускать все соответствующие этапы иммунной реакции. Однако оценить участие отдельных элементов этой сложной реакции в ответе на вакцину в условиях экспериментов in vivo не представляется возможным, и для подробного анализа механизмов действия вакцин или их потенциальных компонентов целесообразно использовать моделирование отдельных этапов иммунной реакции в условиях культуры клеток. Следует сразу отметить, что эксперименты in vitro не являются заменой обязательных испытаний новых вакцин на лабораторных животных и, тем более, клинических испытаний вакцин. По нашему мнению, данный экспериментальный подход наиболее целесообразен для поиска новых компонентов вакцин и их комбинаций. Особую актуальность данные исследования приобретают при разработке современных вакцин, основанных на очищенных, синтетических или рекомбинантных антигенах. Для повышения их эффективности требуются новые адъювантые компоненты, роль которых могут выполнять естественные или синтетические агонисты TLR или других распознающих структур дендритных клеток. Такие адъювантные компоненты могут не только эффективно активировать ДК и обеспечивать их миграцию в лимфатические узлы (а значит - стимулировать транспорт антигенов вакцин из места введения к Т-лимфоцитам), но и обеспечивать желательное направление иммунного ответа, т. е. выбор между клеточными и гуморальными иммунными реакциями.
Исходя из вышеизложенного, для оптимального дизайна новых вакцин представляется актуальным проведение фундаментальных и прикладных исследований по следующим направлениям:
1. Изучение значимости определенных типов иммунных реакций и спектров их антигенной специфичности для защиты от конкретных инфекционных возбудителей в моделях инфекций с использованием лабораторных животных.
2. Изучение возможностей перекрестных иммунных реакций между антигенными компонентами вакцин и молекулами человека для исключения аутоиммунных реакций на вакцины.
3. Поиск новых адъювантных компонентов, способных эффективно мобилизовать ДК и определить желательный тип иммунного ответа в экспериментах in vivo и in vitro.
4. Разработка надежных и высокопроизводительных методов оценки действия комбинаций компонентов вакцин на клетки иммунной системы in vitro.
В настоящее время учеными разных стран начаты широкомасштабные исследования по решению этих задач и в международной печати растет количество публикаций, посвященных поиску новых путей совершенствования вакцин. В следующей части обзора приведены некоторые примеры таких исследований, при выборе которых мы ограничились темой использования ДК в экспериментах in vitro.
Применение экспериментальных моделей in vitro с использованием ДК для поиска новых компонентов вакцин.
Применение ДК в исследованиях, направленных на совершенствование средств иммунопрофилактики, разберем на примере противотуберкулезных вакцин. Как известно, возбудитель туберкулеза - Mycobacterium tuberculosis, способна скрываться от иммунного ответа внутри антигенпрезенти-
рующих клеток иммунной системы. Такая изощренная стратегия выживания существенно затрудняет эрадикацию возбудителя и требует от иммунной системы мобилизацию разнообразных клеток, включая ТХ1 и цитотоксические CD8+ Т-лимфоциты. Соответственно, для формирования эффективной защиты противотуберкулезная вакцина должна вызывать активацию такого же широкого набора лимфоцитов и индуцировать формирование различных типов клеток иммунологической памяти. Ситуация с разработкой новых противотуберкулезных вакцин осложняется тем, что типичное заболевание туберкулезом не воспроизводится при заражении микобактериями обычных лабораторных животных. В результате, при разработке новых вакцин ученые вынуждены широко использовать клетки человека в экспериментах in vitro.
Для профилактики туберкулеза в странах с высоким распространением этого заболевания используется живая вакцина БЦЖ, содержащая бациллу Calmette-Guerin (Mycobacterium bovis). Применение этой вакцины сыграло выдающуюся роль в борьбе с инфекцией и позволило переломить катастрофическую ситуацию, сложившуюся с туберкулезом в конце XIX - начале XX веков. Однако, несмотря на широкое использование этой вакцины, туберкулез в развивающихся странах до сих пор остается одной из ведущих причин смертности. Такой ограниченный успех исследователи связывают с недостаточной иммуногенностью БЦЖ [16, 17]. Ситуация носит парадоксальный характер. С одной стороны, общеизвестны высокие иммуностимулирующие и адъювантные свойства БЦЖ. В то же время, этих иммуностимулирующих свойств оказывается недостаточно для формирования надежной специфической защиты от такого «сложного» заболевания, как туберкулез.
Для выяснения вопроса о причинах недостаточной имму-ногенности БЦЖ и возможных путях ее повышения Elena Giacomini с соавт. [18] провела сравнительный анализ действия БЦЖ и M. tuberculosis на ДК человека in vitro. Исследователям удалось обнаружить относительную слабость БЦЖ, как индуктора экспрессии гена интерферона-р (ИНФ-р) в ДК, по сравнению M. tuberculosis. Введение в культуру экзогенного ИНФ-р нивелировало различия иммуностимулирующих свойств ДК, зараженных БЦЖ и M. tuberculosis. Авторы обсуждают возможность использования ИНФ-р, как адъюванта при БЦЖ-вакцинации.
Перспективным представляется разработка новых противотуберкулезных вакцин на основе рекомбинантных или синтетических антигенов и паттернов M. tuberculosis. Следует отметить, что поиск иммуностимулирующих молекул микобактерий ведется давно. Около полувека назад была идентифицирован корд-фактор (трегалозы 6,6'-димиколат). Затем, стимулирующие свойства были обнаружены у микобактериальных восков, липоарабино-маннана и маннозида фосфатидилинозитола. В экспериментах с мышиными ДК стимулирующие свойства были обнаружены у полярных липидов микобактерий: у трех фосфолипидов и трех фософогликолипидов [19]. В экспериментах с использованием ДК человека иммуностимулирующая активность БЦЖ была связана с её неполярными липидами. Дальнейший анализ позволил выявить наиболее простую структуру, воспроизводящую иммуностимулирующую активность (мономиколил глицерол) и синтезиро-
вать её аналог [20].
Недавние исследования показали, что паттерны M. tuberculosis могут как стимулировать, так и подавлять продукцию ИНФ первого типа дендритными клетками. Так, агонисты TLR9 стимулируют продукцию ИНФ, тогда как агонисты TLR2 - подавляют продукцию ИНФ и связанную с ним перекрестную презентацию антигенов на молекулах главного комплекса гистосовместимости первого типа. Как известно, перекрестная презентация поглощенных фагоцитозом антигенов на этих молекулах необходима для вовлечения в реакцию цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов. Соответственно, полученные данные свидетельствуют о том, что при разработке вакцины, состоящей из чистых антигенов, в качестве адъювантных компонентов предпочтительнее использовать микобактериальные агонисты TLR9, а не TLR2 [21]. Трафик антигена дендритными клетками и вовлечение CD8+ Т-киллеров в иммунную реакцию также усиливает конъюгирование антигена с агонистами TLR7 [22].
Широко обсуждаемым в научной литературе подходом для увеличения иммуногенности вакцин является введение в их состав цитокинов или (в случае живых вакцин) их генов. Так, экспрессия в БЦЖ важнейшего фактора созревания ДК -гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора - приводит к увеличению количества и активности ДК в легких мышей и усилению ответа CD4+ Т-лимфоцитов на вакцинацию. Данная экспериментальная вакцина по сравнению с обычной БЦЖ эффективнее защищала иммунодефи-цитных RAG1-/- мышей от M. tuberculosis [23].
Следует отметить, что при создании вакцин антигены инфекционного агента можно комбинировать с паттернами иного происхождения. В связи с этим представляет интерес ^ разработка адъювантов на основе вирусных векторов, экспрессирующих гены цитокинов. Так, разработанный Sekine с соавт. аденовирусный вектор, экспрессирующий Flt3 лиганд (стимулятор гемопоэза и созревания лимфоидных ДК), при интраназальном введении усиливает активность лимфоидных ДК и индуцирует ответ ТХ2, а также ТХ1 и цитотоксических Т-лимфоцитов на антиген, введенный вместе с аденовирусом [24].
За 2 последних года появились работы, посвященные решению методических вопросов тестирования вакцин на ДК in vitro. В работе Ма с соавт. предлагается приблизить культуральную модель исследования потенциальных адъювантов к условиям естественного микроокружения. Для этого авторы использовали сложную культуральную систему, являющуюся продуктом тканевой инженерии (слой эндотелиальных клеток на трехмерном коллагеновом геле) [25]. Acharya с соавт. разработали высокопроизводительный микрометод позволяющий обеспечить воздействие различ- ^ ных концентраций антигенного и адъювантного компонентов вакцины на ДК с использованием микрочастиц-сорбентов из полиШ^-лактид-ко-гликолида) и модифицированной поверхности, обеспечивающей стандартизованную ко-локализацию ДК и микрочастиц [26].
Относительно мало исследованными остаются вопросы действия вакцин на миграцию ДК человека. Имеющийся материал ограничен исследованием миграции ДК in vivo у вакцинированных животных [27], имеются единичные работы по изучению действия на миграцию ДК in vitro широко используемых адъювантов [28]. Valerie Abadie с соавт. с
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
ivk
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
использованием двух флуоресцентных штаммов БЦЖ показали, что в ранние сроки после введения микроорганизмов ДК не приносят в дренирующие лимфатические узлы сколь либо значимого количества материала вакцины [29]. Эти данные свидетельствуют о необходимости исследования действия вакцин на миграционные характеристики ДК
и, соответственно, на трафик антигенов вакцин.
Материалы исследований действия вакцин против туберкулеза и гепатита В на ДК человека, проводимые в Нижегородском НИИ эпидемиологии и микробиологии представлены в этом журнале в виде отдельной стати.
Заключение
В изложенном выше материале представлены лишь малая часть данных о физиологической роли и методах исследования ДК в вакцинологии. Тем не менее, приведенная информация не оставляет сомнений в целесообразности исследований ДК для разработки новых средств специфической иммунопрофилактики инфекционных заболеваний.
ЛИТЕРАТУРА
1. Janeway C. Approaching the asymptote? Evolution and revolution in immunology. Cold Spring Harb. Symp.Quant.Biol. 1989. № 54. Р. 1-13.
2. Steinman R.M. The dendritic cell system and its role in immunogenicity. Annu. Rev. Immunol. 1991. № 9. Р. 271-296.
3.Cahalan M.D., Parker I. Imaging the choreography of lymphocyte trafficking and the immune response. Curr. Opin. Immunol. 2006. № 18. Р. 476-482.
4. Lammermann T., Sixt M. The microanatomy of T-cell responses. Immunol. Rev. 2008. № 221. Р. 26-43.
5.Randolph G. J., Angeli V., Swartz M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph node through lymphatic vessels. Nat. Rev. Immunol. 2005. № 5. Р. 617-628.
6.Amsen D., Spilianakis G., Flavell R.A. How are Th1 and Th2 effector cell made? Cur. Opin. Immunol. 2009. № 21 (2). Р. 153-160.
7.Ярилин А.А., Донецкова А.Д. Естественные регуляторные Т-клетки и фактор FoxP3. Иммунология. 2006. № 27. С. 176-188.
8. Ярилин А.А. Иммунология. М.: ГЭОТАР Медиа, 2010. С. 970.
9. Симбирцев А.С. Толл-белки: специфические рецепторы неспецифического иммунитета. Иммунология. 2005. № 26. С. 3 68-377.
10. Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Физиология клеток врожденной иммунной системы: дендритные клетки. Иммунология. 2006. № 27. С. 368-378.
11. Wu L., Dakie A. Development of dendritic cell system. Cell. Mol. Immunol. 2004. № 1. Р. 112-118.
12. Guermonprez P., Valladeau J., Zitvogel L., Thery C., Amigorena S. Antigen presentation and T cell stimulation by dendritic cells. Annu. Rev. Immunology. 2002. № 20. Р. 621-667.
13. Stagg AJ., Hart A.L., Knight C.S., Kamm M.A. The dendritic cell: its role in intestional inflammation and relationship with gut bacteria. Gut. 2003. № 52. P. 1522-1529.
14. Iwasaki A., Medzhitov R. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses. Nat. Immunol. 2004. № 5. P. 987-995.
15. Villablanca E.J., Russo V., Mora R. Dendritic cell migration and lymphocyte homing imprinting. Histol. Histopathol. 2008. № 23. P. 897-910.
16. Trunz B.B., Fine P., Dye C. Effect of BCG vaccination on childhood tuberculous meningitis and miliary tuberculosis worldwide: a meta-analysis and assessment of cost-effectiveness. Lancet. 2006. № 367. P. 1173-1180.
17. Maartens G., Wilkinson R.J. Tuberculosis. Lancet. 2007. № 370. P. 2030-2043.
18. Giacomini E., Remoli M.E., Gafa V. et al. IFN-p improves BCG immunogenicity by acting on DC maturation. Journal of Leukocyte Biology. 2009. № 85. P. 462-468.
19. Sprott G.D., Dicaire C.J., Gurnani K., Sad S., Krishnan L. Activation of dendritic cells by liposomes prepared from phosphatidylinositol mannosides from Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin and adjuvant activity in vivo. Infect. Immun. 2004. № 72. P. 5235-5246.
20. Andersen C.S., Agger E.M., Rosenkrands I. et al. A Simple Mycobacterial Monomycolated Glycerol Lipid Has Potent Immunostimulatory Activity. The Journal of Immunology. 2009. № 182. P. 424-432.
21. Simmons D.P., Canaday D.H., Liu Y. et al. Mycobacterium tuberculosis and TLR2 agonists inhibit induction of type I IFN and class I MHC antigen cross processing by TLR9. J Immunol. 2010. № 185 (4). P. 2405-2415.
22. Oh J.Z., Kedl R.M. The capacity to induce cross-presentation dictates the success of a TLR7 agonist-conjugate vaccine for eliciting cellular immunity. J Immunol. 2010. № 185 (8). P. 4602-4608.
23. Nambiar J.K., Ryan A.A., Kong C.U., Britton W.J., Triccas J.A. Modulation of pulmonary DC function by vaccine-encoded GM-CSF enhances protective immunity against Mycobacterium tuberculosis infection. Eur J Immunol. 2010. № 40 (1). P. 153-161.
24. Sekine S., Kataoka K., Fukuyama Y. et al. A novel adenovirus expressing Flt3 ligand enhances mucosal immunity by inducing mature nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissue dendritic cell migration. J Immunol. 2008. № 180 (12). P. 8126-34.
25. Ma Y., Poisson L., Sanchez-Schmitz G. et al. Assessing the immunopotency of Toll-like receptor agonists in an in vitro tissue-engineered immunological model. Immunology. 2010. № 130 (3). P. 374-387.
26. Acharya A.P., Clare-Salzler M.J., Keselowsky B.G. A high-throughput microparticle microarray platform for dendritic cell-targeting vaccines. Biomaterials. 2009. № 30 (25). P. 4168-4177.
27. Furmanov K., Elnekave M., Lehmann D., Clausen BE, et al. The role of skin-derived dendritic cells in CD8+ T cell priming following immunization with lentivectors. J Immunol. 2010. № 184 (9). P. 4889-4897.
28. Seubert A., Monaci E., Pizza M., O'Hagan D.T., Wack A. The adjuvants aluminum hydroxide and MF59 induce monocyte and granulocyte chemoattractants and enhance monocyte differentiation toward dendritic cells. J Immunol. 2008. № 180 (8). P. 5402-5412.
29. Abadie V., Badell E., Douillard P., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 2005. № 106. P. 1843-1850.
