CC BY
125
тем самым выживание живых организмов в усложняющихся условиях окружающей среды.
Их фундаментальной основой должна явиться максимально приближенная к естественно сформировавшейся природе модель саморегуляции, адекватная тому состоянию живых организмов, в котором они находятся в настоящее время. Оно определяется "апасами адаптации, которые сохранились и дошли до наших дней в живых организмах на историческом, геологическом промежутке времени. Поскольку эти запасы контролирует стресс, необходим постоянный мониторинг его уровня, который во"можен на основе пока"ателей эндофитной микробиоты, в особенности - частоты отрицательного теста, отражающего окислительный стресс.
В связи со сказанным, рекомендуется микро"ональное ра"мещение ра"личных, в том числе плодовых культур, в местах с наиболее оптимальными условиями для их биологии, своевременный и тщательный уход, исключение или применение лишь в случае крайней необходимости всево"можных химикатов, поиск неординарных подходов к решению проблемы.
Ориентиром для выбора микро"он наряду с "аповедниками могут служить центры происхождения и естественного прои"растания культурных растений, так как потребность в тех или иных условиях "аложена и сохраняется в их генетической памяти. Так, например, народное название смородины «поречница» исчерпывающе отражает особенности экологии, необходимые для ее биологии.
И"вестно, что облепиха нуждается в очень чистой проточной воде. И"вестно также, что с целью сохранения этой ценной культуры, в сильной степени подверженной усыханию, в Китае ее семена ра"брасывают с самолетов в природных очагах прои"растания этого растения.
Исполь"ование всякого рода "ащитных средств в виде теплиц, пленочных укрытий, парников, траншей (в Китае - для производства земляники) и др. уже является обычным.
Россия в лице таких всемирно известных ученых и мыслителей как Вавилов Н.И., Вернадский В.В., Болотов А.Т., Мичурин И.В. и др. имеет глубокую теоретическую основу для органи"ации жи"ни и хо"яйственной деятельности человека на принципах, со"данных самой природой путем ее саморегуляции на всех уровнях от клетки до биосферы, которые крайне актуальны и могут быть успешно претворены в жизнь в новом столетии.
Литература
1. Гиббс. У. «Теневая» часть генома: за
пределами ДНК [Текст]/ У. Гиббс // В мире науки,
2004. - С. 65-71.
2. Макаров, В.В. Внутриклеточный паразитизм и протективный иммунитет [Текст]/ В. В. Макаров, И. А. Бакулов, А. Л. Семенихин, В.В. Филиппов // Вестник РАСХН. - 1994. - №3. - С. 45-49.
3. Селье, Г. На уровне целого организма [Текст]/ Г. Селье // М. - 1972. - С 119.
4. Хесин, Р.Б. Непостоянство генома [Текст]/ Р. Б. Хесин // М. - Наука, 1984. - 472.
5. Рубинштейн, Е. С. Современное изменение климата [Текст]/Е. С. Рубинштейн, Л. Г. Полозова. -Ленинград, 1966. - 268 с.
УДК 679.64:631.427.2
С.Н. Петрова, кандидат сельскохозяйственных наук ФГОУ ВПО Орел ГАУ Е.Е. Андронов, А.Г. Пинаев, кандидаты биологических наук Е.В. Першина, аспирант ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург)
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
В ПОЧВЕННОЙ ЭКОЛОГИИ
Показаны возможности современных молекулярных методов в экологии микроорганизмов почвы. Демонстрирлется анализ динамики почвенных микроорганизмов во всех основных группах (грибы, археи, бактерии) с использованием ПЦР с детекцией в реальном времени и анализ видовой структуры с помощью метода T-RFLP.
Ключевые слова: микробное сообщество почвы, ПЦР с детекцией в реальном времени, T-RFLP.
Молекулярная биология - это не только сложная фундаментальная наука, но и точный инструмент в руках исследователя.
Применение молекулярных методов анали"а сделало биологию точной наукой, поскольку по"волило ей поль"оваться при исследовании чистыми биологическими субстанциями (молекулами,
Possibilities of modern molecular methods in ecology of microorganisms of soil are shown. The analysis of dynamics of soil microorganisms in all the main groups (fungi, archaea, bacterium) using the PCR with real time detection and the analysis of species of all the indicated components using T-RFLP.
Key words: soil microbial communities, PCR Real-time, terminal restriction fragments length polymorphysm (T-RFLP).
клетками) применять методы, дающие однозначные результаты. В связи с этим значительно возросла доказательная база биологических исследований, проводимых с использованием новой методологии. Следствием широкого проникновения молекулярной биологии практически во все сферы биологической науки явилось появление новых пищевых продуктов,
диагностических препаратов, реагентов, новых сортов растений, пород животных и т.д. Объем знаний, полученных "а последние десятилетия, сопоставим с объемом, накопленным в области биологии "а несколько веков ее существования. Только в международной базе генетических данных вепБапк число нуклеотидных последовательностей ежегодно удваивается и на сегодняшний день превышает 70 миллионов [1, 2].
Ныне любое исследование, претендующее на концептуальность и "начимость, по во"можности должно включать молекулярно-генетическое подкрепление.
Несомненные перспективы практического применения молекулярно-генетические методы имеют в почвенной экологии с целью и"учения и профилирования микробного почвенного сообщества. Идея "аключается в том, что структура микробного сообщества почв является тонким и чувствительным индикатором ее экологического благополучия и плодородия.
Особенностью микробного сообщества почвы является его крайне высокая численность, составляющая до нескольких миллиардов микрооргани"мов в одном грамме почвы и исключительное генетическое ра"нообра"ие, достигающее, как минимум, нескольких тысяч таксономических групп. Особенно важно отметить, что большинство и" этих микрооргани"мов являются некультивируемыми, и, как следствие, мало известными науке. Микробное сообщество почвы, его генетическая структура, очень точно и быстро от"ывается на всякий внешний фактор, будь то температура, влажность, и"быток или недостаток питательных субстратов, "асоление или и"менение pH. Однако данный процесс изучен мало, особенно в свете последних достижений молекулярной экологии микрооргани"мов, демонстрирующих гора"до более высокое ра"нообра"ие микробиоты почвы, чем предполагалось ранее [3, 4, 5].
Именно для восполнения данного пробела, а также для поиска эффективных средств мониторинга экологического состояния почв в течение трех лет нами были реали"ованы проекты (поддержанные РФФИ), свя"анные с исследованием и"менений почвенного биора"нообра"ия в ответ на во"действие биотических и абиотических факторов.
Исполь"ование современных методов
молекулярно-генетических анали"ов, не свя"анных с культивированием микрооргани"мов на питательных средах, по"волило и"учить все эколого-трофические группы микрооргани"мов почвенного сообщества, включая бактерии, археи и грибы.
Материалы и методика исследований
ДНК выделяли из навески почвы 0.5 г, которую отбирали в пластиковую пробирку (2 мл) с "авинчивающейся крышкой. К каждой навеске добавляли 750 мкл буфера I (СТАВ 2%; ТЫ8-НС1
0.1М; ББТА 20 мМ; ШС1 1.4 М; рН=8.5) и 0.5 г стеклянных шариков (0.35 мм). Пробы прогревали в течение 30 мин при 65 С. Разрушение пробы проводили в гомогенизаторе Ра81Ргер 24
(M.P.Biomedicals) в течение 1 мин при максимальной интенсивности встряхивания (6.5 м/с). Затем прогревание повторяли. Пробу дважды экстрагировали хлороформом, суммарную ДНК осаждали
изопропанолом, растворяли в 100 мкл буфера TE (TRIS-HCl 10 мМ; EDTA 1 мМ) и смешивали со 100 мкл расплавленной 2% легкоплавкой агарозы (Sigma). После застывания агарозные блоки несколько раз отмывали в 2-х мл буфера TE (3 раза по 3 часа). Далее агарозу расплавляли при 65 С, добавляли ацетат натрия до конечной концентрации 0.3 М, дважды экстрагировали фенолом, один ра" фенол-хлороформом (1:1), один раз хлороформом, последний раз отбирали 350 мкл водной фазы. ДНК осаждали изопропанолом, промывали 70% этанолом, подсушивали и растворяли в 50 мкл воды. Выход ДНК был весьма значителен и составлял не менее 2 мкг ДНК на 1 г почвы.
Определение численности основных групп микроорганизмов проводили с использованием ПЦР с детекцией в реальном времени (Real-time). В качестве контроля для бактерий исполь"овали клонированные фрагменты таксономически "начимых генов: 16S
рРНК Escherichia coli для количественного
определения бактерий, 16S рРНК штамма FG-07 Halobacterium salinarum (данные неопубликованы, Г.Юргенс, Университет Хельсинки) для
количественного определения архей, ITS штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae Meyen 1B-D1606 для количественного определения грибов. Были использованы следующие праймеры:
Eub338/Eub518 - для бактерий [6], arc915f/arc1059r -для архей [7], ITS1f/5.8s - для грибов [6]. Указанные праймеры исполь"овали для количественного
определения штамма ГММ со следующим температурным профилем: 94°С - 10 с ; 63°С - 10 с ; 72°С - 30 с; детекцию флюоресценции проводили при 72°С. Во всех случаях использовали Taq-полимеразу (Хеликон) - 2 ед. на реакцию, в реакционную смесь добавляли SYBR-green (Amresco) до конечной концентрации 0.3х и флюоресцеина изотиоцианат (конечная концентрация 10 нм). ПЦР с детекцией в реальном времени проводили в амплификаторе iCycler (BioRad) в трех повторностях. Для обработки результатов количественной ПЦР использовали программное обеспечение, прилагающееся к прибору iCycler. Количественные характеристики выражали в числе копий РНК-оперонов.
Анализ таксономической структуры микробных сообществ осуществлялся с помощью метода T-RFLP (terminal Restriction Fragments Length Polymorphysm) Для T-RFLP использовали следующие праймеры: 63f/1494r - для бактерий [8], Ar3f/Ar927r - для архей [9], ITS1/ITS4 [10], причем праймеры 63f, Ar3f, ITS1 были флюоресцентно мечены (флюорофор D4, инфракрасный, для системы CEQ8000 Beckman Coulter, Sigma). ПЦР проводили с использованием Taq-полимеразы (Хеликон) со стандартным буфером с добавлением BSA до конечной концентрации 100 мкг/мл, в соответствии с указаниями упомянутых выше авторов. Тотальную почвенную ДНК разводили в 10 раз и использовали для ПЦР в количестве 1 мкл
1.00Е+10
1.00Е+09
1.00Е+08
1.00Е+07
3
1.00Е+06
1.00Е+05
Сутки
1
уже заняты, а само сообщество находится в состоянии равновесия [12, 13, 14].
Заключение
Результаты наших исследований демонстрируют реальный потенциал современных молекулярных методов в экологии микроорганизмов. Их преимущество по сравнению с классическими бесспорно. Существующие на сегодняшний день методы молекулярно-генетического анализа позволяют в полной мере оценить структурнофункциональные особенности микробного сообщества окружающей среды: идентификация
таксономических групп ра"личного уровня, определение структуры (видового состава) микробиологических сообществ, мониторинг штаммов (генов) в окружающей среде.
Молекулярная биология создает базу для ра"вития новых технологий, влияние которых распространяется практически во все науки и всё глубже проникает в наш быт.
Работы осуществлялись при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований в рамках выполнения гранта РФФИ №09-04-90815 и №09-04-00386.
Литература
1. Ярилин, А. А. Золушка становится принцессой, или место биологии в иерархии наук [Текст]/ А.А. Ярилин // Эколония и жизнь. - 2008. -№12. - с. 10.
2. Лукашов, В.В. Молекулярная эволюция и филогенетический анализ [Текст]/ В.В. Лукашов. -М.: БИНОМ. 209. - 256 с.
3. Hoppener-Ogawa, S. Specific detection and realtime PCR quantification of potentially mycophagous bacteria belonging to the genus collimonas in different soil ecosystems [ТехЦ/ S. Hoppener-Ogawa, J.H.J. Leveau, W. Smant, J.A. van Veen, W. de Boer // Appl. Environ. Microbiol. - 2007. - V. 73. - 13. - P. 41914197.
4. Sung-Keun, R. Estimation of Distribution of a Commensal Thermophile in Soil by Competitive Quantitative PCR and Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis [ТехЦ/ R. Sung-Keun, S. Hong, J. Bae, C. Jeon, S. Lee, J. Song, H. Poo, M. Sung //J. Microbiol. Biotechnol. - 2001. - Vol. 11. -No. 6. - P. 940-945.
5. Chen, A., Molecular detection and direct enumeration of methanogenic Archaea and methanotrophic Bacteria in domestic solid waste landfill soils [ТехЦ/ A. Chen, K. Ueda, Y. Sekiguchi, A. Ohashi, H. Harada // Biotechnol. Lett. - 2004. - V. 25. 18. -P. 1563-1569.
6. Fierer, N. Assessment of soil microbial community structure by use of taxon-specific quantitative PCR assays [ТехЦ/ N. Fierer, J.A. Jackson, R. Vilgalys, R.B. Jackson // Appl. Environ. Microbiol.
2005. Vol. 71, No. P. 4117-4120.
7. Yu, Y. Group-specific primer and probe sets to detect methanogenic communities using quantitative real-time polymerase chain reaction [ТехЦ/ Y. Yu, Ch. Lee, J. Kim, S. Hwang // Biotechnol. Bioeng. - 2005. -Vol. - 89. No. - 6., P - 670-679.
8. Singh, B.K. Use of Multip^ Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism for Rapid and Simultaneous Analysis of Different Components of the Soil Microbial Community [ТехЦ/ B.K. Singh, L. Nazaries, S. Munro, I.C. Anderson, K.D. Campbell // Appl. Environ. Microbiol. - 2006. - Vol. 72. - No. 11. -P. 7278-7285.
9. Sung-Keun, R. Estimation of Distribution of a Commensal Thermophile in Soil by Competitive Quantitative PCR and Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis. [ТехЦ/ R. Sung-Keun,
S. Hong, J. Bae, C. Jeon, S. Lee, J. Song, H. Poo, M. Sung //J. Microbiol. Biotechnol. - 2001. - Vol. 11. -No. 6. - P. 940-945.
10. Innis, M. A., and D. H. Gelfand. PCR protocols: a guide to methods and applications [ТехЦ San Diego, Calif. - Academic Press. - 1990.
11. Malferrari, G. High-quality genomic DNA from human whole blood and mononuclear cells [ТехЦ/ G. Malferrari, E. Monferini, P. DeBlasio, G. Diaferia, G. Saltini, E. Del Vecchio, L. Rossi-Bernardi, I. Biunno // BioTechniques. - 2002. - Vol. 33. - No. 6. P. - 12281230.
12. Amarger, N. Genetically modified bacteria in agriculture [Теxt]//Biochimie. 2002. V. 84. P. 10611072.
13. Hirsh, P.R. Release of transgenic bacterial inoculants -rhizobia as a case study // Plant and Soil. -2004. - V. - 266.P. 1-10.
14. Андронов, E.E. Влияние внесения
генетически модифицированного штамма Sinorhizobium meliloti ACH-5 на структуру почвенного сообщества микроорганизмов [Текст]/ E.E. Андронов, С.Н. Петрова, Е.П.Чижевская, Е.В. Коростик, Г.А. Ахтемова, А.Г Пинаев. // Микробиология. - 2009. - Т.78. - №4. - с. 1-10.
Вестник №5(26)
ОрелГАу октябрь 2010
Теоретический и научно-практический журнал. Основан в 2005 году
Учредитель и издатель: Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Орловский государственный аграрный Университет»_____________________________________________
Редакционный совет: Парахин Н.В. (председатель) Амелин А.В. (зам. председателя) Астахов С.М.
Белкин Б.Л.
Блажнов А.А.
Буяров В.С.
Гуляева Т.И.
Гурин А.Г.
Дегтярев М.Г.
Зотиков В.И.
Иващук О.А.
Козлов А.С.
Кузнецов Ю.А.
Лобков В.Т.
Лысенко Н.Н.
Ляшук Р.Н.
Мамаев А.В.
Масалов В.Н.
Новикова Н.Е.
Павловская Н.Е.
Попова О.В.
Прока Н.И.
Савкин В.И.
Степанова Л.П.
Плыпун С.А. (ответств. секретарь) Ермакова Н.Л. (редактор)
Адрес редакции: 302019, г. Орел, ул. Генерала Родина, 69. Телефон: (4862)454037 Факс: (4862)454064 E-mail: nichоgau@yandex.ru Сайт журнала: http://ej.orelsau.ru
Свидетельство о регистрации ПИ 6ФС77-21514 от 11.07. 2005 г.
Технический редактор Мосина А.И. Сдано в набор 14.10.2010 Подписано в печать 28.10.2010 Формат 60x84/8. Бумага офсетная. Гарнитура Таймс.
Объём 12,5 усл. печ. л. Тираж 300 экз. Издательство Орел ГАУ, 302028, г. Орел, бульвар Победы, 19. Лицензия ЛР6021325 от 23.02.1999 г.
Журнал рекомендован ВАК Минобрнауки России для публикаций научных работ, отражающих основное научное содержание кандидатских и докторских диссертаций
Содержание номера
Научное обеспечение устойчивого развития АПК и сельских территорий
Парфенов А.С. Демографический кризис: социальное прогнозирование и материнский
капитал............................................................................... 2
Студенникова Н.С. Влияние производственного травматизма на демографическую
ситуацию сельских территорий на примере Орловской области............................. 6
Кузнецова Т.М. Диагностика и оценка эффективности кадровой политики
сельскохозяйственных организаций...................................................... 9
Каменева К.П. Совершенствование управления формированием и развитием человеческого
капитала в аграрном секторе........................................................... 11
Ушаков А.А. Эффективное функционирование системы внутреннего контроля в бюджетных
организациях.......................................................................... 14
Полухин А.А., Алпатов А.В. Развитие рынка зерноуборочных комбайнов в АПК Орловской
области............................................................................... 19
Поздняков В.Ю. Эффективность различных вариантов обновления материальнотехнической базы АПК................................................................ 22
Коробко А.В., Абашин Е.Г. Инновационный способ определения основных качественных параметров желе"обетонных конструкций бе" предварительного напряжения арматуры по
результатам вибрационных испытаний.................................................... 26
Баранов Ю.Н., Трясцин А.П. Анализ и оценка риска при перевозке опасных грузов
автомобильным транспортом в АПК....................................................... 29
Г альянов И.В. Исследование инвестиционных затрат на повышение безопасности
машин................................................................................. 33
Кошечкин Ю.В., Барабанова С.Н. Корпоративное обучение вопросам охраны труда -
ступень к созданию системы управления профессиональными рисками в организации......... 36
Семенютина А.В., Подковырова Г.В. Особенности реконструкции рекреационноозеленительных насаждений урбанизированных территорий Нижнего Поволжья.............. 39
Научное обеспечение развития растениеводства
Ищенко Л.А., Козаева М.И., Маслова М.В., Зайцева К.В., Логинов М.В., Акимов В.П.
Климат, стресс и проблема репродукции у растений в новом столетии на примере плодовых
культур............................................................................... 42
Петрова С.Н., Андронов Е.Е., Пинаев А.Г., Першина Е.В. Перспективы использования
методов молекулярно-генетического анализа в почвенной экологии........................ 45
Степанова Л.П., Стародубцев В.Н., Степанова Е.И. Экологическая эффективность исполь"ования предпосевной обработки семян водными вытяжками и" горных пород и
вермикомпостов........................................................................ 49
Богомолов А.А. Урожайность и качество семян люцерны при обработке посевов
регуляторами роста и микроудобрениями в Северном Зауралье............................. 53
Чекалин Е.И., Амелин А.В., Кондыков И.В. Изменение показателей архитектоники, роста и ра"вития растений гороха полевого в процессе селекции на высокую урожайность
семян................................................................................. 56
Головина Е.В. Влияние погодных условий на накопление и реутилизацию азота сортами
сои................................................................................... 58
Корниенко H.H., Бобков С.В., Кондыков И.В. Компонентный состав запасных белков как
критерий оценки сортов гороха на отличимость, однородность и стабильность.............61
Титова Е.М., Внукова М.А. Влияние некоторых элементов технологии на урожайность и
качество зерна ячменя.................................................................64
Карташов А.В. Фотосинтетическая продуктивность сортов средневолокнистого хлопчатника
на богаре............................................................................. 68
Павловская Н.Е., Гагарина И.Н., Горькова И.В., Козявина К.Н., Муштакова В.М.,
Фомина В.А., Роговин В.В. Пероксидазозависимый иммунитет гороха к фузариозу........... 72
Абдуллаева М.М., Валиханов М.Н., Бабаханова Д.Ш. Роль эндогенной фосфолипазы Д в
превращениях фосфолипидов при прорастании семян кукурузы.............................. 75
Хатефов Э.Б., Кагермазов А.М., Малухов З.М., Кушхова М.С. Корреляционные связи между семенной плодовитостью и морфобиологическими и цитологическими при"наками тетраплоидной кукурузы.............................................................. 77
Научное обеспечение развития молочного скотоводства
Шендаков А.И., Шендакова Т.А. Влияние генетических и средовых факторов на интенсивность роста и молочную продуктивность чёрно-пёстрого гоштинизированного
скота................................................................................. 83
Безбородов П.Н. Абомазо-руминальный рефлюкс - фактор нарушения обмена веществ у
высокопродуктивных молочных коров..................................................... 91
Петрушина М.В. Влияние Хотынецких цеолитов и лецитина на физиолого-биохимический
статус высокоудойных коров при промышленном содержании................................ 95
Бунькова H.H., Калинин В.А., Козлов И.А., Козлов А.С. Особенности энергетического питания коров по периодам лактации.................... ............................. 97
© ФГОУ ВПО Орел ГАУ, 2010
