CC BY
4
УДК/UDC 615.015.8+615.322:579.842.11
ПЕРСПЕКТИВА СНИЖЕНИЯ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ С ПОМОЩЬЮ РАСТИТЕЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
У ESCHERICHIA COLI
PROSPECT OF REDUCING ANTIBIOTIC RESISTANCE IN ESCHERICHIA COLI
WITH HERBAL MEDICINES
Шульга И.С.,* кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник отдела микробиологии, вирусологии и иммунологии Shulga I.S., Candidate of Biological Sciences, Leading Researcher of Department
Microbiology, Virology and Immunology Остякова M.E., доктор биологических наук, доцент, директор Ostyakova M.E., Doctor of Biological Sciences, Associate Professor, Director Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Дальневосточный зональный научно-исследовательский ветеринарный
институт, Благовещенск, Россия Federal State Budgetary Scientific Institution Far East Zone Research Veterinary
Institute, Blagoveshchensk, Russia *E-mail: [email protected]
Широкое применение в медицинской и ветеринарной практике антимикробных препаратов привело к появлению устойчивых штаммов и возникновению глобальной проблемы человечества - антибиотикорезистентности. Тем не менее, использование антибиотиков остается одним из основных направлений фармакотерапии для лечения заболеваний, вызываемых патогенной и условно-патогенной микрофлорой. Поэтому разработка мер по преодолению устойчивости микроорганизмов к антибактериальным препаратам довольно актуальное направление исследований. Изучение чувствительности к антимикробным препаратам у Escherichia coli, выделенных из биоматериала от телят с признаками желудочно-кишечных заболеваний, выявило резистентность к четырем из двенадцати препаратов. После воздействия на бактерии факторов растительного происхождения установлено, что отвары гранатовых корок и плодов черемухи, настои соплодий ольхи, травы тысячелистника обыкновенного и корня горца змеиного повышали чувствительность культур Escherichia coli к гентамицину, ципрофлоксацину, норфлоксацину, левофлоксацину, имепенему, цевтриаксону, цефиксиму и цефтазидиму, в ряде случаев к стрептомицину и доксициклину и практически не влияли на чувствительность к ампициллину и амоксициллину в сочетании с клавуналовой кислотой. Выраженная способность изучаемых факторов повышать
антибиотикочувствительность подтверждается среднестатистическими данными зон
подавления роста у Escherichia coli до и после влияния факторов. После воздействия отвара плодов черемухи чувствительность у культур повысилась к десяти антимикробным препаратам, отвара гранатовых корок - к одиннадцати, настоев соплодий ольхи, травы тысячелистника и корня горца змеиного - к восьми препаратам. Полученные экспериментальные данные по изучению влияния факторов растительного происхождения на чувствительность к антимикробным препаратам in vitro показывают возможность их применения in vivo для профилактики и лечения острых желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных.
Ключевые слова: антимикробные препараты, резистентность, Escherichia coli, растительные лекарственные средства
The widespread use of antimicrobials in medical and veterinary practice led to the appearance of resistant strains and the emergence of a global problem of the mankind - antibiotic resistance. Nevertheless, the use of antibiotics remains one of the main directions of pharmacotherapy for the treatment of diseases caused by pathogenic and opportunistic microflora. Therefore, the development of measures to overcome the resistance of microorganisms to antibacterial drugs is a rather relevant area of research. The study of sensitivity to antimicrobial drugs of Escherichia coli isolated from biomaterial of calves with signs of gastrointestinal diseases revealed resistance to four out of twelve drugs. Exposure of bacteria to factors of plant origin revealed that decoctions of pomegranate peel and
bird cherry fruit, infusions of alder bark, yarrow herb and snakeweed root increased the sensitivity of Escherichia cultures to gentamicin, ciprofloxacin, norfloxacin, levofloxacin, imepenem, ceftriaxone, cefixime, ceftazidime, and in some cases, to streptomycin and doxycycline. It barely affected sensitivity to ampicillin and amoxicillin in combination with clavunalic acid. The pronounced ability of the studied factors to increase antibiotic sensitivity is confirmed by the average statistical data of growth suppression zones in Escherichia coli before and after the influence of the factors. After exposure to decoction of bird cherry fruit, the sensitivity of Escherichia cultures increased to ten antimicrobial agents, decoction of pomegranate peel - to eleven, infusion of alder bark, yarrow herb, and snakeweed root - to eight drugs. The obtained experimental data on the influence of factors of herbal origin on the sensitivity to antimicrobial drugs in vitro show the possibility of their use in vivo for the prevention and treatment of acute gastrointestinal diseases of young farm animals. Keywords: antimicrobials, resistance, Escherichia coli, herbal medicines
Введение. Заболевания органов пищеварения занимает особое место среди других видов патологий молодняка сельскохозяйственных животных, в том числе и в хозяйствах занимающихся разведением и выращиванием крупного рогатого скота. Эта патология сопровождается серьезными экономическими потерями, что обусловлено падежом, выбраковкой, снижением среднесуточных привесов, расходами на лечение [1, 2].
Микробиологическая диагностика при массовых желудочно-кишечных заболеваниях новорожденных телят с признаками диареи позволяет выявить микрофлору, участвующую в развитии патологического процесса. Чаще всего в качестве этиологического фактора выступает смешанная микрофлора. Патогенные и условно-патогенные Escherichia coli, играют зачастую главную роль в данном вопросе [3] .
Профилактика болезней молодняка затрудняется тем, что организм новорожденного в силу морфофункциональных особенностей в раннем постнатальном периоде слабо приспособлен к неблагоприятным условиям окружающей среды [4].
Создание антимикробных препаратов является революционным в отношении лечения многих инфекционных заболеваний, однако их использование в медицинской и ветеринарной практике привело к появлению устойчивых штаммов и возникновению глобальной проблемы человечества -антибиотикорезистентности [5].
Несмотря на выработку множественной резистентности и негативное влияние антимикробных препаратов на иммунный статус организма, использование антибиотиков остается одним из основных направлений фармакотерапии при массовых желудочно-кишечных заболеваниях с симптомокомплексом диареи [3, 6-8].
Многие ветеринарные специалисты используют средства растительного происхождения, нормализующие функциональные расстройства желудочного-кишечного тракта, однако их влияние на анитибиоткорезистентность микроорганизмов остается неизученным.
Разработка мер по преодолению устойчивости микроорганизмов к антибактериальным препаратам довольно актуальна, поэтому цель нашего исследования: изучить влияние некоторых факторов растительного происхождения на чувствительность Escherichia coli к антимикробным препаратам in vitro.
Условия, материалы и методы. Экспериментальные исследования выполнены в отделе микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГБНУ ДальЗНИВИ. Объект исследований - культуры Escherichia coli выделенные от телят с признаками острых кишечных инфекций.
Чувствительность к антимикробным препаратам изучали диско -диффузионным методом с применением стандартных коммерческих дисков с антибиотиками на среде Мюллера-Хинтона. Ряд антимикробных препаратов включал препараты группы пенициллинов/или их комбинации (ампициллин, амоксициллин/клавуналовая кислота), аминогликозидов (стрептомицин, гентамицин), фторхинолонов (норфлоксацин, ципрофлоксацин, левофлоксацин), тетрациклинов (доксициклин), карбопенемов (имепенем) и цефалоспорины 3 поколения (цефтриаксон, цефиксим, цефтазидим). Всего 12 перпаратов.
В качестве изучаемых факторов выбрали: факторы растительного происхождения (корки граната, черемухи плоды, соплодия ольхи, трава тысячелистника обыкновенного, корень горца змеиного) [9].
Оценку влияния изучаемых факторов на чувствительность к антимикробным препаратам проводили путем соинкубирования взвеси культуры, выращенной на мясопептонном бульоне с изучаемым фактором в условиях шейкер-инкубатора при 37°С - 60 минут. Затем смесь центрифугировали при 3000 оборотах в минуту, после чего культуру двукратно отмывали физиологическим раствором и пересевали на скошенный 3,6 % мясо-пептонный агар. Отсеянные культуры после воздействия фактора инкубировали при температуре 370 С в течение 16-18 ч. с последующим определением у изолятов чувствительности к антимикробным препаратам. Контролем служили значения результатов чувствительности к антибиотикам у этих же штаммов культур полученные без влияния испытуемых факторов [10].
Статистическую обработку результатов исследований проводили, используя возможности программы Microsoft Excel 2010.
Результаты и обсуждения. Бактерии E. coli выделенные от телят с признаками острых кишечных инфекций проявляли чувствительность и резистентность к антимикробным препаратам в разной степени (таблица 1).
В отношении антибиотиков пенициллинового ряда E. coli проявляли практически полную устойчивость, в частности: к ампициллину - в 100% случаев, к амоксициллину в комбинации с клавуналовой кислотой в 80% случаев.
Препараты группы аминогликозидов были эффективнее в отношении E.coli, к ним высокую чувствительность проявляли до 60% культур. Сравнивая среднестатистические показатели видно, что культуры E.coli проявляют высокую чувствительность к гентамицину и промежуточную к стрептомицину.
Разная чувствительность наблюдалась у E.coli к препаратам фторхинолонового ряда. К ципрофлоксацину в среднем были резистентны 60% культур E. coli. К левофлоксацину проявляли чувствительность 40 % культур E.coli, промежуточная чувствительность наблюдалась у 20% и резистентность у 40%. Норфлоксацин полностью подавлял рост у 40% культур, умеренно - у 20% и согласно средним показателям культуры E.coli имели промежуточную чувствительность к препарату.
В отношении доксициклина согласно средним показателям культуры E.coli имели промежуточную чувствительность, а в частности 60% культур были чувствительны, а 40% - резистентны.
Хорошо показал себя имепенем - антимикробный препарат из группы карбопенемов. В 100% случаев культуры E.coli были чувствительны к этому антибиотику. Среднестатистические результаты интерпретируются аналогично.
Цефалоспорины показали себя неоднозначно. К цефиксиму были полностью резистентны более 60% культур E.coli. Среднестатистические данные
показали, что исследуемые культуры проявляют устойчивость к цефиксиму. По отношению к цефтазидиму 20% культур обладали чувствительностью, 40% -промежуточной чувствительностью и 40% - были резистентны. Согласно среднестатистическим показателям культуры E. coli по отношению к цефтазидиму имели промежуточную чувствительность, в отношении цефтриаксона - умеренную чувствительность, По факту около 40% культур были абсолютно резистентны, остальные проявляли либо полную, либо умеренную чувствительность.
В целом, считаем, что для анализа картины чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам можно руководствоваться среднестатистическими данными, для того чтобы впоследствии можно было проследить изменения чувствительности микроорганизмов к этим же препаратам после действия изучаемых факторов.
Представляется следующая картина относительно чувствительности к антимикробным препаратам у E. coli. До воздействия факторов растительного происхождения бактерии были чувствительны к гентамицину, левофлоксацину и имепенему, имели промежуточную чувствительность к стрептомицину, цефтазидиму, доксициклину, норфлоксацину, цефтриаксону и абсолютная резистентность была выявлена к четырем из двенадцати препаратов - к цефиксиму, ципрофлоксацину, амоксициллину в комбинации с клавуналовой кислотой, и ампициллину.
Анализируя данные таблицы 1 после воздействия факторов на культуры E. coli отмечаем, что отвар плодов черемухи усилил антибиотикочувствительность Escherichia к 10 из 12 препаратов.
Таблица 1 - Среднестатистические данные зон подавления роста у E. coli до и после влияния факторов растительного происхождения, мм (M ± m)._
Наименование антимикробного препарата Контроль Фактор
отвар плодов черемухи отвар гранатовых корок настой соплодий ольхи настой травы тысячелистника настой корня горца змеиного
Ампициллин 7,0±0,31 7,0±0,31 7,0±0,31 6,8±0,20 8,0±1,26 7,2±0,20
Амоксициллин / клавуналовая кислота 11,8±2,01 12,6±3,02 12,0±1,81 11,8±1,28 10,2±1,82 11,0±2,09
Стрептомицин 12,8±2,37 п 13,6±2,13 п 17,2±2,55 ч 16,2±1,46 ч 10,2±1,52 11,8±2,39
Гентамицин 15,6±2,54 ч 16,0±1,81 ч 17,8±1,93 ч 19,6±3,53 ч 19,0±0,63 ч 19,2±0,80 ч
Ципрофлоксацин 14,6±3,75 18,2±3,67 п 18,8±2,43 п 20,4±2,48 п 21,8±3,08 ч 20,2±2,70 п
Левофлоксацин 17,8±3,83 ч 17,8±2,47 ч 21,0±2,25 ч 13,8±0,91 20,2±4,40 ч 21,0±2,09 ч
Норфлоксацин 15,0±3,24 п 15,2±2,47 п 20,2±2,95 ч 18,8±1,82 ч 17,4±1,60 ч 18,4±0,60 ч
Доксицикпин 13,8±2,85 п 18,2±2,74 ч 22,2±2,13* ч 7,6±0,60 9,0±1,04 7,0±0,00
Имепенем 24,0±1,14 ч 26,8±0,86 ч 28,2±1,77 ч 27,2±1,24 ч 26,2±1,88 ч 27,2±1,39 ч
Цефтриаксон 15,6±4,09 п 21,4±2,56 ч 22,8±2,41 ч 22,0±1,92 ч 21,0±3,00 ч 22,2±2,47 ч
Цефиксим 13,4±2,66 16,2±3,43 п 19,2±1,96 ч 20,6±1,69 ч 17,0±3,14 п 18,6±3,59 п
Цефтазидим 15,2±2,33 п 17,0±1,87 п 22,2±1,93 ч 21,0±2,42 ч 19,8±1,39 ч 18,8±2,57 ч
Примечание: ч - чувствительные, п - промежуточная чувствительность; * Р <0,05
Значения чувствительности к ампициллину (выраженая резистентность) и левофлоксацину (выраженая чувствительность) остались прежними. Чувствительность к амоксициллину в сочетании с клавуналовой кислотой незначительно повысилась (в 1,06 раза), при этом культуры остались резистентными к препарату.
Разряд чувствительности остался прежний к стрептомицину, норфлоксацину, цефтазидиму. E. coli были умеренно чувствительны к препаратам, их чувствительность повысилась незначительно - в 1,01-1,12 раза.
К гентамицину и имепенему культуры рода Escherichia были изначально чувствительны. В результате влияния на них отвара плодов черемухи чувствительность повысилась соответственно в 1,02 и 1,12 раза.
Нечувствительные к ципрофлоксацину и цефиксиму E.coli перешли в категорию умеренно чувствительных, а культуры, имевшие промежуточную чувствительность к доксициклину и цефтриаксону стали чувствительны к этим препаратам, при этом диаметры зон подавления роста у культур увеличились соответственно в 1,21 -1,24 и 1,32-1,37 раза.
Похожие изменения наблюдали и после действия других факторов.
При воздействии отвара гранатовых корок у культур E. coli чувствительность возросла к 11 препаратам.
К ампициллину чувствительность осталась прежней, к амоксициллину в сочетании с клавуналовой кислотой - возросла незначительно, но итоге культуры были резистентны к этим препаратам.
У нечувствительных к ципрофлоксацину и цефиксиму культур Escherichia чувствительность возросла в 1,28 и 1,43 раза, в результате они перешли в разряд промежуточно-чувствительные и чувствительные.
У культур имевших промежуточную чувствительность к стрептомицину, норфлоксацину, доксициклину (22,2±2,13* Р ^0,05), цефтриаксону и цефтазидиму диаметры зон подавления роста увеличились в 1,34-1,61 раза и они стали чувствительными к действию препаратов. У культур изначально чувствительных к гентамицину, левофлоксацину и имепенему также чувствительность возросла в 1,10 раза.
При воздействии на культуры E. coli настоя соплодий ольхи уменьшились зоны задержки роста в отношении ампициллина, левофлоксацина, и доксициклина. К амоксициллину в сочетании с клавуналовой кислотой чувствительность осталась прежней. К названным препаратам Escherichia проявляли резистентность. К остальным препаратам после воздействия фактора чувствительность повысилась. Максимально к доксициклину в 1,80 раза и минимально к имепенему в 1,13 раза. Культуры, ранее проявлявшие резистентность и промежуточную чувствительность стали чувствительными к действию антимикробных препаратов.
После воздействия настоя травы тысячелистника чувствительность в отношении амоксициллина в сочетании с клавуналовой кислотой, стрептомицина и доксициклина результаты чувствительности были прежние или понизилась. Культуры E. coli проявляли резистентность к этим препаратам.
Действие остальных антимикробных препаратов после действия настоя травы тысячелистника на культуры усиливалось, зоны подавления роста у культур увеличились в 1,13-1,53 раза.
После влияние настоя корня горца змеиного культуры были резистентны к ампициллину, амоксициллину в сочетании с клавуналовой кислотой, стрептомицину и доксициклину. По отношению к другим антимикробным
препаратам чувствительность усилилась в 1,08-1,42 раза. Культуры были чувствительны к гентамицину, левофлоксацину, норфлоксацину, имепенему, цефтриаксону и цефтазидиму, и имели промежуточную чувствительность к цефиксиму и ципрофлоксацину.
Таким образом, результаты исследований показали, что все пять изучаемых факторов растительного происхождения повышали чувствительность культур Escherichia coli к гентамицину, ципрофлоксацину, норфлоксацину, левофлоксацину, имепенему, цевтриаксону, цефиксиму и цефтазидиму, не всегда к стрептомицину, и доксициклину и практически не влияли (или незначительно) на чувствительность к ампициллину и амоксициллину в сочетании с клавуналовой кислотой. Способность изучаемых факторов повышать антибиотикочувствительность подтверждается
среднестатистическими данными зон подавления роста у энтеробактерий рода Escherichia до и после влияния факторов.
Заключение. Полученные результаты открывают перспективу практического применения плодов черемухи, корок граната, соплодий ольхи, травы тысячелистника и корня горца змеиного по преодолению антибиотикорезистентности у Escherichia coli и для проведения дальнейших исследований в данном направлении.
Экспериментальные данные по изучению влияния факторов растительного происхождения на чувствительность к антимикробным препаратам in vitro показывают возможность их применения in vivo для профилактики и лечения острых желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных вызываемых патогенными и условно-патогенными Escherichia coli.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Локтева А. С. Применение бактерий Bacillus spp. F для лечения дисбактериоза у телят // Инновации и продовольственная безопасность. 2022. № 1(35). С. 82-89.
2. Лечение функциональных расстройств желудочно-кишечного тракта телят комплексным препаратом на основе монтмориллонта / Е. В. Рогалева [и др.] // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. 2020. Т. 242, № 2. С.144-148.
3. Этиологическая структура патогенных энтеробактерий новорожденных телят и их резистентность к антимикробным препаратам / Д. А. Желябовская [и др.] // Вестник Дальневосточного отделения Российской академии наук. 2018. № 3(199). С. 129-133.
4. Алиментарно-функциональная диарея телят и ее терапия / Н. Н. Малкова [и др.] // Аграрный вестник Урала. 2019. № 2(181). С. 29-35.
5. Изучение профилей чувствительности бактерий рода Aeromonas (A. hydrophila, A. veronii, A.caviae, A.salmonicida), выделенных из объектов ветеринарно-санитарного надзора / А. А. Ломакин [и др.] // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. 2023. № 3(63). С. 120-126.
6. Тищенко А.С. Специфическая профилактика острых кишечных заболеваний у телят // Ветеринарная патология. 2019. №4 (70). С. 55-61.
7. Чотчаев P.M. Антибиотикорезистентность и методы её преодоления // Тенденции науки и образования. 2021 .№78-3. С. 74-79.
8. Кузьменко А. М. Микробиоценоз кишечника и его коррекция при желудочно-кишечных заболеваниях новорожденных телят: автореф. дис. ... канд. вет. наук. Благовещенск, 2011. 20с.
9. Турова А.Д. Лекарственные растения СССР и их применение. М.: Медицина,1982. - 304 с.
10. Азнабаева Л.М. Лекарственная регуляция антилизоцимной активности стафилококков // Современные проблемы науки и образования. 2013. № 2. С. 46.-52
REFERENCES
1. Lokteva A. S. Primenenie bakteriy Bacillus spp. F dlya lecheniya disbakterioza u telyat // Innovatsii i prodovolstvennaya bezopasnost. 2022. № 1(35). S. 82-89.
2. Lechenie funktsionalnykh rasstroystv zheludochno-kishechnogo trakta telyat kompleksnym preparatom na osnove montmorillonta / Ye. V. Rogaleva [i dr.] // Uchenye zapiski Kazanskoy gosudarstvennoy akademii veterinarnoy meditsiny im. N.E. Baumana. 2020. T. 242, № 2. S. 144148.
3. Etiologicheskaya struktura patogennykh enterobakteriy novorozhdennykh telyat i ikh rezistentnost k antimikrobnym preparatam / D. A. Zhelyabovskaya [i dr.] // Vestnik Dalnevostochnogo otdeleniya Rossiyskoy akademii nauk. 2018. № 3(199). S. 129-133.
4. Alimentarno-funktsionalnaya diareya telyat i ee terapiya / N. N. Malkova [i dr.] // Agrarnyy vestnik Urala. 2019. № 2(181). S. 29-35.
5. Izuchenie profiley chuvstvitelnosti bakteriy roda Aeromonas (A. hydrophila, A. veronii, A.caviae, A.salmonicida), vydelennykh iz obektov veterinarno-sanitarnogo nadzora / A. A. Lomakin [i dr.] // Vestnik Ulyanovskoy gosudarstvennoy selskokhozyaystvennoy akademii. 2023. № 3(63). S. 120126.
6. Tishchenko A.S. Spetsificheskaya profilaktika ostrykh kishechnykh zabolevaniy u telyat // Veterinarnaya patologiya. 2019. №4 (70). S. 55-61.
7. Chotchaev R.M. Antibiotikorezistentnost i metody ee preodoleniya // Tendentsii nauki i obrazovaniya. 2021.№78-3. S. 74-79.
8. Kuzmenko A. M. Mikrobiotsenoz kishechnika i ego korrektsiya pri zheludochno-kishechnykh zabolevaniyakh novorozhdennykh telyat: avtoref. dis. ... kand. vet. nauk. Blagoveshchensk, 2011. 20 s.
9. Turova A.D. Lekarstvennye rasteniya SSSR i ikh primenenie. M.: Meditsina,1982.- 304 s.
10. Aznabaeva L.M. Lekarstvennaya regulyatsiya antilizotsimnoy aktivnosti stafilokokkov // Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya. 2013. № 2. S. 46.-52
