CC BY
29
Персистенция бактерий и вирусов в организме Ixodes
В. М. ПОДБОРОНОВ', И. П. СМИРНОВА2
1 НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи Минздрава России, Москва
2 Российский университет дружбы народов, Москва
Persistence of Bacteria and Viruses in Ixodes
V. M. PODBORONOV, I. P. SMIRNOVA
N. F. Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow Rissian Peoples' Friendship University, Moscow
Проведено углублённое изучение поведения вирусов и сальмонелл в клещах при раздельном и комбинированном заражении их на лабораторных животных с бактериемией или вирусемией. При одновременном заражении клещей Ixodes ricinus вирусом клещевого энцефалита и сальмонеллами отмечено снижение титра вируса к 30—40 суткам, а через 60 дней наблюдается полная его гибель. При заражении нимф I.ricinus количество вируса при смешанном заражении через 60 дней наблюдения было на два порядка ниже, чем при заражении одним вирусом, и не достигало заражающей дозы. При смешанном инфицировании клещей одновременно двумя возбудителями инфекций (вирусом клещевого энцефалита и сальмонеллами) происходит угнетение роста и развития как вируса клещевого энцефалита, так и сальмонелл.
Ключевые слова: персистенция, клещи, бактерии, вирусы, выживаемость.
Behaviour ofviruses and salmonellas in ticks after their single or combined contamination was thoroughly studied on laboratory animals with bacteriemia or virusemia. When Ixodes ricinus was contaminated simultaneously with forest-spring encephalitis virus and salmonellas there were observed a decrease in the virus titer by the 30th—40th days and its death in 60 days. In case of the I.ricinus nymphs contamination, the virus titer after the combined contamination was by a factor of 102 lower in 60 days vs. the contamination with the virus alone and did not reach the contamination dose. The simultaneous contamination of the ticks with two pathogens (forest-spring encephalitis virus and salmonellas) resulted in inhibition of the growth and development of both the virus and the salmonellas.
Key words: persistence, ticks, bacteria, viruses, survival.
В настоящее время основное внимание исследователей уделяется изучению смешанных инфекций в организме клещей в природных условиях. Этот вопрос исследовался в экспериментах с вирусной и бактериальной инфекциями, проведён широкий литературный обзор клещевых микстинфекций [1—5].
Однако экспериментальных работ по микст-инфекциям клещевого энцефалита (КЭ) и саль-монеллёза крайне мало [6, 7], и в связи с этим целью настоящего изучение стало проведение экспериментальных исследований по выяснению характера поведения вирусов и сальмонелл в клещах при раздельном и комбинированном заражении их на лабораторных животных с бактериемией или вирусемией.
Материал и методы
Экспериментальной моделью служили клещи Ixodes ricinus (Linnaeus, 1758) — специфические переносчики кле-
© В. М. Подборонов, И. П. Смирнова, 2014
Адрес для корреспонденции: 123098, г.Москва, ул. Гамалеи, дом 18. НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи
щевого энцефалита. Исследования проводили на клещах лабораторной линии, свободной от патогенной флоры. Для инфицирования использовали вирус КЭ штамм «Софьин» и бактериальную культуру Salmonella typhimurium LT-2; заражение смешанной инфекцией белых мышей производили внутрибрюшинно. Для заражения клещей использовали титрованную 10% суспензию мозга больных мышей и бактериальную культуру сальмонеллы. Клещей кормили на заражённых мышах. На заражённость вирусом и бактериями проверяли только полностью напитавшихся клещей. Исследование проводили в сроки, указанные в табл. 1 и 2. По-вторность опытов 2—3-кратная. Определение вируса в клещах проводили путём титрования на белых мышах. Для титрования брали 2 половозрелых клеща и 3 нимфы. Обработанных физраствором и 96% спиртом клещей растирали в фарфоровой ступке, добавляли 1 мл физиологического раствора, который содержал 1000 единиц канамицина для освобождения суспензии от сальмонелл. Делали посев суспензии на мясо-пептонный бульон для проверки наличия сальмонелл. Затем суспензию центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин, делали разведения c 10-1 до 10-10. Затем каждым разведением заражали мышей (по 5 мышей) интрацеребральным введением.
На заражённость сальмонеллами клещей проверяли по той же схеме и 10-кратные разведения суспензии высевали по 0,1 мл на агаровые пластинки. Посевы инкубировали в термостате 2—5 суток при температуре 37°С, затем учитывали количество выросших колоний.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Таблица 1. Изменение титра вируса клещевого энцефалита (в ^ LD50/0,03 мл) при заражении иксодовых клещей вирусом клещевого энцефалита и сальмонеллами
Вид клещей Стадия Период между заражением и исследованием клещей (метод титрования)
развития 0 ч 12ч 24ч 48 ч 72 ч 6 сут 12 сут 18 сут 24 сут 30 сут 40 сут 60 сут
Имаго I.ricinus опыт 6,4 4,2 4,1 4,9 5,0 5,9 4,8 4,0 4,1 3,9 3,5 Не обнаружено
контроль 7,8 6,1 5,3 5,5 7,4 7,9 8,1 6,2 5,9 5,2 5,0 4,7
Нимфы I.ricinus опыт 7,6 7,2 7,1 5,4 5,2 5,0 5,0 4,4 4,2 4,0 3,7 3,4
контроль 7,8 7,4 7,6 7,2 7,1 6,5 6,2 6,1 6,0 5,8 5,4 4,9
Примечание. Контроль - заражение только вирусом клещевого энцефалита.
Таблица 2. Изменение числа жизнеспособных бактерий S.typhimurium (10Х107 микробных клеток на 1 особь) при заражении иксодовых клещей вирусом клещевого энцефалита и сальмонеллами
Вид клещей Стадия _Период между заражением и исследованием клещей (метод высева)
развития 0 ч 12 ч 24 ч 48 ч 72 ч 6 сут 12 сут 18 сут 24 сут 30 сут 60 сут
Имаго I.ricinus Опыт 1,0х108 1,3х108 50 17 6 2 Роста Роста Роста Роста Роста
нет нет нет нет нет
Контроль 1,0х108 1,0х106 6,4х105 2,3х105 8,5х103 1,1х104 9,0х102 5,3х102 4,3х102 120 58
Нимфы I.ricinus Опыт 1,0х108 2,5х106 2,0х104 1,3х102 88 40 4 Роста Роста Роста Роста
нет нет нет нет
Контроль 1,0х108 1,0х107 6,5х105 2,4х105 1,8х105 1,2х105 3,1х104 2,8х104 8,5х103 4,9х103 2,0х103
Примечание. Контроль - заражение только вирусом клещевого энцефалита.
Результаты и обсуждение
Сериями опытов установлено, что половозрелые клещи 1.гтпт могут быть резервуаром для вируса КЭ, сохраняя его в течение всего срока наблюдения (60 дней). Инфицированные клещи способны сохранять вирулентный штамм Б^рЫтыгшт ЬТ-2. Как видно из табл. 1, количество вируса и сальмонелл уменьшалось по мере увеличения срока пребывания в их организме.
При заражении нимф 1.папт вирус в их организме сохранялся в течение всего срока наблюдения как при заражении только вирусом, так и при заражении смешанной инфекцией.
Через 60 суток наблюдения титр вируса при смешанном заражении (вирусом КЭ и сальмонеллами) был на порядок ниже, чем в контроле и составлял ^ ЬБ 50/0,03 мл — 3,4, а в контроле ^ ЬБ 50/0,03 мл — 4,9.
Динамика выживания бактерий при заражении нимф 1.пстт сальмонеллами и вирусом КЭ изменялась и в течение 12 суток соотношение уровней их численности резко снижалось. Число бактерий через 6 суток составляло 2 колонии, через 12, 18, 24, 30 и 60 суток сальмонеллы при посеве не выявлялись. В контроле нимф, заражённых только сальмонеллами, бактерии высевались с ростом колоний в течение 60 суток, однако число их снижалось с 1,0х108 КОЕ/ мл до 2,0х103 КОЕ/мл к 60 суткам (табл. 2).
Таким образом, в организме клещей 1.пстт угнетение роста возбудителей болезней при смешанном заражении происходит быстрее, чем в контроле. Результаты экспериментов подтверждают сделанный ранее вывод, что гибель вирусов и бактерий в клещах зависит не только от свойств
штаммов возбудителей и их антагонистических взаимоотношений, но и от защитных механизмов клещей [8—11].
Большой интерес представляют работы по микстинфекциям (клещевой энцефалит и Borrelia afzelii) по взаимодействию внеклеточных и внутриклеточных патогенов в организме клещей I.ricinus. Авторы делают выводы, что аномальное потомство аномальных (измененных под воздействием экологических изменений) и нормальных самок клещей чаще является более чувствительным к заражению КЭ и в связи с этим более эпидемически опасным. При совместном попадании в организм клеща вируса КЭ и бактерии возможно антагонистическое взаимодействие между возбудителями [1, 5].
Н. П. Мишаева и др. установили, что вирус КЭ стимулирует активность клещей, а боррелии, наоборот, снижают. Боррелии вызывающие менее тяжёлую бактериальную инфекцию, конкурируя с вирусом КЭ, частично подавляют и ограничивают как распространение, так и тяжесть вирусной болезни. Авторы считают это явление первым в истории науки фактором обнаружения подавления вируса бактерией в одном и том же организме — в клеще переносчике [5].
Заключение
При одновременном заражении клещей I.ricinus вирусом клещевого энцефалита и сальмонеллами отмечено снижение титра вируса к 30—40 суткам, а через 60 дней наблюдается полная его гибель. В контроле, где клещи заражены только одним вирусом клещевого энцефалита, вирус выделялся в течение всего наблюдаемого
срока (60 дней). Отмечена аналогичная картина в изменении количества вируса в организме клещей, которое, однако, было несколько выше, чем при инфицировании двойной инфекцией и несколько ниже по сравнению с исходной заражающей дозой.
При заражении нимф I.ricinus вирус в их организме сохранялся в течение всего наблюдаемого срока как при заражении нимф смешанной инфекцией, так и при заражении одним вирусом клещевого энцефалита. Однако количество вируса при смешанном заражении через 60 дней наблюдения было на два порядка ниже, чем при заражении одним вирусом, и не достигало заражающей дозы.
Сальмонеллы при смешанном заражении сохранялись в организме половозрелых клещей I.ricinus до 12 суток. В контроле при заражении
ЛИТЕРАТУРА
1. Алексеев А.Н., Дубинина Е.В., Мишаева Н.П., Головлёва И В. О взаимодействии клещевых патогенов в организме беспозвоночного хозяина, клеща Ixodes ricinus (Ixodidae). Естеств техн науки 2011; 3: 136—139.
2. Коренберг ^.^Взаимоотношения возбудителей трансмиссивных болезней в микстинфицированных иксодовых клещах (Ixodidae). Паразитология 1999; 4: 272—289.
3. Коренберг Э.И. Изучение и профилактика микст-инфекций, передающихся иксодовыми клещами. Вест акад мед наук М.: 2001; 11: 41—45
4. Коренберг Э.И. Микст-инфекции передающиеся иксодовыми клещами: современное состояние проблемы. Успех совр биол 2003; 5: 123: 475—486.
5. Мишаева НИ, Стегний В.А., Алексеев А.Н., Дубинина Е.В. Антагонистическое взаимодействие возбудителей клещевых инфекций в организме беспозвоночного хозяина. Сахаровские чтения 2011 года: экологические проблемы XXI века. Матер. 11-й международ. Научн.конф. 19—20 мая 2011 г. Минск,Республика Беларусь. Минск: МГЭУ им. А. Д. Сахарова, 2011; 126.
одной бактериальной культурой, сальмонеллы сохранялись в течении всего наблюдаемого срока, и их число составляло несколько десятков (58 КОЕ/мл). Аналогичные данные получены при заражении нимф I.ricinus. Сальмонеллы погибали при заражении смешанной культурой через 18 суток, в то время как в контроле они оставались жизнеспособными.
При смешанном инфицировании клещей одновременно двумя возбудителями инфекций (вирусом клещевого энцефалита и сальмонеллами) происходит угнетение роста и развития как вируса клещевого энцефалита, так и сальмонелл.
Исходя из вышесказанного, представляется целесообразным продолжение дальнейших исследований в этом направлении, так как полученные результаты могут представлять интерес для целей практической медицины.
6. Подборонов В.М., Бондаренко В.М., Хмель И.А., Манохина И.М. Вытеснение вирулентных бактерий Salmonella typhimurium микро-цинпродуцирующим штаммом Escherichia coli при их совмещении в гемоцеле членистоногих. ЖМЭИ 1994; 6: 4—5.
7. Подборонов В.М., Бондаренко В.М., Гришин В.П. Взаимовлияние бактерий кишечной палочки и сальмонелл при смешанном заражении клещей. Мед паразитол паразитарн бол 2000; 3: 32—35.
8. Подборонов В.М. Возбудители болезней человека, животных и клещи. М. изд-во «Медицина». 2004; 224.
9. Подборонов В.М., Щелканов М.Ю., Смирнова И.П., Буренкова Л.А., Новикова В.П., Аристова В.А., Новикова Е.Л., Москвитина Г.Г., Иоффе А.М. Бактерицидное действие лизоцима. Антибиотики и химиотер 2013; 58, 3—4: 22—24.
10. Alekseev A.H., Burenkova L.A., Podboronov V.M., Chunikhin S.P. Bactericidal quality of ixodiod ticks (acariña, Ixodidal) salivary cement plugs, a viral tick-borne pathogen. J Med Entomol 1995; 5: 32: 578—582.
11. Podboronov V.M. Antibacterial Protective Mechanisms of Ixodiod Ticks. Modern Acarology, Academia, Prague and SPB Publishing bv. The Hague. 1991; 2: 375—380.
