CC BY
65
Parasitol., 2004, vol. 71, no. 2, pp. 111-117.
14. Wicht B., Scholz T., Kuchta R. First record of human infection with the tapeworm Diphylloboth-rium nihonkaiense in North America. Am. J. Trop. Med. Hyg, 2008, vol. 78, no. 2, pp. 235-238.
15. Wicht B.,Yanagida T., Scholz T., Ito A., Jiménez J., Brabec J. Multiplex PCR for Differential Identification of Broad Tapeworms (Cestoda: Diphyl-
lobothrium) Infecting Humans. J. Clin. Microbiol., 2010, vol. 48, no. 9, pp. 3111-3116.
16. Yera, H., Nicoulaud J., Dupouy-Camet J. Use of nuclear and mitochondrial DNA PCR and sequencing for molecular identification of Diphyllo-bothrium isolates potentially infective for humans. Parasite, 2008, vol. 15, no. 3, pp. 402-407.
Статья поступила в редакцию 01.02.2016 г.
УДК 581.1:58.07.071
ПЕРОКСИДАЗА В РЕГУЛЯЦИИ ФИТОМИКРОБНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ
Л Л о
© Г.П. Акимова1, М.Г. Соколова1, В.В. Верхотуров2
1 Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН,
664033, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, п/я 317, SokolovaMG@sifibr.irk.ru
2 Иркутский национальный исследовательский технический университет, 664074, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 83
В работе описано исследование изменения активности пероксидазы (ПО) растений при взаимодействии с бактериями разных родов семейства Rhizobiaceae: Rhizobium leguminosarum - симбионт гороха, вызывающий образование корневых клубеньков и Agrobacterium rhizogеnes - фитопатоген, вызывающий синдром «волосатого корня». Активность ПО в ответ на инокуляцию Rh. leguminosarum практически не отличалась от контроля, тогда как в корнях инокулированных A. rhizogines активность ПО имела ярко выраженную тенденцию к возрастанию. Сделан вывод, что направленность изменения активности фермента в проростках гороха при взаимодействии с Rh. leguminosarum способствует проникновению ризобий, а в случае с патогеном A. rhizogines служит показателем стрессового состояния растений.
Ключевые слова: активности пероксидазы; растительно-микробные взаимодействия; Rhizobium leguminosarum; Agrobacterium rhizogеnes; горох Pisum sativum L.
PEROXIDASES IN REGULATION OF PHYTO-MICROBE INTERACTIONS
G.P. Akimova1, M.G. Sokolova1, V.V. Verkhoturov2
Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS, p/b 317, 132, Lermontov St., Irkutsk, 664033, Russia, SokolovaMG@sifibr.irk.ru 2 Irkutsk National Research Technical University, 83, Lermontov St., Irkutsk, 664074, Russia,
The research was aimed to study changes in peroxidase (PO) activity in the course of interaction with bacteria of various genera of Rhizobiaceae family: Rhizobium leguminosarum - pea symbiont causing formation of root nodules and Agrobacterium rhizogеnes - phytopathogen causing the syndrome of "hairy root". Peroxidase activity in response to inoculation with Rh. leguminosarum virtually did not differ from control, whereas in the roots inoculated with A. rhizogines рeroxidase activity had a well-pronounced tendency to increase. It is concluded that the direction of enzyme activity change in pea seedlings interacting with Rh. legumi-nosarum promotes rhizobia penetration, and in the case with A. rhizogines pathogen it acts as an indicator of plant stress status.
Keywords: peroxidase activities; plant-microbe interactions; Rhizobium leguminosarum; Agrobacterium rhi-zogеnes; pea Pisum sativum L.
ВВЕДЕНИЕ
Одним из важнейших аспектов проблемы развития бобово-ризобиального симбиоза является регуляция макросимбионтом начальных этапов взаимодействия: узнавания, проникновения ризобий в ткани корня и образования растительно-микробных структур - клубеньков. Важную роль в регуляции этих процессов могут играть защитные реакции, сходные с начальными этапами взаимодействия растений с патогенными микроорганизмами. Как известно, физиологический ответ у растений на различные патогены включает целый ряд разнообразных защитных реакций на опасность заражения. В частности, интенсифицируются окислительные процессы, сопровождающиеся усилением активности окислительных ферментов, в том числе ПО [3, 4, 9]. Сигнальные и защитные функции ПО при патогенезе достаточно хорошо изучены. Однако вопросы о роли ПО в формировании бобово-ризобиального симбиоза, а так же ее роли как важнейшего регулятора метаболизма, остаются практически неисследованными [10, 11]. Пероксидаза - стрессовый фермент, способный участвовать в регуляции про- и антиокси-дантного баланса в клетке. Фермент одним из первых реагирует на любые внешние воздействия, поэтому является маркером физиологического состояния растения при взаимодействии со средой. Повышение активности пе-роксидазы - часть защитного механизма, присущая всем растениям [2, 7, 8].
Цель настоящего исследования заключалась в определении активности ПО в проростках гороха в самый ранний период узнавания симбиотических (Rhizobium leguminosarum) и патогенных (Agrobacterium rhizogines) представителей семейства Rhizobiaceae.
Исследовали ответные реакции при сим-биотических и патогенных растительно-микробных взаимодействиях растений гороха с бактериями разных родов семейства Rhizobia-ceae, резко отличающихся между собой: Rhi-zobium leguminosarum - симбионт гороха, вызывающий образование корневых клубеньков и осуществляющий в них азотфиксацию и Agro-bacterium rhizogenes - фитопатоген, вызывающий синдром «волосатого корня» [5]. Поставили задачу выявить отличие в активности ПО, как компонента сигнальной регуляции в процессах узнавания и прикрепления бактерий при колонизации корня при двух контрастных видах взаимодействия: симбиозе и патогенезе.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Объектом исследования были проростки гороха (Pisum sativum L.) (2 сут/ 22 оС) сорта
Аксайский усатый. Для исследования использовали растущий участок корня, восприимчивый к инфекции (0-20 мм). В качестве симбионта использовали совместимый производственный штамм клубеньковых бактерий Rhi-zobium leguminosarum bv. vicea L. (CIAM 1026). В качестве патогена выбрали дикий штамм Ag-robacterium rhizogenes. Проростки гороха ино-кулировали путем орошения растений в кюветах водным смывом культуры бактерий. Контролем для инокулированных растений были одновозрастные неинокулированные проростки. Наблюдали изменение активности ПО в динамике в течение 1 ч (через 15, 30 и 60 мин после инфицирования) в трех фракциях: растворимой (цитоплазматической), ионно-связан-ной и ковалентно-связанной с клеточной стенкой ПО. Для выделения растворимой (цито-плазматической) фракции ПО корни проростков гороха гомонизировали в 0,01 М №-фос-фатном буфере рН 6,2 (ФБ) (1 : 3) и экстрагировали фермент при 4 оС. Экстракт центрифугировали 15 мин при 14 000 об/мин. Для выделения ионно-связанной фракции ПО клеточные стенки после 10-кратного отмывания ФБ, содержащим 1% Тритон Х-100 («Ю№), подвергали обработке 2М NaCl, центрифугировали и использовали для определения активности. Ковалентно-связанные с клеточной стенкой ПО выделяли после отмывки от ионно-связанной фракции ФБ с применением 0,25% целлюлазы и 0,25% пектиназы [4,9]. Активность пероксида-зы определяли по начальной скорости окисления о-дианизидина (х = 460 нм) перекисью водорода в №-фосфатном буфере, рН 6,2 [6]. Опыты проведены в трех биологических по-вторностях, данные обрабатывали с использованием прикладных статистических программ. На рисунках (а-в) приведены средние арифметические величины и их стандартные ошибки.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В результате исследований показано, что активность растворимой ПО в течение 60 мин после инокуляции Rh. leguminosarum не отличалась от активности ПО контрольных растений (рис., а). В ионно- и ковалентно-связанной с клеточной стенкой фракциях происходило незначительное повышение активности фермента через 15 и 60 мин после инокуляции. При этом во фракции, ковалентно-связанной с клеточной стенкой, возрастание было более значительным. В корнях растений гороха, ино-кулированных A. rhizogines, активность фермента через 15 мин после воздействия возрастала во всех фракциях (рис., а-в). Следует отметить, что во фракции растворимой и кова-лентно-связанной с клеточной стенкой резкое
к ц
о о. н
X
о
¡с н о
350 300 250 200 150 100 50 0
- ,__
Е-1
15
30
45
60
• Контроль Rh.lg. Agr.rhiz.
Время, мин
250
к ц
о
.
н
X
о
а н о
200
150
100
/
i-
• Контроль Rh.lg. Agr.rhiz.
50
15
30
45
б
60
Время, мин
К Ц
о
.
н
X
о
¡с н о
400 350 300 250 200 150 100 50 0
15
30
45
60
Контроль
Rh.lg.
Agr.rhiz.
Время, мин
Изменение активности пероксидазы (ПО) при инфицировании Rh. leguminosarum и A. rhizogеnes: а - растворимая фракция ПО; б - ионсвязанная с клеточными стенками ПО; в - ковалентносвязанная с клеточными стенками ПО
а
0
в
увеличение активности ПО (в 2 раза) наблюдалось в течение всего периода измерения. И только активность ионно-связанной пероксида-зы через 45 мин после воздействия снижалась.
Ранее было показано, что активность растворимой ПО в восприимчивых к инфекции участках корней гороха снижалась через 24 ч после инокуляции Rh. leguminosarum, но возрастала в невосприимчивом участке корня. Снижение активности ПО способствует проникновению ризобий в корень, ее повышение в невосприимчивом участке, вероятно, играет защитную роль, направленную на предотвращение системного распространения бактерий по всему корню [1]. Анализ влияния инокуляции Rh. leguminosarum и A. rhizogеnes выявил следующую закономерность. Активность ПО в ответ на инокуляцию Rh. leguminosarum практически не отличалась от контрольных растений, кроме фермента, связанного с клеточной стенкой. Последнее, вероятно, обусловлено ее участием как сигнальной молекулы в преинфекци-онных ответах растения-хозяина на воздействие микросимбионта, а именно: перестройка цитоскелета, набухание и скручивание корневых волосков, формирование преинфекцион-ных нитей. Таким образом, направленность из-
менения активности фермента в корнях проростков гороха при взаимодействии с Rh. ^^ minosarum способствует проникновению ризо-бий в восприимчивом к инфекции участке корня и подчеркивает участие ПО в механизмах авторегуляции нодуляции. В то же время резкое увеличение активности ПО в отрезках корней инокулированных A. rhizogеnes имело ярко выраженную тенденцию к возрастанию, особенно в растворимой и связанной с клеточной стенкой фракциях фермента. Такая реакция пероксида-зы характерна при взаимодействии растений с патогеном и служит показателем стрессового состояния растений на биотический фактор [2, 8].
Таким образом, подобная регуляция интенсивности окислительных процессов в ответ на инфекцию, вероятно, является одним из механизмов узнавания микроорганизмов. При этом более высокая их интенсивность свидетельствует о включении защитных механизмов, как в случае с фитопатогенном A. rhizogе-nes. Однако механизмы симбиотического взаимодействия, очевидно, являются более сложными, связанными не только с защитой, но и более тонкими механизмами саморегуляции процессов развития симбиоза.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
1. Акимова Г.П., Соколова М.Г., Нечаева Л.В., Лузова Г.Б., Сидорова К.К. Роль перокси-дазы во взаимодействиях растений гороха с Rhi-zobium // Агрохимия. 2002. № 12. С. 37-41.
2. Газарян И.Г., Хушпульян Д.М., Тишков В.И. Особенности структуры и механизма действия пероксидаз растений // Успехи совр. биол. 2006. Т. 46. С.303-322.
3. Максимов И.В., Черепанова Е. А., Бурха-нова Г.Ф., А.В. Сорокань А.В., Кузьмина О.И. Структурно-функциональные особенности изо-пероксидаз растений // Биохимия. 2011. Т. 76, № 3. Вып. 6. С. 609-621.
4. Максимов И.В., Черепанова Е. А., Сурина О.Б., Сахабутдинова А.Р. Влияние салициловой кислоты на активность пероксидазы в совместных культурах каллусов пшеницы с возбудителем твердой головни Tilletia caries//Прикл. биохимия и микробиология. 2004. Т. 51, № 4. С. 480-485.
5. Rhizobiaceae. Молекулярная биология бактерий, взаимодействующих с растениями (Ред. Спайнк Г., Кондороши А., Хукас П.; Русский перевод под ред. Тихоновича И.А., Проворова Н.А.), С-Пб. 2002. 567 с.
6. Рогожин В.В., Верхотуров В.В., Курилюк
Т.Т. Антиоксидантная система в прорастании семян пшеницы // Известия АН. Серия биологич.-2001. № 2. С. 165-173.
7. Рогожин В.В., Перетолчин Д.В., Рогожина Т.В. Аскорбиновая кислота - оксидазный субстрат пероксидазы // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2013. № 1. С. 81-87.
8. Савич И.М. Пероксидазы - стрессовые белки растений // Успехи совр. биол. 1989. Т. 107, № 3. С. 406-417.
9. Юсупова З.Р., Хайруллин Р.М., Максимов И.В. Активность пероксидазы в различных клеточных фракциях при инфицировании пшеницы Septoria nodorum Berk. // Физиология растений, 2006. Т. 53, № 6. С. 910-917.
10. Cook D., Dreyer D., Bonnet D., Howell M., Nony E., VandenBosch K. Transient induction of a peroxidase gene in Medicago truncatula precedes infection dy Rhizobium meliloti. // Plant Cell. 1995. V. 7 (1). P. 43-55.
11. Herder J.D., Lievens S., Rombauts S., Holsters M., Goormachtig S. A symbiotic plant pe-roxidase involved in bacterial invasion of the tropical legume Sesbania rostrata // Plant Physiology. 2007. 144: 717-727.
REFERENCES
1. Akimova G.P., Sokolova M.G., Nechaeva vo vzaimodeistviyakh rastenii gorokha s Rhizobium
L.V., Luzova G.B., Sidorova K.K. Rol' peroksidazy [Peroxidase role in pea plants interactions with Rhi-
zobium]. Agrokhimiya - Agricultural Chemistry, 2002, no. 12, pp. 37-41.
2. Gazaryan I.G., Khushpul'yan D.M., Tishkov V.I. Osobennosti struktury i mekhanizma deistviya peroksidaz rastenii [Peculiarities of structure and mode of action of plant peroxidases]. Uspekhi sov-remennoi biologii - Biology Bulletin Reviews, 2006, vol. 46, pp. 303-322.
3. Maksimov I.V., Cherepanova E.A., Bur-khanova G.F., Sorokan' A.V., Kuz'mina O.I. Struk-turno-funktsional'nye osobennosti izoperoksidaz rastenii [Structural-functional features of plant isop-eroxidases]. Biokhimiya - Biochemistry, 2011, vol. 76, no. 3, issue 6, pp. 609-621.
4. Maksimov I.V., Cherepanova E.A., Surina O.B., Sakhabutdinova A.R. Vliyanie salitsilovoi kisloty na aktivnost' peroksidazy v sovmestnykh kul'turakh kallusov pshenitsy s vozbuditelem tverdoi golovni Tilletia caries [The effect of salicylic acid on peroxidase activity in wheat cally cocultured with the bunt pathogen Tilletia caries]. Prikladnaya biokhimi-ya i mikrobiologiya - Applied Biochemistry and Microbiology, 2004, vol. 51, no. 4, pp. 480-485.
5. Rhizobiaceae. Molekulyarnaya biologiya bakterii, vzaimodeistvuyushchikh s rasteniyami [Molecular biology of bacteria interacting with plants]. Under the editorship of Spaink G., Kondoroshi A., Khukas P. (Rus. ed. under the editorship of Tikhonovich I.A., Provorov N.A.). S-Petersburg, 2002, 567 p.
6. Rogozhin V.V., Verkhoturov V.V., Kurilyuk T.T. Antioksidantnaya sistema v prorastanii semyan
pshenitsy [Antioxidant system in wheat seedling sprouting]. Izvestiya AN. Seriya biologich. - Proc. of AS USSR, Ser. Biol., 2001, no. 2, pp. 165-173.
7. Rogozhin V.V., Peretolchin D.V., Rogozhina T.V. Askorbinovaya kislota - oksidaznyi substrat peroksidazy [Ascorbic acid in the oxidase substrate of horseradish peroxidase]. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya Khimiya i Biotekhnologiya -Proceedings of Higher School. Applied Chemistry and Biotechnology, 2013, no. 1, pp. 81-87.
8. Savich I.M. Peroksidazy - stressovye belki rastenii [Peroxidase - stressful plant proteins]. Uspekhi sovremennoi biologii - Biology Bulletin Reviews, 1989, vol. 107, no. 3, pp. 406-417.
9. Yusupova Z.R., Khairullin R.M., Maksimov I.V. Aktivnost' peroksidazy v razlichnykh kletochnykh fraktsiyakh pri infitsirovanii pshenitsy Septoria no-dorum Berk [The activity of peroxidase in various cell fractions of wheat plants infected with Septoria no-dorum Berk]. Fiziologiya rastenii - Russian Journal of Plant Physiology, 2006, vol. 53, no. 6, pp. 910917.
10. Cook D., Dreyer D., Bonnet D., Howell M., Nony E., VandenBosch K. Transient induction of a peroxidase gene in Medicago truncatula precedes infection by Rhizobium meliloti. Plant Cell. 1995, vol. 7 (1), pp. 43-55.
11. Herder J.D., Lievens S., Rombauts S., Holsters M., Goormachtig S. A symbiotic plant pe-roxidase involved in bacterial invasion of the tropical legume Sesbania rostrate. Plant Physiology, 2007, vol. 144, pp. 717-727.
Статья поступила в редакцию 19.02.2016 г.
