Переваривание целлюлозы дождевыми червями под воздействием Trichoderma viride Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

©

тН

О

(N

УДК 582.28 + 595.142.34 Д.И. Стом

ББК 40.402 В.А. Быбин

A.А. Приставка

B.П. Саловарова Б.Н. Огарков

ПЕРЕВАРИВАНИЕ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ ДОЖДЕВЫМИ ЧЕРВЯМИ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ TRICHODERMA VIRIDE*

Рассмотрена возможность обогащения кишечного тракта дождевых червей целлюлозоразрушающим штаммом микромицета — Trichoder-та viri.de, а также взаимовлияние используемых организмов.

Ключевые слова: дождевые черви, целлюлоза, микроорганизмы, грибы.

D.I. Stom V.A. Byibin A.A. Pristavka V.P. Salovarova

B.N. Ogarkov

DIGESTION OF CELLULOSE BY EARTHWORMS UNDER TRICHODERMA VIRIDE

ssi

2sl Es =

“Is1

нД

НА

Ой"

^ 1

І

^ П £

h нї 8 Р І

8s! "5 о

ЕнО а

£м§|

ИО І See « н

н

о

н

PQ

со

Н

The article analyses the opportunity of enrichment of earthworms’ intestines by cellulose-degrading fungi strain Trichoderma viride and interdependence of the organisms.

Keywords: earthworms, cellulose, microorganisms, fungi.

Введение. Сегодня в Байкальском регионе остро стоит проблема переработки твердых отходов. Особенно велика доля отходов, содержащих целлюлозу. Ранее была показано усиление интенсивности трансформации загрязнителей в системе микроорганизмы-дождевые черви по сравнению с действием этих организмов по отдельности [3; 6]. Поэтому можно было ожидать усиления способности дождевых червей утилизировать отходы, в частности целлюлозно-бумажной природы, при введении в микрофлору их кишечников штаммов микроорганизмов активных биодеструкторов. В этой связи изучали возможность обогащения кишечного тракта дождевых червей целлюлозоразрушающим штаммом микромицета — Trichoderma viride, а также взаимовлияние используемых организмов.

Объекты и методы исследования. Объектом исследования служили особи красного калифорнийского гибрида. В лаборатории червей разводили в лотках с почвой при температуре 20-25 °С и влажности 80-85%. Животных кормили размоченной гречневой крупой. В опытах использовали половозрелых, имеющих поясковую зону червей длиной 8-10 см.

Штамм T. viride получен из коллекции доктора биологических наук Б.Н. Огаркова. Он обладает высокой целлюлолитической активнос-

* Работа выполнена частично при поддержке грантов: Роснауки ФЦП (ГК № 02.740.11.0018 от 15.06.2009 г. и ГК № 02.740.11.0335 от 07.07.2009 г.), а также РФФИ (08-04-98057-Сибирь_а).

© Д.И. Стом, ВА. Быбин, АА. Приставка,

В.П. Саловарова, Б.Н. Огарков, 2010 2 90

О

тН

О

(N

SS1

2нё ЯЧ г

MhSI

HS5

н51

Ен^ І

ой-

°i<s ^ 1

5s І

^ Л £ g§!

h gl S ff I

8s!

M gl о

ChO!

£s§||

E40 Ї ЙИ-І See « H

H

о

H

PQ

CO

H

тью [1]. Для изучения сохранения T. viride в кишечниках дождевых червей суспензию гриба микроинъекциировали животным через ротовое отверстие с помощью инсулинового шприца со спиленным острием иглы. На 1-е, 4-е, 8-е сутки дождевых червей вскрывали в асептических условиях с высевом содержимого отделов кишечника на среду Чапека. Для получения отделов кишечника внешние покровы червей предварительно стерилизовали промыванием в стерильной воде, 30-и секундной экспозицией в 70% спиртовом растворе. Потом олигохет разрезали глазными ножницами вдоль тела, рассекая кожно-мускульный мешок. Вынимали отделы кишечника, перетирали их в ступке и суспензировали в физиологическом растворе. Посевы инкубировали при температуре 30 °С в течение недели. Затем производили подсчет выросших колоний [2]. Также оценивали воздействие инокуляции дождевых червей культурой грибов на иммунные свойства и выживаемость животных, влияние дождевых червей на прорастание спор T. viride. Изменение иммунных свойств фиксировали с помощью диско-диффузионного метода по диаметру зоны подавления роста газона тест-культуры (Yarrowia lipolytica) вокруг бумажного диска, пропитанного целомической жидкостью дождевых червей. Целомическую жидкость получали из целомической полости при рассечении кожно-мускульного мешка и мезентерия животных [5]. Прорастание спор грибов фиксировали после орошения засеянных спорами питательных сред водными суспензиями вермипрепаратов, полученных классическим методом [там же]. Целлюлазную активность кишечного сока дождевых червей до и после интродукции триходермой измеряли по способу Мендельс-Вебера (Mandels and Weber, 1969). Физиологическую активность червей оценивали по времени их зарывания червей в почву [4]. Выводы сделаны при вероятности безошибочного прогноза P > 0,95.

Результаты и их обсуждения. После микроинъекции культура T. viride сохранялась в кишечниках дождевых червей E. fetida более 40 суток, с тенденцией накопления в заднем отделе кишечника (табл. 1). Данная картина говорит о возможности сохранения и даже размножения взятого штамма грибов в кишечном тракте олигохет.

Таблица 1

Динамика титра T. viride при пассаже через кишечник E. fetida

Время экспозиции, сутки Титр, КОЕ/г

То, КОЕ/мл Отделы кишечника

Передний Средний Задний

1 1,6 Ч108 0,12 ± 0,01 Ч 108 0,4 ± 0,03 Ч 106 0

4 0,13 ± 0,01 Ч 107 0,1 ± 0,01 Ч 106 0,7 ± 0,1 Ч 106

8 0,1 ± 0,02 Ч 106 0,05 ±0,01 Ч 106 0,7 ± 0,05 Ч 106

12 0,5 ± 0,02 Ч 106 0,2 ± 0,03 Ч 106 0,6 ± 0,03 Ч 107

40 0,8 ± 0,02 Ч 107 0,7 ± 0,03 Ч 107 0,3 ± 0,06 Ч 108

Споры T. viride не прорастали в вермипрепарате (10 мг/мл), приготовленном по традиционным прописям.

Инокуляция дождевых червей T. viride активировала антибиотический иммунитет животных. В частности целомическая жидкость дождевых червей, инокулированных грибом, сильнее угнетал рост газона культуры дрожжей, чем в контроле.

Следует отметить, что при некоторых условиях T. viride подавлял жизнедеятельность дождевых червей или даже приводил к их гибели. Это, прежде всего, зависело от титра используемой суспензии и возрас-

©

тН

О

(N

SS1

2нё ЯЧ г

MhSI

HSS

н5і

ОЙ"

^ 1

5к І

«Л* ё§| h Е

« Р I

8s! Й§ о

ЕнО а

£м§|

МО I £И4

нее

К

н

н

о

н

PQ

со

Н

та культуры. При инокуляции per os 0,05 мл суспензий 2-х недельной культуры с титрами порядка 104-105, КОЕ/мл черви погибали в течение 2-3 суток. Более разбавленная культура с титром 103 КОЕ/мл приводила лишь к снижению их физиологической активности. Так в частности в 5 раз увеличивался период заползания дождевых червей в субстрат. Через неделю у инокулированных триходермой червей продолжали наблюдать отклонения от нормы, но уже противоположного характера: черви в два раза быстрее, чем в контроле убегали от света (рис.).

О S S

о,<§ ^ 6

<U g О ІЇ] Й

С|:2:Л Л J J1 ІІ^

1 2 3 4 5 7 дней

Период времени после инокуляции, ч

□ Контроль □ Инокуляция водой □ Инокуляция триходермой Период зарывания червей в почву

Трехсуточная культура микромицета (105 КОЕ/мл) не оказывала видимого влияния на червей, но скорость зарывания олигохет в почву возрастала на 25%. При свободном скармливании гриба наблюдали увеличение удельной целлюлазной активности в кишечнике дождевых червей в 14 раз (табл. 2). Скармливание фунгицида флуканозола снижало цел-люлазную активность в среднем на 20%. Возможной причиной такого снижения активности целлюлозоразрушающих ферментов могло быть угнетение целлюлозоразрушающей аутомикрофлоры червей.

Таблица 2

Целлюлазная активность кишечного сока дождевых червей

Кишечный сок червей Удельная активность, МЕ/мл

Контроль 0,005 ± 0,0008

Скармливание Т. viri.de, Т = 2,5 Ч 103 КОЕ/г почвы 0,07 ± 0,01

Скармливание фунгицида «Флуканозола», С = 2,0 Ч 10-4 г/г почвы 0,004 ± 0,0007

Инокуляция per os 3-суточной культуры гриба (106 КОЕ/мл) дождевым червям с помощью микроинъектора интенсификцировало переваривание целлюлозы. Бумажный диск, на котором червей содержали без корма, съедали в 1,5 раза быстрее, чем в контроле (40 дней). В этом случае копролиты были более крупными, плотными, имели характерную веретеновидную форму, начинали темнеть через 2-3-е суток, а спустя 15 дней чернели. В контроле копролиты имели округлую форму, что говорит о слабой их спрессованности, более белый цвет. Инокуляция червей 0,001% раствором антибиотика приводила к снижению агреги-рованности копролитаов, повышению рыхлости их структуры, уменьшению степени разрушения целлюлозных нитей, появлению нетипичных осколкообразных обрывков.

Заключение. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о принципиальной возможности использования активных зоомикробных комплексов, состоящих из двух и более биодеструкторов для более эффективной утилизации конкретных отходов.

О

Ю Список использованной литературы

е=1 1. Огарков Б.Н. Биотехнология на основе грибов / Б.Н. Огарков, Г.Р. Огар-

^ кова, Л.В. Самусенок. — Иркутск: Иркут. ун-т, 2005. — 234 с.

2. Полянская Л.М. Судьба актиномицетов в кишечном тракте почвенных беспозвоночных животных, поедающих споры стрептомицетов / Л.М. Полянс-

© кая, Н.И. Бабкина, Г.М. Зенова, Д.Г. Звягинцев // Микробиология. — 1996. —

| Т. 65, № 4. — С. 560-565.

3. Терещенко Н.Н. Эколого-микробиологические аспекты вермикультиви-рования / Н.Н. Терещенко. — Новосибирск: Наука, 2003. — 113 с.

4. Черных В.И. Способ определения влияния водных эмульсий нефтепродуктов при вермикультивировании / В.И. Черных, Д.С. Потапов, Д.И. Стом. — Патент № 2290801 от 10 янв. 2004 г.

5. Sun Zhenjun. Vermiculture and vermiprotein / Zhenjun Sun. China Agricultural University Press, 2003. — 367 р.

6. Stom D.I. Transformation of Oil in Soil by a Microbial Preparation and Earthworms / D.I. Stom, D.S. Potapov, A.E. Balayan, O.N. Matveeva // Eurasian Soil Science. — 2003. — Vol. 36, No. 3. — Р. 329-331.

Bibliography (transliterated)

1. Ogarkov B.N. Biotekhnologiya na osnove gribov / B.N. Ogarkov, G.R. Ogar-kova, L.V. Samusenok. — Irkutsk: Irkut. un-t, 2005. — 234 s.

2. Polyanskaya L.M. Sud’ba aktinomitsetov v kishechnom trakte pochvennykh bespozvonochnykh zhivotnykh, poedayushchikh spory streptomitsetov / L.M. Polyanskaya, N.I. Babkina, G.M. Zenova, D.G. Zvyagintsev // Mikrobiologiya. — 1996. — T. 65, № 4. — S. 560-565.

3. Tereshchenko N.N. Ekologo-mikrobiologicheskie aspekty vermikul’ti-virovaniya / N.N. Tereshchenko. — Novosibirsk: Nauka, 2003. — 113 s.

4. Chernykh V.I. Sposob opredeleniya vliyaniya vodnykh emul’sii neftepro-duktov pri vermikul’tivirovanii / V.I. Chernykh, D.S. Potapov, D.I. Stom. — Patent № 2290801 ot 10 Jan. 2004 g.

5. Sun Zhenjun. Vermiculture and vermiprotein / Zhenjun Sun. China Agricultural University Press, 2003. — 367 р.

6. Stom D.I. Transformation of Oil in Soil by a Microbial Preparation and

§S¥ Earthworms / D.I. Stom, D.S. Potapov, A.E. Balayan, O.N. Matveeva // Eurasian

Mg I! Soil Science. — 2003. — Vol. 36, No. 3. — Р. 329-331.

®н Ц

n3°

Информация об авторах

| Стом Дэвард Иосифович — доктор биологических наук, профессор Иркутс-

! кого государственного университета, г. Иркутск, e-mail: stomd@mail.ru.

%jO | Быбин Виктор Александрович — младший научный сотрудник НИИ биоло-

гии при Иркутском государственном университете, г. Иркутск.

8Приставка Алексей Александрович — кандидат биологических наук, до-§К| цент Иркутского государственного университета, г. Иркутск.

| Саловарова Валентина Петровна — доктор биологических наук, профессор

| Иркутского государственного университета, г. Иркутск.

ай| Огарков Борис Никитич — доктор биологических наук, профессор Иркутское -

кого государственного университета, г. Иркутск, e-mail: Nadin_buk@mail.ru.

H Authors

Stom Daevard Iosifovich — Doctor of Biological Sciences, Professor, Irkutsk State University, Irkutsk, e-mail: stomd@mail.ru.

OByibin Victor Aleksandrovich — Junior Research Scientist, Scientific Research Institute of Biology, Irkutsk State University, Irkutsk.

Pristavka Aleksey Aleksandrovich — PhD in Biological Sciences, Associate Professor, Irkutsk State University, Irkutsk.

Salovarova Valentina Petrovna — Doctor of Biological Sciences, Professor, CQ Irkutsk State University, Irkutsk.

H Ogarkov Boris Nikitich — Doctor of Biological Sciences, Professor, Irkutsk

State University, Irkutsk, e-mail: Nadin_buk@mail.ru.