CC BY
10
Семенова Н. Ю.1, Чубарь А. В.2, Енукашвили Н. И.2,3, Кострома И. И.1, Жернякова А. А.1, Артюхина З. Е.1,\Ругать В. И.1, Иволгин Д. А.3 4, Грицаев С. В.1,
Чечеткин А. В.1, Бессмельцев С. С.1
1 ФГБУ «Российский НИИ гематологии и трансфузиологии ФМБА России»
2 ФГБУН Институт цитологии РАН
3 ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И. И. Мечникова» Минздрава РФ
4 ООО «Покровский банк стволовых клеток»
ПЕРЕСТРОЙКА КЛЮЧЕВЫХ ЭЛЕМЕНТОВ СТРОМАЛЬНОГО МИКРООКРУЖЕНИЯ КОСТНОГО МОЗГА ПРИ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЕ
Semenova N. Yu.1, Chubar A. V.2, Enukashvili N.I.2,3, Kostroma I.1.1, Zhernyakova A. A.1, Artyukhina Z. E. 1,\Rugal V. I.1, Ivolgin D. A3 4, Gritsaev S. V.1, Chechetkin A. V.1, Bessmeltsev S. S.1
1 Russian Research Institute of Hematology and Transfusiology FMBA of Russia
2 Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences
3 North-Western State Medical University named after 1.1. Mechnikov,
4 Pokrovsky Stem Cell Bank, LLC
RECONSTRUCTION OF KEY ELEMENTS OF THE STROMAL MICROENVIRONMENT OF THE BONE MARROW IN MULTIPLE MYELOMA
Резюме. В работе исследовались особенности стромального микроокружения костного мозга (КМ) в трепанобиоптатах подвздошной кости 30 больных множественной миеломой (ММ) в возрасте от 48 до 78 лет (медиана возраста 56 лет) до и после терапии. Использовались гистологические, иммуногистохимические и куль-туральные методы исследований. Установлены морфофункциональные изменения ключевых структур стромального микроокружения КМ: увеличение плотности микрососудов васкуляр-ной ниши, увеличение количества эндостальных стромальных клеток. Повышенный ангиогенез коррелирует с количеством плазматических клеток в миелограмме (г = 0,58; р < 0,05) и с типом инфильтрации КМ (г = 0,85; р < 0,05). В культу-ральных исследованиях мезенхимных стромальных клеток (МСК) также показаны изменения, ассоциированные с миофибробластоподобным фенотипом и старением: по сравнению со здоровыми донорами показано снижение скорости пролиферации (в среднем в 2,4 раза), увеличение экспрессии а-гладко-мышечного актина (а-ГМА) и р-галактозидазы (БА-р-ОаГ).
Таким образом, культуры МСК пациентов и нишеформирующие элементы КМ пациентов с ММ обладают чертами опухоль-ассоцииро-ванного микроокружения, несмотря на проведенное лечение основного заболевания.
Ключевые слова. Множественная миелома, костный мозг, ниша гемопоэтических стволовых клеток, микроокружение, ангиогенез, мезенхимные стромальные клетки.
Abstract. The study investigated the features of stromal microenvironment of the bone marrow (BM) in trepanobioptates of the iliac bone in 30 patients with multiple myeloma (MM) aged 48 to 78 years (median age 56 years) before and after treatment of the disease. Histological, immunohis-tochemical, and cultural research methods were used. Morphofunctional changes in key structures of the BM stromal microenvironment were established: an increase in the density of microvessels in the vascular niche, and an increase in the number of endostal stromal cells. Increased angiogene-sis correlates with the number of plasma cells in the myelogram (r = 0.58; p < 0.05) and with the type of KM infiltration (r = 0.85; p < 0.05). Cultural studies of mesenchymal stromal cells (MSC) also show changes associated with myofibro-blast-like phenotype and aging: compared with healthy donors, a decrease in the rate of proliferation (on average, 2.4 times), an increase in the expression of a-smooth muscle actin (a-GMA) and p-galactosidase (SA-p-Gal). Thus, cultures of MSC of patients and niche-forming elements of BM of patients with MM have features of tumor-associated microenvironment, despite the treatment of the underlying disease.
Keywords. Multiple myeloma, bone marrow, hematopoietic stem cell niche, microenvironment, angiogenesis, mesenchymal stromal cells.
Введение. Строма костного мозга имеет ряд морфофункциональных особенностей и формирует особое микроокружение для развития и самоподдержания гемопоэтических стволовых клеток. Тесные взаимодействия стромального и паренхиматозного компонентов костного мозга определяют пути становления здорового гемопоэза, а нарушения в этой сложной системе взаимосвязей приводят к развитию патологических процессов [1-3]. Исследования взаимодействий опухоль-микроокружение важны как для раскрытия фундаментальных основ заболевания, так и для поиска новых клинически значимых прогностических факторов.
Множественная миелома (ММ), неизлечимое на сегодня злокачественное заболевание, обусловленное трансформацией В-лимфоцитов, пролиферирующих в интрамедуллярных пространствах костного мозга. В качестве одной из гипотез развития заболевания выдвигается положение о дефекте гемопоэтических стволовых клеток, за пролиферацию и дифференцировку которых отвечает гемопоэтическая ниша костного мозга (КМ) [4,5]. В настоящее время всё большее внимание уделяется вопросу о роли ниши КМ в опухолеобразовании и развитии ранних рецидивов [1-5]. Мезенхимные стро-мальные клетки (МСК) являются одними из ключевых компонентов гемопоэтической ниши КМ. Если основной функцией МСК в здоровом КМ является поддержка гемопоэза, то при взаимодействии с опухолевыми клетками изменяется как фенотип, так и функции МСК — они начинают поддерживать рост опухоли и обеспечивают защиту от иммунной системы [6-8]. Микроокружение опухоли в динамике приобретает новые морфофункциональные характеристики в ответ на изменения в молекулярной биохимии, генетическом профиле и разнообразии типов опухолевых клеточных популяций [2, 6, 8-9]. Опухолевое микроокружение влияет на рост и пролиферацию, миграцию, тип инфильтрации опухолевых клеток, обеспечивая структурную и питательную поддержку за счет выработки цитокинов, хемокинов, адипокинов, факторов роста (например, 1Ь-6, IGF-1, УЕ^, ТОТ-а и SDF-1), белков внеклеточного матрикса, лигандов к клеточным рецепторам сигнальных путей и других молекул. Все это в совокупности может влиять на приобретение лекарственной устойчивости злокачественных клеток.
Таким образом, настоящая работа посвящена изучению морфофункциональных свойств ключевых нишеобразующих элементов кро-
ветворного микроокружения при ММ с целью разработки морфологического способа диагностики повреждений нишеобразующих структур костного мозга.
Цель. Определить морфофункциональные особенности стромальных элементов кроветворного микроокружения, участвующих в формировании ниши гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и лимфоидных клеток-предшественниц.
Материалы и методы. В настоящей работе проанализирован материал от 30 пациентов с ММ, которые находились на лечении в ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России с января 2017 г. по сентябрь 2019 г. Материалом исследования послужили цельные фрагменты подвздошной кости и аспираты костного мозга 30 больных ММ в возрасте от 48 до 78 лет (медиана возраста 56 лет), в том числе после проведенного лечения (терапия по схемам VD, CVD, включая высокодозную терапию с последующей Ау-тоТГСК). Контрольную группу при изучении костного мозга составили фрагменты подвздошной кости 10 здоровых лиц 50-75 лет (медиана возраста 58 лет). Контрольная группа была сопоставима по полу, возрасту и национальности с основной группой. В работе применялись гистологические, иммуногистохими-ческие, культуральные методы исследований. Для определения фенотипа МСК применяли метод проточной цитометрии, иммунофлуо-ресцентный анализ для выявления а-гладко-мышечного актина (а-ГМА).
Статистическая обработка полученных данных проводилась методом вариационной статистики с определением средней величины (М), ее средней ошибки (m), стандартного отклонения (SD.) Достоверность различий оценивалась с помощью критерия Стьюдента (t), критерия Манна-Уитни. Различие между сравниваемыми показателями считалось статистически значимым при р<0,05. Для выяснения зависимости между показателями применялся корреляционный анализ.
Математическую обработку результатов исследования проводили с использованием программ Statistica v.6.0, MedCalc, Microsoft Excel для Windows ХР.
Результаты. Гистологические особенности КМ и компонентов гемопоэтической ниши КМ
Оценка объема инфильтрации КМ плазматическими клетками является одним из критериев диагностики ММ. При гистологическом исследовании трепанобиоптатов подвздошной
кости больных ММ в КМ обнаруживалась неоднородная клеточная инфильтрация кроветворной ткани миеломными клетками. Опухолевые клетки в большинстве случаев имели типичную структуру зрелых плазмоцитов, в которых не выявлялись ядрышки. Реже миеломные клетки классифицировались как проплазмоциты, плаз-мобласты. Среди инфильтрирующих паренхиму плазмоцитов обнаруживались клетки с Рус-селевскими тельцами, двуядерные и многоядерные формы. В исследуемой группе было выделено два типа поражения КМ: интерсти-циальный и диффузный. Интерстициальный тип миеломного поражения характеризовался наличием плазматических клеток, расположенных среди элементов нормального гемопоэза,
без изменения соотношения с жировой тканью. Число гемопоэтических клеток снижалось в зависимости от интенсивности насыщения костномозговых лакун миеломными клетками. Диффузный тип поражения диагностировался в случаях массивной инфильтрации миеломными клетками интрамедуллярных пространств, которая сопровождалась редукцией жировой ткани с замещением костномозговых пространств плазмоцитами и различной степенью угнетения гемопоэза.
При анализе 30 трепанобиоптатов КМ интер-стициальная инфильтрация наблюдалась у 22 пациентов (73,3 %) и диффузная у 8 пациентов (26,7%) (Рисунок 1).
Рисунок 1. Типы опухолевой инфильтрации в костном мозге: А) интерстициальная, Б) диффузная, 100х. Окраска гематоксилином-эозином.
Анализ стромальных структур микроокружения свидетельствовал об изменении состояния стромы при всех типах поражения интра-медуллярной паренхимы. Интерстициальная инфильтрация КМ плазмоцитами сопровождалась увеличением интрамедуллярных ретикулярных клеток, наличием ретикулиновых волокон, разбросанных в паренхиме без формирования склеротической сети,отмечались участки деструкции коллагена трабекул без статистически значимого уменьшения объема костной ткани. Увеличивается количество волокон коллагена III типа в субэндостальных пространствах. Статистически достоверных количественных изменений клеток эндоста при данном поражении КМ не выявлено, однако соотношение клеток с уплощенными и крупными ядрами изменяется в сторону увеличения количества последних. Определялось увеличение плотности микрососудов васкулярной ниши КМ по сравнению с контролем (11,4 ± 1,1 %; р < 0,05).
Отчетливо проявлялись изменения стро-мального микроокружения КМ, включая структуры, образующие васкулярную и остеобласт-ную ниши, при исследовании трепанобиоптатов с диффузным поражением КМ. Наряду с изменением количества и структуры нишеобразу-ющих элементов, происходили качественные перестройки стромального микроокружения в целом. Диффузная инфильтрация КМ сопровождалась редукцией адипоцитов, оставшиеся жировые клетки характеризовались снижением объема жировой вакуоли. В костномозговых пространствах происходило усиление ретикулинового рисунка вплоть до появления грубых ретикулиновых волокон, образующих пересечения с формированием ретикулинового склероза. Определялось увеличение плотности микрососудов (12,3 ± 1,4%; р < 0,05), нарастание числа эндостальных клеток с уплощенными ядрами, нарушение структуры коллагена трабекул костной ткани. Площадь костных балок была снижена на 4-7 % (р < 0,05) (Таблица 1).
Таблица 1.
Морфометрические показатели структур костного мозга подвздошной кости в зависимости от типа лимфоидной инфильтрации (М±т)
Паренхима и строма костного мозга Здоровые лица (n = 10) Больные ММ
Интерстициальная инфильтрация (n = 22) Диффузная инфильтрация (n = 8)
Гемопоэтическая ткань (в том числе лимфоидные пролифераты) (площадь, %) 37,8 ± 3,15 46,5 ± 3,9 (21,4 ± 5,4) 61,5 ± 3,4* (45,3 ± 5,7)
Жировая ткань (площадь, %) 32,1 ± 2,2 24,7 ± 2,8 12,0 ± 3,4*
Костная ткань (площадь, %) 21,0 ± 2,41 17,4 ± 1,5 14,2 ± 2,15
Сосуды МЦР (площадь, %) 9,1 ± 1,4 11,4 ± 1,1* 12,3 ± 1,4*
Эндостальные клетки (кол-во на ед. пл.) 1,4 ± 0,2 1,6 ± 0,7 2,5 ± 0,5*
Примечание: * — р< 0,05, отличия достоверны в сравнении с контролем.
Результаты иммуногистохимического окрашивания с антителами к остеонектину, остеопонтину, костным морфогенетическим белкам (ВМР-1, ВМР-4) и молекулам адгезии (К-кадгерину и р-катенину) показали отличия в топографии экспрессии этих молекул. Однако выявить определенные тенденции не удалось, статистически значимых отличий не обнаружено (р>0,05). Данные требуют проведения дополнительных исследований.
Были отмечены изменения в распределении коллагенов разных типов по мере нарастания фиброзных изменений. Так была показана тенденция увеличения количества коллагена
I и III типов, в то время как коллаген IV типа и ламинин практически не определялись, сосуды имели прерывистую базальную мембрану. Коллаген I типа в костном мозге во всех случаях отмечался в трабекулах и стромальных клетках рядом с ними. Коллаген III типа определялся в зонах эндоста, рядом с мегакариоцитами.
Увеличение площади микрососудов коррелировало с количеством плазматических клеток в миелограмме (r = 0,58; р < 0,05), с типом инфильтрации КМ (r = 0,85; р < 0,05), а также с остеодеструктивными изменениями в анамнезе больного (r = 0,65; р < 0,05).
Рисунок 2. Иммуногистохимическое выявление сосудов в костном мозге с антителами CD34 II: А) диффузная инфильтрация КМ, Б) группа сравнения, 200х.
Культуральные исследования мезенхим-ных стромальных клеток (МСК) КМ
Для оценки количества МСК в полученных первичных культурах на 2 пассаже определялся уровень экспрессии поверхностных антигенов согласно панели, предложенной Международным Обществом Клеточной Терапии: CD44,
CD73, CD90, CD105 — положительные маркеры МСК; СЭ14, СЭ34, СЭ45, СЭ117 — негативные маркеры, экспрессия которых характерна для гемопоэтических клеток. Полученные культуры соответствовали критериям МСК: положительные маркеры экспрессировало >95 % клеток первичных культур, а отрицательные
<2 % клеток большинства первичных культур. Достоверных статистических различий по большинству маркеров между экспериментальной и контрольной группой выявлено не было. Контрольную группу составили культуры МСК от 5 здоровых доноров костного мозга (ЗД).
Полученные культуры МСК КМ пролифери-ровали в течение 4-5 пассажей, после чего рост культур останавливался. Скорость пролиферации определяли на 2-3 пассаже. По скорости пролиферации все культуры МСК КМ пациентов с ММ делились на два типа: нормально и медленно пролиферирующие (рисунок 3). В группу нормально пролиферирующих культур вошли
37,5 % культур МСК КМ от пациентов с единичными плазматическими клетками (ПК) в миелограмме и минимальной интерстици-альной инфильтрацией КМ до 10 % по данным гистологических исследований, скорость пролиферации этих культур не отличалась от скорости пролиферации культур МСК от ЗД. Среди пациентов с высокой степенью инфильтрации КМ таких образцов обнаружено не было. В группу медленно пролиферирующих вошли 62,5 % культур МСК КМ пациентов с единичными ПК и 100 % культур МСК КМ пациентов с высокой степенью инфильтрации КМ.
Рисунок 3. Пролиферативная активность МСК КМ пациентов с ММ.
При ММ наблюдается нарушение процессов остеогенеза, в том числе из-за изменений остеогенного-дифференцировочного потенциала МСК КМ. Культуры МСК КМ пациентов с ММ с единичными ПК сохраняли способность к остеогенной дифференцировке, но
могли наблюдаться индивидуальные различия в степени дифференцировки. Во всех культурах МСК КМ пациентов с высокой степенью инфильтрации КМ наблюдалось снижение способности к остеогенной дифференцировке (Рисунок 4).
Рисунок 4. Средняя площадь кальцификатов после индукции остеогенной дифференцировки МСК КМ.
Снижение скорости пролиферации является характерным изменением МСК КМ после контакта с опухолевыми клетками, поэтому далее проверялось наличие других известных маркеров опухоль-ассоциированного фенотипа (а-ГМА, 8А-в-0а1). В группе ЗД синтез а-ГМА отсутствовал или был характерен для одиночных клеток без выявления фибрилл актина. Фибриллы а-ГМА выявлялись в 75 % культур МСК КМ пациентов с ММ с высокой степенью инфильтрации КМ и в 25% культур МСК КМ пациентов с ММ с интерстициальной инфильтрацией КМ.
В сравнении со ЗД достоверно выявляется увеличение числа клеток, синтезирующих БА-р-§а1 (ассоциированная со старением р-галактозидаза), во всех культурах МСК КМ пациентов с ММ. Известно, что, в отличие от опухолевых клеток, в МСК КМ при обработке цитостатиками не индуцируется апоптоз, а проявляются признаки старения в сочетании с другими признаками опухоль-ассоциирован-ных фибробластов. Поэтому в качестве положительного контроля использовалась культура фибробластов с индуцированным обработкой доксорубицином старением (Рисунок 5).
Рисунок 5. Число клеток, синтезирующих SA-в-gal в полученных культурах МСК КМ и контрольной культуре, в которой индуцировали старение (К+). * — р < 0.05;
** — р<0.01; *** — р<0.001.
Обсуждение. Установлено, что независимо от характера опухолевой инфильтрации КМ — интерстициального или диффузного — наблюдаются морфофункциональные перестройки клеточных и внеклеточных элементов, участвующих в формировании гемо-поэтической ниши: изменяется соотношение содержания интратрабекулярных коллагенов I и III типов, увеличивается количество эндо-стальных стромальных клеток костного мозга, изменяется их структурная организация, нарастает плотность микрососудов костномозговой паренхимы, включая анатомические зоны локализации родоначальных кроветворных клеток в области эндоста. Выявлена взаимосвязь между плотностью микрососудов и клинико-лабораторными показателями, маркирующими неблагоприятное течение заболевания (маркеры неблагополучного прогноза).
Опухолевое микроокружение поддерживает рост опухолевых клеток, что ограничивает возможность нормального гемопоэза, при этом сокращается число гемопоэтиче-ских предшественников. При том, что МСК КМ демонстрировали сходный со ЗД имму-нофенотип, они различались по способности к пролиферации. Лишь 37,5 % культур МСК КМ от пациентов с единичными ПК сохраняли скорость пролиферации, сопоставимую с контрольной группой. При прогрессии ММ скорость пролиферации снижалась: ни одна из культур МСК КМ от пациентов с высокой степенью инфильтрации КМ не входит в группу нормально пролиферирующих культур. Наблюдаемое снижение пролиферативной активности согласуется с данными другого исследования об изменении МСК КМ при ММ, где показано снижение скорости пролиферации, увеличение клеток и другие черты
старения МСК КМ от пациентов с ММ [10]. Снижение скорости пролиферации МСК КМ при ММ коррелирует с синтезом маркеров опухоль-ассоциированного фенотипа.
Потенциал к остеогенной дифференциров-ке МСК КМ различался между ЗД и пациентами с ММ. В полученных результатах, несмотря на различия между пациентами, остеогенно-дифференцировочный потенциал МСК КМ при единичных опухолевых клетках был выше, чем у пациентов с высокой степенью инфильтрации КМ. Снижение способности к пролиферации, остеогенной дифференцировке, отражают изменения, происходящие с МСК КМ после контакта с опухолевыми клетками. МСК КМ приобретают черты опухоль-ассоциированного фенотипа, не характерные для ЗД. Характерными признаками данного фенотипа является синтез а-ГМА и БА-р-§а1. Согласно полученным результатам, по сравнению со ЗД при ММ происходит увеличение уровня синтеза а-ГМА, причём при низкой степени инфильтрации КМ количество положительных культур составляет 25 %, а при высокой — 75 %. Аналогичны результаты, полученные при выявлении БА-р-§а1: при ММ фер-
мент выявляется на более высоком уровне, чем у ЗД, и показатели приближаются к таковым при индуцированном старении (рисунки 5). Полученные данные согласуются с работами других авторов, показавших наличие данных маркеров при опухолевых заболеваниях, в том числе ММ [10].
Заключение. Результаты, полученные в культуральных исследованиях, дополняют и подтверждают полученные морфологическим методом данные и свидетельствуют о вовлечении структур васкулярной и эндостальной ниши в прогрессию заболевания. В данном исследовании показано, что ниша ГСК в КМ у больных ММ отличается от таковой у здоровых доноров КМ. Морфофункциональные особенности основных элементов ниши КМ могут быть причиной нарушений в регуляции развития ГСК. Дальнейшие исследования стромальной ниши ГСК в динамике течения заболевания и в условиях применения современных схем терапии позволят получить дополнительные данные о патогенетической роли нишеобразующих структур в регуляции В-лимфопоэза.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Purton L. E., Scadden D. T. The hematopoietic stem cell niche // StemBook, ed. The Stem Cell Research Community.— 2008.— V. 15.— P. 1-14.
2. Герасимова Л. П., Дризе Н. И., Лубкова О. Н. и др. Нарушения стромального микроокружения у больных с различными заболеваниями системы крови //Гематология и трансфузиология.— 2008.— Т. 53, №5.— С. 59-62.
3. Семенова Н. Ю., Бессмельцев С. С., Ругаль В. И. Биология ниши гемопоэтических стволовых клеток // Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика.— 2014.— Т. 7, № 4.— С. 501-510.
4. Бессмельцев С. С. Множественная миелома (лечение первичных больных): обзор литературы и собственные данные. Часть 2 //Клиническая Онкогематология.— 2013.— Т. 6, № 4.— С. 379-414.
5. Бессмельцев С. С., Абдулкадыров К. М. Множественная миелома: руководство для врачей / М.: МК, 2016.— 504 с.
6. Семенова Н. Ю., Бессмельцев С. С., Артюхина З. Е., Ругаль В. И. Состояние структур гемопоэтической ниши при множественной миеломе // Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика.— 2017.— Т. 10, № 4.— С. 577-578.
7. Kudo-Saito C. Cancer associated mesenchymal stem cells aggravate tumor progression // Front. Cell Dev. Biol.— 2015.— Vol. 3.— 23 p.
8. Xu S., De Veirman K., De Becker A. et al. Mesenchymal stem cells in multiple myeloma: a therapeutical tool or target? // Leukemia.— 2018. — Vol. 32, N7.— P. 1500-1514.
9. Покровская О. С., Менделеева Л. П., Капланская И. Б., Грибанова Е. О., Варламова Е. Ю., Обухова Т. Н., Гемджян Э. Г., Савченко В. Г. Ангиогенез в костном мозге больных множественной миеломой на различных этапах высокодозной химиотерапии // Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика.— 2010.— Т. 3, № 4.— С. 347-353.
10. André T., Meuleman N., Stamatopoulos B. et al. Evidences of early senescence in multiple myeloma bone marrow mesenchymal stromal cells // PLoS ONE.— 2013.— Vol. 8, N3.— e59756.
