CC BY
131
УДК 541.182.642:546.57:612.[647+664].621.039.85
Перенос наночастиц серебра через плаценту и молоко матери в эксперименте на крысах in vivo
Е. А. Мельник1, Ю. П. Бузулуков2, В. Ф. Демин2, И. В. Гмошинский1*, Н. В. Тышко1,
В. А. Тутельян1
1Научно-исследовательский институт питания РАМН, 109240, Москва, Устьинский пр-д, 2/14
Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», 123182, Москва,
пл. Академика Курчатова, 1
*E-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 18.12.2012
РЕФЕРАТ Наночастицы (НЧ) серебра, широко используемые при производстве различных видов потребительской продукции и в медицине, относятся к новым видам материалов, создающих потенциальные риски для здоровья человека. Возможные негативные эффекты воздействия этих НЧ на репродуктивную сферу изучены недостаточно. В эксперименте in vivo проведена количественная оценка переноса наночастиц металлического серебра через плаценту и с молоком матери. Использовали НЧ серебра размером 34.9 ± 14.8 нм, стабилизированные низкомолекулярным поливинилпирролидоном, которые метили радиоактивным изотопом 110mAg путем облучения потоком тепловых нейтронов в ядерном реакторе. Препараты [110mAg]-HH вводили внутрижелудочно через зонд беременным (20-й день беременности) или лактирующим (14-16-й дни лактации) самкам крыс в дозе 1.69-2.21 мг/кг массы тела в расчете на серебро. Накопление НЧ в плодах крыс и в крысятах, потреблявших материнское молоко, определяли с помощью низкофонового полупроводникового гамма-спектрометра через 24 и 48 ч после введения метки соответственно. Во всех случаях обнаружено проникновение метки [“^"^^НЧ через плаценту и ее поступление в материнское молоко в количестве, в 100-1000 раз превышающем чувствительность использованного аналитического метода. Средний уровень накопления НЧ в плодах составлял 0.085-0.147% от введенной дозы, что было сопоставимо с аккумуляцией метки в печени, крови и мышечном каркасе взрослых животных, и, как минимум, в 10-100 раз превосходил проникновение НЧ через гематоэнцефалический барьер в головной мозг самок. У лакти-рующих самок суммарное поступление [“^"^^НЧ в молоко составляло не менее 1.94 ± 0.29% от введенной дозы за 48 ч лактации; не менее 25% этого количества всасывалось в пищеварительном тракте крысят. Таким образом, впервые получены экспериментальные доказательства переноса НЧ от матери к потомству через плаценту и с грудным молоком.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА беременность, лактация, наночастицы, радиоактивный индикатор, серебро, фетоплацентарный барьер.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ БАД - биологически активная добавка; ЖКТ - желудочно-кишечный тракт; МР -методические рекомендации; МДА - минимальная детектируемая активность; НЧ - наночастицы; НМ - наноматериалы; ПВП - поливинилпирролидон; M - выборочное среднее; m - стандартная ошибка среднего.
ВВЕДЕНИЕ
Прогрессивное развитие нанотехнологий и увеличение объемов выпуска и практического применения искусственных наночастиц (НЧ) и наноматериалов (НМ) привели к тому, что в ближайшее время НЧ могут стать значимыми контаминантами окружающей среды. Из числа приоритетных НМ особое внимание привлекают НЧ серебра, широко применяемые в различных видах потребительской продукции (дезинфицирующие средства, текстиль, лакокрасочные изделия, косметика, упаковочные материалы, БАД
к пище) [1, 2], а также имеющие разнообразные био-фармацевтические приложения, включая использование в качестве антимикробных [3, 4], противовоспалительных [5] препаратов и средств молекулярной нанодиагностики in vivo [6]. Вместе с тем НЧ серебра должны рассматриваться и как определенный источник рисков по причине их возможной токсичности для человека [7-15]. Особенно это относится к рискам, связанным с воздействием НМ на детский организм в результате их возможного переноса через плаценту, а также через грудное молоко [16]. Не ис-
ключена возможность поступления к потомству НМ, присутствующих в рационе матери или используемых ею в составе косметических средств или препаратов бытовой химии [17]. Количественная оценка такого переноса НЧ необходима для определения потенциальных рисков воздействия НЧ серебра, поступающих в организм матери, для потомства и разработки соответствующих защитных мероприятий, включая гигиеническое нормирование в потребительской продукции. Однако возможность переноса НЧ, естественным путем поступающих в организм матери, к ее потомству изучена крайне недостаточно в связи со специфическими методическими трудностями определения НЧ в составе биологических объектов [18, 19]. Анализ методов выявления НЧ в составе биологических образцов, включая электронную и атомно-силовую микроскопию, спектральные методы, хроматографию, использование флуоресцентных, спиновых, стабильно-изотопных и других меток [18], позволил выбрать в качестве оптимального метод радиоактивных индикаторов, являющийся строго количественным, высокочувствительным и допускающим простую и наглядную интерпретацию результатов применительно к НЧ, не подвергающихся биотрансформации и биодеградации в организме - НЧ золота, платины, серебра [20].
В представленной работе проведена количественная оценка транспорта НЧ серебра через плаценту, а также с грудным молоком на модели беременных и кормящих самок крыс с использованием препарата НЧ, меченных радиоактивным изотопом 110mAg.
экспериментальная часть
Дизайн эксперимента
Исследование проведено на беременных и кормящих крысах линии «Вистар», содержавшихся в клинике лабораторных животных ФГБУ «НИИ питания» РАМН. В преконцептуальный период и на протяжении всей беременности и лактации самки получали стандартный полусинтетический рацион ФГБУ «НИИ питания» РАМН согласно [21]. Срок беременности самок составлял 20 дней после зачатия, срок лактации - в среднем 10-11 дней после рождения потомства. Беременным крысам [110mAg]-НЧ серебра вводили внутрижелудочно через зонд в дозе 1.69 мг/кг массы тела (три самки) и 2.21 мг/кг массы тела (четыре самки) в виде дисперсии в деионизованной воде, содержащей нетоксичный, неабсор-бируемый в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) стабилизатор НЧ - поливинилпирролидон (ПВП) с молекулярной массой 15-30 кДа; после чего крыс помещали в индивидуальные клетки из полистирола. Через 24 ч после введения препарата крыс подверга-
ли глубокой анестезии диэтиловым эфиром, вскрывали брюшную полость, обескровливали из нижней полой вены и отбирали матку с плодами, печень и головной мозг. Плоды извлекали из матки, тщательно отмывали от околоплодной жидкости. После этого плоды, печень и головной мозг самок помещали во флаконы для гамма-спектрометрии из полиэтилена высокой чистоты. При отборе проб соблюдали меры предосторожности от загрязнения исследуемых органов и плодов крыс НЧ, которые содержатся в других внутренних органах и крови.
В эксперименте на лактирующих крысах пять самок, вскармливающих по 9 крысят каждая, получали внутрижелудочно раствор [110mAg]-НЧ серебра в дозе 2.11 мг/кг массы тела, после чего их возвращали в индивидуальные клетки из полистирола, в которых находилось их потомство. По условию эксперимента исключалась копрофагия экскрементов самок детенышами. Через 48 ч после введения метки крысят, вскармливаемых самкой, подвергали ингаляции диэтиловым эфиром в летальной дозе, тщательно промывали для удаления возможных следов экскрементов самки с шерстяного покрова, удаляли кожу с подкожно-жировой клетчаткой, а тушки помещали во флаконы для гамма-спектрометрии. Тушки четырех крысят вскрывали, выделяли ЖКТ, печень, почки, селезенку и остающийся каркас. Полученные препараты помещали по отдельности во флаконы для гамма-спектрометрии.
Получение меченных [110mAg] наночастиц
В работе использован препарат коллоидного серебра «Арговит» производства фирмы ООО НПЦ «Вектор-Вита» (Россия), который представлял собой водную дисперсию НЧ металлического серебра, содержащую 1.0—1.4% по массе серебра и 18.6-19.0% ПВП. По данным электронной микроскопии (рис. 1), средний диаметр НЧ составлял 34.9 ± 14.8 нм; минимальный размер - 8.4 нм, максимальный - 80.9 нм; форма частиц была близка к сферической. Препарат разводили деионизованной водой в отношении 1 : 11 или 1 : 47 и запаивали в ампулы из высокочистого кварца, которые затем облучали потоком тепловых нейтронов (0.005 < Еп < 0.4 эВ) в вертикальном экспериментальном канале ВЭК-9 ядерного реактора ИР-8. После извлечения из реактора ампулы выдерживали в течение 48 ч для уменьшения фона гамма-активности короткоживущего изотопа кремния в материале ампулы, вскрывали, объединяли содержимое, обрабатывали ультразвуком (5 мин, 44 кГц, 40 Вт) для устранения вторичной агрегации НЧ и доводили до фиксированного объема деионизованной водой. Непосредственно перед введением крысам отбирали 0.04 мл дисперсии меченных [110mAg] НЧ, что состав-
А
Б
X
н
u
m
x
О
m
H
и
<U
X
X
с
о
Диаметр частиц, нм
Рис. 1. Электронная микрофотография НЧ серебра в препарате «Арговит» (А) и гистограмма распределения частиц по диаметру (Б). Электронный микроскоп JEM-100CX ^еоі, Япония), ускоряющее напряжение 80 кВ. Исследование проведено в лаборатории иммунобиохимии ИНБИ им. А.Н. Баха РАН
ляло примерно 1% количества, вводимого крысам, переносили во флакон для гамма-спектрометрии и доводили деионизованной водой до объема, приблизительно соответствующего объему биологического образца (плода или тушки крысенка). Полученную пробу использовали в качестве эталона при определении активности биологических образцов.
Анализ образцов
Активность биологических образцов измеряли на гамма-спектрометре производства фирмы Canberra (США) в составе германиевого полупроводникового детектора GC4018, анализатора DSA-1000,
35 30 25 20 15 10 5 0
0 20 40 60 80
программного обеспечения Genie-2000 - Genie S501, Genie S502. Величины активности, выраженные в единицах импульсов в минуту в одном из выбранных энергетических диапазонов изотопа 110mAg [22], пересчитывали в относительные количества радио-изотопной метки (ц) в % от введенной дозы по формуле:
И-£*№),
где Ап - активность биопробы, Аэ - активность эталонного образца, содержащего 0.04 см3 дисперсии меченных [110mAg]-H4, K - коэффициент пересчета, представляющий отношение индивидуального количества дисперсии НЧ (см3/кг массы тела), вводимой самкам, к усредненной дозе, полученной делением полного объема введенной дисперсии на суммарную массу тела всех самок в группе.
Концентрацию НЧ серебра в анализируемых пробах, выражаемую в нг/г образца, рассчитывали с учетом индивидуального количества НМ, введенного самке, по следующей формуле:
C = Dх( (sjx 106,
где ц - относительное количество радиоактивной метки, % от количества, введенного самке, D - вводимая доза, мг/кг массы тела, F - масса тела самки, кг, s - масса биологического образца, г, 106 - коэффициент перехода от мг к нг.
Использование для определения массы 110Ag в биологических образцах метода относительных гамма-спектрометрических измерений позволило исключить из расчетов абсолютную активность (выраженную в Бк) и оперировать первичными данными измерений (имп./с), что позволило устранить ряд ошибок, возникающих при переходе от первичных данных к абсолютной активности. В этой ситуации основная ошибка измерений определяется значениями фона в выбранном энергетическом диапазоне. По этой причине при оценке минимального достоверного уровня скорости счета 110mAg в образцах использовали понятие минимальной детектируемой активности (МДА) в виде предела количественного определения Lq [23, 24].
Метрологическая характеристика метода
При определении метрологических характеристик использовали понятие МДА в виде предела количественного определения Lq, рассчитываемого по соотношению:
Lq = 5.66 / T,
А 0.1 0.05 0.02 0.01 0.005 0.002 0.001 0.0005 0.0002 0.0001
*!«
Э1
Э2
100
50
20
10
5
2
1
0.5
0.2
0.1
Э1
Э2
Рис. 2. Содержание (А) и концентрация (Б) [110тАд]-НЧ серебра в плодах крыс. Ось абсцисс - № беременной самки, № эксперимента; ось ординат - содержание НЧ, % от введенной дозы (А), концентрация НЧ (нг/г образца) (Б). Здесь и на рис. 3 пунктиром показан предел количественного определения [110тАд]-НЧ в образцах
где Rь - скорость счета фона, составляющая в применяемой гамма-спектрометрической аппаратуре 2.64 х 10-3 имп./с, Т - среднее время измерения образца, равное 3600 с, а 5.66 - коэффициент, учитывающий доверительный интервал оценки р = 0.95 и относительную статистическую неопределенность ± 50%. С учетом этого Lq = 4.8 х 10-3 имп./с [23, 24]. Применительно к используемому препарату [110mAg]-НЧ соответствует минимальному пределу количественного определения 2.6 нг НЧ серебра.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис. 2 представлены содержание и концентрация НЧ Ag в плодах крыс через 24 ч после внутрижелу-дочного введения [110mAg]-НЧ беременным самкам, а в табл. 1 приведены средние (М ± т) значения по каждой беременной самке и по эксперименту в целом, при двух использованных дозах НМ. Как следует из представленных результатов, НЧ серебра были выявлены во всех плодах от всех беременных самок в количествах, значительно превышавших предел определения. Полученные данные свидетельствуют о проникновении НЧ серебра через стенку кишки и плаценту с последующим накоплением в плодах.
Сравнение с данными о всасывании и межорганном распределении [110mAg]-НЧ, вводившихся внутриже-лудочно самцам крыс в сопоставимой дозе (0.81 мг Ag/кг массы тела) [20], показывает (табл. 2), что проникновение НЧ Ag через плаценту более чем в 10 раз превышает накопление в головном мозгу, соответствует уровню в крови и селезенке и существенно ниже накопления в печени. Установленное в настоящем эксперименте содержание НЧ серебра в печени и головном мозгу беременных самок крыс (табл. 2) не отличалось статистически значимо от значений, полученных ранее для взрослых самцов [20] в сопоставимых условиях (Р > 0.05; {-критерий Стьюден-та).
Как следует из данных, представленных на рис. 3 и в табл. 3, в организме всех 45 детенышей в пометах всех пяти лактирующих крыс обнаружены [110mAg]-НЧ, введенные внутрижелудочно лактирующим самкам. Концентрации этих НЧ значительно (в 100-1000 раз) превосходили предел количественного определения.
По условиям проведения эксперимента такие количества [110mAg]-НЧ невозможно объяснить заглатыванием детенышами экскрементов самок, содержащих значительные количества НЧ, загрязнением кожных покровов, удаленных перед проведением гамма-спектрометрии, а также заглатыванием подстилки, загрязненной мочой самки, поскольку полная экскреция НЧ серебра с мочой, как следует из данных [20], не превышала за 2 сут 0.032% от введенной дозы препарата, что в 60 раз меньше количества НЧ, суммарно обнаруженного в детенышах.
Как видно из табл. 4, максимальное количество 110mAg обнаружено в ЖКТ детенышей, однако значимые (намного выше предела количественного определения) уровни наночастиц выявлялись и во внутренних органах, и в каркасе детенышей, что, в свою очередь, указывает на высокий уровень всасывания НЧ в их ЖКТ.
Как следует из табл. 3, общее количество метки [110mAg]-НЧ, экскретированной с молоком и за-
2
3
4
5
б
7
Б
2
3
4
б
7
Таблица 1. Результаты определения [110тАд]-наночастиц серебра в плодах самок крыс через 24 ч после внутри-желудочного введения препарата
Доза НЧ, мг/кг массы Самки крысы, № Число плодов Общее содержание НЧ в плоде, % от введенной дозы* Концентрация НЧ в плоде, нг/г образца* Масса плода, г*
1.69 1 10 0.0114 ± 0.0005 31.7 ± 1.4 2.66 ± 0.04
2 8 0.0122 ± 0.0006 40.0 ± 1.8 2.13 ± 0.08
3 9 0.0254 ± 0.0007 46.7 ± 1.8 4.07 ± 0.08
Среднее (N = 27) 0.0163 ± 0.013 39.1 ± 1.5 2.97 ± 0.16
Однородность распределения, ANOVA, P < 0.001 < 0.001 < 0.001
2.21 4 9 0.0104 ± 0.0009 23.7 ± 2.2 3.91 ± 0.08
5 5 0.0093 ± 0.0011 15.1 ± 1.8 5.72 ± 0.10
6 6 0.0067 ± 0.0008 22.2 ± 1.4 3.07 ± 0.23
7 14 0.0116 ± 0.0004 20.1 ± 0.8 5.26 ± 0.10
Среднее (N = 34) 0.0101 ± 0.0005 20.7 ±0.8 4.58 ± 0.18
Однородность распределения, ANOVA, P < 0.001 0.008 < 0.001
* Средние значения, M ± т.
Таблица 2. Сопоставление накопления НЧ серебра в плодах и во внутренних органах крыс через 24 ч после вну-трижелудочного зондового введения [110тАд]-НЧ
Эксперимент Доза [П0і^]-НЧ, мг/кг Число животных Биосубстрат Содержание, % от введенной дозы
Каркас 0.36 ± 0.17
Печень 0.60 ± 0.18
Кровь 0.126 ± 0.051
Селезенка 0.054 ± 0.020
Самцы крыс, 2011 г.* 0.81 4 Гонады 0.016 ± 0.003
Почки 0.014 ± 0.002
Легкие 0.0094 ± 0.0026
Головной мозг 0.0029 ± 0.0010
Поджел. железа 0.0079 ± 0.0015
Сердце 0.0042 ± 0.0016
Плоды (в сумме) 0.147 ± 0.041
1.69 3 Печень 0.559 ± 0.229
Беременные самки** Головной мозг 0.0035 ± 0.0004
4 Плоды (в сумме) 0.085 ± 0.028
2.21 4 Печень 0.324 ± 0.046
4 Головной мозг 0.0035 ± 0.0006
*Из работы [20]; ** - настоящее исследование.
А 10 5 2 1
0.5 0.2 0.1 0.05 0.02 0.01 0.005 0.002 0.001 0.0005 0.0002 0.0001
0
Б 100
50
20
10
5
2
1
0.5 0.2
0.1 Г--------1-------1-------і-------5-------Г-------1
0 12 3 4 5 6
Рис. 3. Содержание (А) и концентрация (Б) [110тАд]-НЧ серебра в детенышах крыс. Ось абсцисс - № кормящей самки; ось ординат - содержание НЧ, % от введенной дозы (А), концентрация НЧ (нг/г массы тела) (Б). Пунктиром показан предел количественного определения [110тАд]-НЧ в образцах
регистрированной в крысятах, было сопоставимым (или даже большим) с единовременным суммарным содержанием метки во всех органах и каркасе животного после внутрижелудочного введения данного препарата (приведено в табл. 2 согласно [20]). Таким образом, есть основания полагать, что экскреция НЧ Ag с молоком при лактации - один из основных путей выделения этих наночастиц из организма, который количественно уступает только выведению с калом и намного превосходит выведение с мочой.
•I»
.»•
12 3 4 5
<
ч-
б
ОБСУЖДЕнИЕ
Таким образом, при введении беременным и кормящим самкам крыс НЧ Ag в дозах, равных примерно
2 мг/кг массы тела, концентрация НЧ в органах и тканях их потомства составляет порядка 0.020-0.040 и 0.030-0.070 мкг/г ткани соответственно. Дозы НЧ серебра, вводимые самкам крыс, были достаточно высокими и в пересчете на среднюю массу тела человека (70 кг) составляли ~140 мг. Возможность единовременного экспонирования человека такими количествами НМ может возникнуть при потреблении загрязненной питьевой воды, пищевых продуктов или неправильного применения Ag-содержащих БАД. Полученные данные прямо подтверждают возможность передачи НЧ серебра, поступающих в желудочно-кишечный тракт матери, потомству в период как беременности, так и лактации. Возможность такого транспорта НЧ различных видов неоднократно постулировалась как потенциальный источник рисков, создаваемых ими для развития плода и новорожденного [16, 17], однако прямые экспериментальные подтверждения существования этого процесса немногочисленны. Показано [25], что НЧ серебра размером 14 нм в ограниченных количествах всасываются в желудочно-кишечном тракте взрослых крыс в ходе многократного 28-суточного внутри-желудочного введения и распределяются по органам и тканям, включая почки и печень. Данные о проникновении собственно НЧ серебра через фетоплацентарный барьер и молочную железу отсутствуют, однако имеются результаты, подтверждающие возможность переноса близких по физико-химическим свойствам наночастиц металлического золота размером 12-14 нм [26] после внутривенного введения беременным самкам мышей. Описано проникновение квантовых точек CdSe через фетоплацентарный барьер после парентерального введения самкам мышей [27], показана [28] способность флуоресцирующих НЧ полистирола диаметром 50-100 нм проникать через фетоплацентарный барьер, моделируемый монослоем клеток хориокарциномы человека. Полученные нами данные показывают, что в случае НЧ серебра процесс осуществляется in vivo в условиях естественного пути поступления НЧ в организм матери.
Возникает вопрос, насколько значимы концентрации НЧ, выявленные в плодах и детенышах крыс, и могут ли они оказать негативное воздействие на развитие и здоровье потомства? В настоящее время накоплено довольно много данных о биологических эффектах НЧ серебра при различных путях его поступления in vivo. Так, коллоидное серебро вводили мышам внутрибрюшинно в очень высоких дозах, вплоть до 1000 мг/кг [12]. В этих заведомо нефизиологических условиях НЧ проникали через
Таблица 3. Определение [110тАд]-наночастиц серебра во вскармливаемых материнским молоком детенышах крыс через 48 ч после внутрижелудочного введения меченого препарата самкам
Cамка, № Число крысят Общее содержание НЧ, % от введенной дозы* Концентрация НЧ, нг/г массы тела* Масса крысенка, г*
1 9 0.136 ± 0.004 31.9 ± 1.0 28.9 ± 0.4
2 9 0.302 ± 0.022 62.5 ± 5.2 29.2 ± 0.4
3 9 0.272 ± 0.009 68.5 ± 3.2 28.2 ± 0.8
4 9 0.150 ± 0.004 33.3 ± 0.9 31.4 ± 0.7
5 9 0.220 ± 0.007 52.9 ± 1.7 28.5 ± 0.2
Среднее по эксперименту N = 45) 0.216 ± 0.011 49.8 ± 2.6 29.3 ± 0.3
Однородность распределения ANOVA, Р < 0.001 < 0.001 0.002
Суммарное содержание в помете, % от введенной дозы 1.94 ± 0.29
Примечание. Доза НЧ - 2.11 мг/кг массы тела самки. *Средние значения, M ± т.
гематоэнцефалический барьер, вызывая развитие признаков окислительного стресса в различных отделах головного мозга. Показано генотоксическое действие НЧ серебра, введенного внутрибрюшинно в дозе около 1 мг/кг массы тела мышей [13]. Интерпретацию результатов данной работы затрудняло присутствие в препарате НЧ токсичного ПАВ - ди-октилсульфосукцината натрия. Установлено наличие ингаляционной токсичности НЧ серебра для крыс [14, 15]. При 28-дневном пероральном введении этого наноматериала в дозе до 30 мг/кг массы тела крысам не наблюдали признаков общетоксического и генотоксического действия, хотя НЧ серебра и накапливались в почках и печени животных [29]. Значительно более высокие дозы наночастиц серебра (вплоть до 1000 мг/кг массы тела), вводимые перорально, приводили к появлению определенных биохимических и гистопатологических сдвигов, что свидетельствовало о токсичности [8, 29].
В связи с токсическими свойствами НЧ серебра важно было оценить вероятность проявления токсичности у потомства животных, подвергающегося экспонированию этим веществом в результате трансплацентарного переноса или с молоком. Определенный интерес представляют данные о цитотоксичности НЧ серебра in vitro, полученные в условиях, когда точно известна концентрация НЧ. Так, показано, что НЧ серебра в концентрации 5-50 мкг/см3 повреждают культивируемые гепатоциты линии BRL3A крысы [30]. В опытах на сперматогониаль-ных клетках крысы цитотоксическое действие НЧ
серебра, идентифицируемое по высвобождению лак-татдегидрогеназы и в тетразолиевом митохондриальном тесте, проявлялось, начиная с концентрации 5 мкг/см3 [31]. Наблюдали также стимуляцию апопто-за фибробластов мыши (с использованием теста активности каспазы-3) при концентрации НЧ серебра не менее 3.12 мкг/см3 [32]. НЧ серебра в концентрации не менее 10 мкг/см3 нарушали проводимость для ионов Па+ в культуре нейронов гиппокампа линии СА-1 [33]. В опытах на мононуклеарных клетках периферической крови человека [34] показано, что НЧ серебра в концентрации 3 мкг/см3 и более стимулируют продукцию фактора некроза опухолей-а. Начиная с концентрации 15 мкг/см3, отмечалось выраженное цитотоксическое действие НЧ серебра. Согласно [35] НЧ серебра, покрытые ПВП или цитратом, способны влиять на дифференцировку клеток феохромоцито-мы РС12, имеющих нейроэндокринную природу. Минимальная действующая концентрация НЧ составляла 3 мкМ по серебру (около 0.3 мкг/см3). Наконец, охарактеризовано действие НЧ серебра различного размера в первичной культуре нейронов коры головного мозга крысы [36]. Показано статистически значимое увеличение гибели клеток, культивируемых в течение 14 дней при минимальной концентрации НЧ размером 20 нм, равной 5 мкг/см3 и более. Токсичность НЧ снижалась при уменьшении их размера, так что НЧ диаметром более 40 нм были цитотоксич-ными, только начиная с концентрации 10 мкг/см3.
Сравнение приведенных выше данных с результатами нашей работы позволяет утверждать, что кон-
центрации НЧ серебра в плодах крыс (не более 50 нг/г ткани при вводимой дозе НМ около 2 мг/кг массы тела, табл. 1) были в 60-300 раз ниже минимальных действующих концентраций НЧ, выявленных в системах in vitro. Однако такая оценка не учитывает возможность неоднородного распределения НЧ по органам и тканям плода. Известно, что НЧ серебра накапливаются преимущественно в почках и печени [20, 25]. Если предположить, что весь наноматериал накапливается только в одном из этих органов, масса которого на данном сроке гестации составляет 6.0 и 0.9% от массы плода, то получим заведомо завышенную концентрацию НЧ в органах - 830 и 5000 нг/г в печени и почках соответственно. Последняя величина сопоставима с определенной in vitro нижней границей возможного цитотоксического действия, равной приблизительно 3000-5000 нг/г. При этом следует учитывать, что вводимая беременным самкам крыс доза наноматериала, составлявшая «2 мг/кг массы тела, была агравирована в 2000 раз по сравнению с верхним допустимым уровнем потребления серебра в любой форме (как в виде коллоидных частиц, так и ионов), равной 70 мкг или около
1 мкг/кг массы тела человека. Отсюда можно сделать вывод, что уровень накопления НЧ серебра в органах плодов крыс может с определенными оговорками рассматриваться как безопасный в случае поступления наночастиц серебра внутрь в физиологических количествах (например, вместе с питьевой водой или БАД к пище).
У крысят, получающих молочное вскармливание, средний уровень меченых НЧ составил 50 нг/г. Эта величина на 75% обусловлена меткой, находящейся в ЖКТ. Содержание НЧ в печени составляет 17.9%, а в почках - 0.9% от общего количества, обнаруженного в крысенке. Масса органов при данном сроке развития равна в среднем 3.8 и 1.2% массы тела, откуда следует, что концентрация НЧ в них составляет около 235 и 38 нг/г соответственно. Эти величины значительно ниже предполагаемого уровня цитотоксиче-ского воздействия и свидетельствуют о безопасности приема НЧ лактирующими самками в вышеуказанной заведомо агравированной дозе для развития потомства.
Таким образом, на основании опубликованных данных можно сделать вывод, что уровни НЧ в тканях плодов и крысят, выявленные при однократном введении НЧ самкам крыс, не могут рассматриваться как опасные. В то же время необходимо учитывать, во-первых, возможность накопления НЧ в организме при их многократном поступлении, следовательно, уровень НЧ в органах и тканях будет выше, чем при однократной внутрижелудочной экспозиции, а во-вторых, неполное соответствие условий экспери-
Таблица 4. Межорганное распределение [110тАд]-наночастиц серебра в организме крысят (Ы = 4) через 48 ч после внутрижелудочного введения меченого препарата самкам
Органы и ткани Общее содержание наночастиц в крысенке, M ± m
% от обнаруженного количества % от дозы, скормленной самке
ЖКТ 73.8 ± 4.4 0.106 ± 0.006
Каркас 7.4 ± 1.4 0.0125 ± 0.0011
Печень 17.9 ± 3.0 0.0287 ± 0.0033
Почки 0.90 ± 0.18 0.0014 ± 0.0003
ментов in vitro и в организме. В частности, длительность экспозиции НЧ в клеточных культурах составляет часы, реже - до 7-14 дней, тогда как in vivo их воздействие может продолжаться в течение всей жизни. Поэтому изучение репродуктивной токсичности должно быть рекомендовано при комплексной оценке безопасности новых видов НЧ и НМ. Перенос НЧ через плаценту и грудное молоко следует учитывать при разработке процедур, направленных на максимальное ограничение контакта организма женщины с НЧ и НМ в период беременности и лактации.
ВЫВОДЫ
1. Обнаружено, что при введении меченых изотопов n°mAg НЧ серебра в желудочно-кишечный тракт беременных и лактирующих самок крыс в дозе около
2 мг/кг массы тела, [“'’^^^-НЧ проникает через плаценту и поступает в материнское молоко в количествах, в 100-1000 раз превышающих чувствительность использованного аналитического метода.
2. Средний уровень накопления НЧ в плодах составлял 0.085-0.147% от введенной дозы, что было сопоставимо с аккумуляцией в печени самок (0.3-0.5% от введенной дозы), и, как минимум, в 10-100 раз превосходил проникновение НЧ через гематоэнцефа-лический барьер в головной мозг самок (3.5 х 10-3 %).
3. У лактирующих самок суммарное поступление [п°тд^]_НЧ в молоко составляло не менее 1.94 ± 0.29% от введенной дозы за 48 ч лактации; не менее 25% этого количества всасывалось в пищеварительном тракте крысят.
4. При введении НЧ серебра самкам крыс в дозе, агравированной в 2000 раз по сравнению с адекват-
ным уровнем потребления этого микроэлемента, максимальные уровни этих НЧ выявлены в почках плодов, где они не были существенно больше токсических концентраций, установленных в опытах in vitro; в остальных случаях уровни НЧ были намного меньше действующих концентраций. Однако, учитывая возможные эффекты накопления НЧ в органах и тканях потомства при их длительном поступлении в материнский организм, рекомендуется изучение
репродуктивной токсичности НЧ при комплексной оценке их безопасности.
Таким образом, впервые получены экспериментальные доказательства переноса НЧ серебра от матери к потомству через плаценту и с грудным молоком.
Авторы выражают искреннюю благодарность
С.А. Хотимченко за полезное обсуждение результатов работы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Верников В.М., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. // Вопр. питания. 2009. Т. 78. № 6. С. 13-20.
2. Blaser S.A., Scheringer M., Macleod M., Hungerbflhler K. // Sci. Total Environ. 2008. V. 390. № 2-3. P. 396-409.
3. Fayaz M.A., Ao Z., Girilal M., Chen L., Xiao X., Kalaichelvan PT., Yao X. // Int. J. Nanomedicine. 2012. V. 7. P 5007-5018.
4. Acosta-Torres L.S., Mendieta I., Nunez-Anita R.E., Cajero-Juarez M., Castano V.M. // Int. J. Nanomedicine. 2012. V. 7.
P. 4777-4786.
5. Bhol K.C., Schechter PJ. // Dig. Dis. Sci. 2007. V. 52. № 10.
P. 2732-2742.
6. Chrastina A., Schnitzer J.E. //Int. J. Nanomedicine. 2010. V. 5. P. 653-659.
7. Шумакова А.А., Смирнова В.В., Тананова О.Н., Трушина Э.Н., Кравченко Л.В., Аксенов И.В., Селифанов А.В., Сото Х.С., Кузнецова Г.Г., Булахов А.В. и др. // Вопр. питания.
2011. Т. 80. № 6. С. 9-18.
8. Kim Y.S., Song M.Y., Park J.D., Song K.S., Ryu H.R., Chung Y.H., Chang H.K., Lee J.H., Oh K.H., Kelman B.J., et al. // Part Fibre Toxicol. 2010. V. 7. № 1. P. 20.
9. Wijnhoven S.W.P, Peijnenburg W.J.G.M., Herberts
C.A., Hagens W.I., Oomen A.G., Heugens E.H.W., Roszek
B., Bisschops J., Gosens I., Van De Meent D., et al. // Nanotoxicology. 2009. V. 3. № 2. P. 109-138.
10. Онищенко Г.Г., Арчаков А.И., Бессонов В.В., Бокитько Б.Г., Гинцбург А.Л., Гмошинский И.В., Григорьев А.И., Измеров Н.Ф., Кирпичников М.П., Народицкий Б.С. и др. // Гигиена и санитария. 2007. № 6. С. 3-10.
11. Онищенко Г.Г., Тутельян В.А. // Вопр. питания. 2007. Т. 76. № 6. С. 4-8.
12. Rahman M.F., Wang J., Patterson T.A., Sainia U.T., Robin-sonb B.L., Newporta G.D., Murdockc R.C., Schlagerc J.J., Hus-sainc S.M., Alia S.F. // Toxicol. Lett. 2009. V. 187. № 1. P. 15-21.
13. Орджоникидзе К.Г., Рамайя Л.К., Егорова Е.М., Рубанович
А.В. // Acta Naturae. 2009. Т. 1. № 3. С. 99-101.
14. Sung J.H., Ji J.H., Yoon J.U., Kim D.S., Song M.Y., Jeong J., Han B.S., Han J.H., Chung Y.H., Kim J. // Inhal. Toxicol. 2008. V. 20. № 6. P. 567-574.
15. Jung J.H., Kim S.S., Yoon J.U., Park J.D., Choi B.S., Chung Y.H., Kwon I.H., Jeong J., Han B.S. // Inhal. Toxicol. 2007. V. 19. № 10. P. 857-871.
16. Oberdorster G., Maynard A., Donaldson K., Castranova V., Fitzpatrick J., Ausman K., Carter J., Karn B., Kreyling W., Lai
D., et al. // Part. Fibre Toxicol. 2005. V. 2. № 1. P. 8-43.
17. Yokel R.A., MacPhail R.C. // J. Occupational Med. Toxicol.
2011. V. 6. № 7. P 1-27.
18. Распопов Р.В., Гмошинский И.В., Попов К.И., Красноярова О.В., Хотимченко С.А. // Вопр. питания. 2012. Т. 81. № 2. С. 10-17.
19. Tiede K., Boxall A.B., Tear S.P., Lewis J., David H., Hassellov M. // Food Add. Contam. 2008. V. 25. № 7. P. 795-821.
20. Бузулуков Ю.П., Гмошинский И.В., Распопов РВ., Демин
B.Ф., Соловьев В.Ю., Кузьмин П.Г., Шафеев Г.А., Хотимченко С.А. // Мед. радиология и радиационная безопасность. 2012. Т. 57. № 3. С. 5-12.
21. Тышко Н.В., Жминченко В.М., Пашорина В.А., Селяскин К.Е., Мельник Е.А., Мустафина О.К., Сото С.Х., Трушина
Э.Н., Гаппаров М.М.Г. // Вопр. питания. 2011. Т. 80. № 5.
C. 30-38.
22. База ядерных данных МАГАТЭ: www.iaea.org/Our Work/ Nuclear Data Service.
23. Исаев А.Г., Бабенко В.В., Казимиров А.С., Гришин С.И., Иевлев С.М. // Пробл. безпеки атомних електростанцш I Чорнобиля. Киев: НПП «АтомКомплексПрибор», 2010. № 13. С. 103-110.
24. Lochamy J.C. The Minimum Detectable Activity Concept. EG&G ORTEC Systems Application Studies, PSD № 17, September 1981.
25. Loeschner K., Hadrup N., Qvortrup K., Larse A., Gao X., Vogel U., Mortensen A., Lam H.R., Larsen E.H. // Part. Fibre Toxicol. 2011. V. 8. P. 1-18.
26. Yang H., Sun C., Fan Z., Tian X., Yan L., Du L., Liu Y., Chen
C., Liang X., Anderson G.J., et al. // Sci. Repts. 2012. V. 2. № 11. P. 847-855.
27. Chu M., Wu Q., Yang H., Yuan R., Hou S., Yang Y., Zou Y., Xu S., Xu K., Ji A., et al. // Small. 2010. V. 6. № 5. P. 670-678.
28. Cartwright L., Poulsen M.S., Nielsen H.M., Pojana G., Knudsen L.E., Saunders M., Rytting E. // Int. J. Nanomedicine.
2012. V. 7. P. 497-510.
29. Kim Y.S., Kim J.S., Cho H.S., Rha D.S., Kim J.M., Park J.D., Choi B.S., Lim R., Chang H.K., Chung Y.H., et al. // Inhal. Toxicol. 2008. V. 20. № 6. P. 575-583.
30. Hussain S.M., Hess K.L., Gearhart J.M., Geiss K.T., Schlager J.J. // Toxicol. in vitro. 2005. V. 19. № 7. Р 975-983
31. Braydich-Stolle L., Hussain S., Schlager J.J., Hofmann M.C. // Toxicol. Sci. 2005. V. 88. № 2. P. 412-419.
32. Arora S., Jain J., Rajwade J.M., Paknikar K.M. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2009. V. 236. № 3. P. 310-318.
33. Liu Z., Ren G., Zhang T., Yang Z. // Toxicology. 2009. V. 264. № 3. P. 179-184.
34. Shin S.H., Ye M.K., Kim H.S., Kang H.S. // Int. Immunopharmacol. 2007. V. 7. № 13. P 1813-1818.
35. Powers C.M., Badireddy A.R., Ryde I.T., Seidler F.J., Slotkin T.A. // Environ. Health Perspect. 2011. V. 119. № 1. P. 37-44.
36. Haase A., Rott S., Mantion A., Graf P., Plendl J., Thflnemann A.F., Meier W.P,. Taubert A., Luch A., Reiser G. // Toxicol. Sci.
2012. V. 126. № 2. P. 457-468.
