CC BY
107
Патогенез, патология и экономический ущерб
УДК 616:616.995.121.56-092
ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В ПЕЧЕНИ И ЛЕГКИХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ЭХИНОКОККОЗЕ
А.Ш. ГЕВОРГЯН кандидат биологических наук
Институт Зоологии НЦЗ и ГЭ НАН Армении, e-mail: has_gevorgyan@yahoo. com
Продукты липидной пероксидации играют важную роль в прогрессировании патологического состояния при многих болезнях. Для выявления уровня продуктов пероксидации использованы ферментативная и неферментативная системы окисления. Показано увеличение содержания перекисей и гидроперекисей в зараженной ткани печени и легких крупного и мелкого рогатого скота, что свидетельствует о том, что механизмы нарушения липидного состава мембран имеют место при эхинококкозе, и возможно при других паразитарных болезнях.
Ключевые слова: эхинококкоз, печень, легкие, перекис-ное окисление липидов, НАДФН- и аскорбат зависимые системы.
Значительная роль в патогенезе метаболических и структурных состояний при целом ряде патологических нарушений отводится интенсификации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в клеточных мембранах и мембранах субклеточных структур. Особенностью липидов, в частности, фосфолипидов является наличие в них большого числа двойных связей, что обусловливает легкое образование перекисей [4, 6].
Процессы ПОЛ являются следствием неакцепторной функции молекулярного кислорода, непосредственно взаимодействующего с метаболитами. Такие процессы возможны в том случае, когда кислород активирован или когда окисляемое соеднинение является радикалом, то есть имеет неспаренный электрон и вследствие этого обладает высокой реакционной способностью. Радикалы постоянно образуются при воздействии на клетку различных неблагоприятных факторов, по причине чего ПОЛ является процессом, постоянно конкурирующим с типичной для биологических тканей ферментативной окислительной реакцией дегидрирования. В результате образуются перекиси, а сам процесс приобретает цепной самоускоряющийся характер, так как сопровождается образованием свободных радикалов [1, 9]. Чем выше степень насыщенности жирных кислот и температура среды, тем активнее идет процесс ПОЛ. В живых тканях в норме непрерывно происходит спонтанное свободно радикальное окисление с образованием перекиси и других продуктов окисления. Однако в нормально функционирующих тканях интенсивность свободно радикального окисления и уровень эндогенных перекисей липидов удерживается на сравнительно низком уровне, который зависит от концентрации в тканях субстрата ненасыщеных жирных кислот, кислорода [7], катализаторов белковой и небелковой природы [3].
В нормальных физиологических условиях перекиси липидов принимают участие в синтезе биологически активных веществ: простагландинов, стеро-
идных гормонов, выступая вместе с тем также в роли эффекторов некоторых ферментативных реакций. Низкий уровень перекисей в тканях в норме объясняется тем, что в них хорошо сбалансированы реакции образования и расходования пероксидов и окисление липидов протекает на определенном стационарном уровне. При развитии патологичеких состояний такой баланс нарушается, образующиеся перекиси накапливаются в тканях, что приводит к серьезным повреждениям биомембран. Продукты перекисного окисления, как первичные (коньюгированные диены, перекиси, кетоны), так и вторичные (эпоксиды, гликоальдегиды, малоновый диальдегид), обладают выраженным токсическим эффектом [2]. Промежуточный продукт окислительного распада ненасыщенных жирных кислот - малоновый диальдегид, реагирует с -NH2 группами аспарагиновой кислоты в молекуле бычьего альбумина, с лизином, тирозином, метионином и аргинином. Липоперекиси окисляют также SH-группы на первом этапе до -S-S-групп, вплоть до образования сульфонов. Перекиси липидов вызывают полимеризацию ферментов (цитохрома и рибо-нуклеазы), а также оказывают разрушительное действие не только на узловые ферменты гликолиза и трикарбонового цикла в дыхательной цепи, но и на основное макроэргическое соединение организма - АТФ [8, 12]. Ингибиторами процесса (антиоксидантами) являются содержащиеся в тканях токоферолы (витамин Е), убихиноны, стероидные гормоны, соединения селена, низкомолекулярные тиолы содержащие аминокислоты, тироксин, серотонин и ряд других веществ. Fe2+, аскорбиновая кислота и др., в зависимости от концентрации и pH ткани, могут выступать в роли как прооксидантов, так и ан-тиоксидантов[10].
Материалы и методы
Для биохимических исследований с целью определения гидроперекисей и малонового диальдегида (МДА) использовали материал (кусочки печени и легких) как от здорового, так и от зараженного эхинококками крупного и мелкого рогатого скота. Всего было собрано 64 образца. Инкубационная смесь объемом 1 мл состояла из следующих компонентов: трис^О-буфер 40 Мм (рН = 7,4), Fe(NH4b(So4)2-6H2O12 х 10-6M, аскорбат 0,8 мМ (в случае неферментативного переокисления) и Fe(NH4)2(So4)2^6H2O12 х Na4P2O710H2O2 х 10M и восстановленного НАДф.Н 1Мм (в случае ферментативного). Инкубацию проводили в водяной бане с механической мешалкой при 37 °C в течение часа. Реакцию останавливали добавлением ТХУ. После центрифугирования в течение 10 мин (3000 об/мин) осадок удаляли.
При определении гидроперекисей надосадочную жидкость смешивали с 13,5 мл этилового спирта, 0,1мл концентрированной HCl и 0,02 мл 5%-ного раствора соли Мора (перекристаллизованного из 3%-ного раствора HCl). Через 30 с после встряхивания добавляли 0,5 мл 20%-ного раствора перекристаллизованного тиоционата аммония и проводили спектрофотометрирова-ние (СФ-26) при длине волны 480 нм.
Метод определения МДА основан на цветной реакции взаимодействия МДА с ТБК, протекающей при высокой темпреатуре и кислом рН с образованием окрашенного триметилового комплекса, содержащего одну молекулу МДА и две ТБК.
Надосадочную жидкость смешивали с 0,2 мл 0,6 н HCl и 0,8 мл 0,12 М ТБК. Смесь нагревали при 100 °C в течение 10 мин. Интенсивность окраски измеряли спектрофотометром (СФ-26) при длине волны 535 нм. Количество МДА пересчитывали на 1мг белка данной фракции. Белок определяли по методу Лоури. Поскольку данные биохимических показателей варьировали, после проверки нормальности распределения, использовали параметрический t критерий Стьюдента [5].
Результаты и обсуждение
Изучению окислительных процессов липидов мембран в настоящее время уделяется наибольшее внимание. Это обусловлено большим арсеналом научной информации о вредоносном действии продуктов липидной перокси-дации на морфо-функциональные свойства биологических мембран и, главым образом, на функцию трансмембранного переноса веществ. Нарушение физико-химических свойств биологических мембран обусловлено преимущественными срывами в устойчивости липид-белковых комплексов этих образований, что вызывает инактивацию мембрансвязанных липидзависимых ферментов и, следовательно, изменение всего метаболического статуса клетки. Предпринятое нами изучение закономерностей динамики ПОЛ в печени и легких крупного и мелкого рогатого скота подтверждает существование в интактном организме определенного стационарного уровня перекисей. Пере-кисное окисление изучали в ферментативной (НАДФ.Н-зависимой) и неферментативной (аскорбат-зависимой) системах окисления. Ферментативная НАДФ.Н-зависимая система ПОЛ использует в качестве донора редуцирующих эквивалентов восстановленный никотинамиддинуклеотид фосфат. Эта система ингибируется нагреванием, парахлормеркурийбензоатом и различными субстратами гидроксилирования. Неферментативная аскорбат-зависимая система переокисления использует в качестве восстановителя аскорбиновую кислоту и другие соединения с подходящим редокс-потенциалом (глутатион, цистеин), не чувствительных к сульфгидрильным ядам. Аскорбат-зависимая система переокисления специфична не только для эндоплазматического ретикулума, она также протекает и в мембранах других органелл - митохондрий, ядер, лизосом. Большинство биомембран клеток имеет полный набор кофакторов и субстратов, необходимых для инициации и протекания свободнорадикального окисления липидов [11].
В наших исследованиях изучение ПОЛ в печени и легких крупного и мелкого рогатого скота позволило обнаружить увеличение содержания гидроперекисей и перекисей при эхинококкозе (табл. 1-4).
1. Содержание гидроперекисей и перекисей в легочной ткани крупного рогатого скота в норме и при эхинококкозе (п = 8)_
Система окисления Содержание гидроперекисей (Е/мг белка) и перекисей (мда/мг белка) в легочной ткани животных
незараженных зараженных E. granulosus
Гидроперекиси
Аскорбат-зависимое переокисление 0,250±0,04 0,448±0,03 Р < 0,001
НАДФН-зависимое переокосление 0,226±0,02 0,410±0,03 Р < 0,001
Перекиси
Аскорбат-зависимое переокисление 3,12±0,22 6,32±0,25 Р < 0,001
НАДФН-зависимое переокосление 2,88±0,15 5,85±0,32 Р < 0,001
Первичный механизм зарождения свободных радикалов при эхинококко-зе остается не до конца установленным, однако, в литературе имеются указания относительно существования в патологически измененной ткани определенных факторов, оказывающих стимулирующее влияние на течение реакций радикалообразования.
2. Содержание гидроперекисей и перекисей в печеночной ткани крупного _рогатого скота в норме и при эхинококкозе (п = 8)_
Система окисления Содержание гидроперекисей (Е/мг белка) и перекисей (мда/мг белка) в печеночной ткани животных
незараженных зараженных E. granulosus
Гидроперекиси
Аскорбат-зависимое переокисление 0,398±0,03 0,547±0,05 Р < 0,001
НАДФН-зависимое переокосление 0,297±0,04 0,463±0,03 Р < 0,001
Перекиси
Аскорбат-зависимое переокисление 4,16±0,32 7,22±0,41 Р < 0,001
НАДФН-зависимое переокосление 3,02±0,43 5,66±0,33 Р < 0,001
3. Содержание гидроперекисей и перекисей в легочной ткани мелкого рогато_го скота в норме и при эхинококкозе (п = 8)_
Вид переокисления Содержание гидроперекисей (Е/мг белка) и перекисей (мда/мг белка) в легочной ткани животных
незараженных зараженных E. granulosus
Гидроперекиси
Аскорбат-зависимое переокисление 0,233±0,02 Р < 0,001 0,380±0,018 Р < 0,001
НАДФН-зависимое переокосление 0,267±0,04 Р < 0,001 0,438±0,03 Р < 0,001
Перекиси
Аскорбат-зависимое переокисление 3,48±0,32 Р < 0,001 7,0±0,25 Р < 0,001
НАДФН-зависимое переокосление 2,53±0,3 Р < 0,005 4,68±0,15 Р < 0,001
4. Содержание гидроперекисей и перекисей в печеночной ткани мелкого ро-_гатого скота в норме и при эхинококкозе (п=8)_
Вид переокисления Содержание гидроперекисей (Е/мг белка) и перекисей (мда/мг белка) в печеночной ткани животных
незараженных зараженных E. granulosus
Гидроперекиси
Аскорбат-зависимое переокисление 0,345±0,04 Р < 0,001 0,523±0,035 Р < 0,002
НАДФН-зависимое переокосление 0,300±0,025 Р < 0,001 0,498±0,03 Р < 0,001
Перекиси
Аскорбат-зависимое переокисление 3,88±0,25 Р < 0,002 6,86±0,3 Р < 0,001
НАДФН-зависимое переокосление 2,9±0,23 Р < 0,002 5,38±0,19 Р < 0,001
Известно, что при эхинококкозе, вследствие сдавливания печени и легких эхинококковыми пузырями, развивается гипоксия. При гипоксии из-за нарушения доставки кислорода к органам наблюдают накопление супероксидного и гидроксильных радикалов. Гидроксильный радикал вступает в ре-
акции с ненасыщенными жирнокислотными остатками фосфолипидов мембран, что приводит к активации ПОЛ. Основой всех модифицирующих или повреждающих эффектов ПОЛ в мембране является реакция ненасыщенных жирнокислотных остатков фосфатидилэтаноламина, фосфатидилхолина, фосфатидилсерина и других фосфолипидов липидного бислоя с активными формами кислорода. В результате данной реакции в молекулах фосфолипи-дов, содержащих во втором положении жирную кислоту, появляется полярная гидроперекисная группировка. Продукты распада гидроперекисей фос-фолипидов взаимодействуют со свободными аминогруппами мембранных белков, образуя межмолекулярные сшивки и инактивируя эти белки.
Известно, что скорость перекисных реакций зависит от активности внутриклеточных ферментных систем, участвующих в разложении продуктов ПОЛ. Причиной активации ПОЛ может быть усиление активности систем, генерирующих липоперекиси, повышение содержания инициаторов и субстратов перекисного окисления, снижение уровня биоантиоксидантов, а также активности антирадикальных ферментов. Последнее влечет за собой развитие синдрома переоксидации и перекисного повреждения мембран.
Таким образом, можно заключить, что эхинококкоз сопровождается физико-химическими нарушениями в функции мембран. В наших исследованиях изучение процессов перекисного окисления при эхинококкозе в печени и легких крупного и мелкого рогатого скота позволило обнаружить увеличение содержания гидроперекисей и перекисей почти в 1,5 раза. С учетом современных представлений можно сказать, что центральным звеном патохимиче-ских нарушений при развитии эхинококковой кисты является некомпенсированное нарастание процессов ПОЛ с последующими нарушениями липидного состава биомембран, изменением активности ключевых ферментов, путей метаболизма и угнетением ферментных систем, ответственных за процессы нормального функционирования клеток.
Литература
1. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И., Козлов А.Б. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники. - М.: ВИНИТИ, 1991. -Т. 29. - С. 126-130.
2. Дубинина Е.Е., Шугалей И.В. Окислительная модификация белков // Успехи соврем. биол. - М., 1993. - Т. 113, Вып. 1. - С. 71-81.
3. Жижина Г.П., Блюхтерова Н.В. Изменение уровня эндогенного окисления ДНК с помощью ионов металлов и ксенобиотиков // Биохимия. - М., 1997. - Т. 62, Вып. 1. - С. 103-110.
4. Зиямутдинова З.Г., Холмухаменова Н.М. Изменение процесса пере-кисного окисления липидов и содержание индивидуальных фосфолипидов в печени крыс с токсическим экспериментальным гепатитом // Вопр. мед. химии. - М., 1990. - № 5. - С. 16-19.
5. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Наука, 1973. - 343 с.
6. Ланкин В.З.,Тихазе А.К.,Беленков Ю.Н. Свободные радикалы в норме и при заболеваниях сердечно-сосудистой системы. - М.: Наука, 2000. - 121 с.
7. Осипов А.Н., Азизова О.А., Владимиров Ю.А. Активные формы кислорода и их роль в организме // Успехи биол. химии. - 1990. - Т. 31. - С.180.
8. Шаблина И.Г., Колосова Н.Г., Гришанова А.Ю. и др. Активность окислительного фосфорилирования Бо F1- Атф-азы и содержание цитохро-мов митохондрий печени крыс с врожденным повышением способности ра-дикалообразования // Биохимия. - 1995. - Т. 60, Вып. 12. - С. 2045-2052.
9. Шумаев К.Б., Руге Э.К., Димитровский А.А. Влияние антиоксидантов и продуктов перекисного окисления липидов на образование радикала пробу-кола в липопротеидах низкой плотности // Биохимия. - 1997. - T. 62, Вып. 6. - С. 769-773.
10. Fu X., Tian H., Sheng Z. Multiple organ injuries after abdominal high en-ery wounding in animals and the protective effect of antioxidants // J. Clin. Med. Sci. - 1992. - № 7. - P. 86-91.
11. Sharabani M., Plotkinn B., Aviram J. Lipid peroxidation in rat blood cell membranes // Cell and Mol. Biol. - 1984. - V. 30, №4. - P. 329-336.
12. Wu E., Smith M.T., Bellomo G. Relationship between the mitochondrial transmembrane potential ATF concentration and cytotoxity in isolated rat hepato-cytes // Arch. Biochem. Biophis. - 1990. - № 282. - P. 358-362.
Lipid peroxidation in liver und lung of livestock at echinococcosis
H.Sh. Gevorgyan
Products of lipid peroxidation play significant role in the progression of pathological condition in the course of many diseases. To identify the level of peroxida-tion products fermentative and non-fermentative peroxidation systems were used. The increase of peroxides and hydroperoxides concentration in the affected tissue of livestock' liver and lungs was showed. Registered data on peroxides and hydroperoxides increment indicates that disorders in lipid composition of membranes occur in the course of echinococcosis and possibly during other parasitic diseases.
Keywords: echinococcosis, liver, lungs, lipids peroxidation, NADF.H- and ascorbate-dependent systems.
