CC BY
172
УДК 577.125:616.379-008.64-02:547.854.6-092.9:599.323.4
ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ И СИСТЕМА ГЛУТАТИОНА В ЖИРОВОЙ ТКАНИ КРЫС С АЛЛОКСАНОВЫМ ДИАБЕТОМ
Владимир Владимирович ИВАНОВ, Евгения Викторовна ШАхРИСТОВА, Елена Алексеевна СТЕПОВАЯ, Татьяна Васильевна ЖАВОРОНОК, Вячеслав Викторович НОВИЦКИЙ
ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава 634050, г. Томск, Московский тракт, 2
Проведено исследование перекисного окисления липидов и состояния системы глутатиона в эпидидимальной жировой ткани крыс с аллоксановым диабетом. Показано увеличение содержания гидроперекисей липидов и малонового диальдегида, снижение концентрации общего глутатиона и его фракций в жировой ткани крыс с экспериментальным диабетом. Уменьшение величины отношения восстановленной и окисленной форм трипептида, характеризующее редокс-состояние системы глутатиона в жировой ткани при аллоксановом диабете, сопровождается увеличением содержания продуктов липидной пероксидации и свидетельствует о развитии окислительного стресса.
Ключевые слова: жировая ткань, окислительный стресс, глутатион, аллоксановый диабет.
При сахарном диабете активируется пере-кисное окисление липидов (ПОЛ) с формированием окислительного стресса, сопровождающегося нарушением поглощения глюкозы жировой тканью, снижением секреции инсулина панкреатическими В-клетками, дизре-гуляцией выработки адипокинов, развитием инсулинорезистентности с последующим возникновением метаболического синдрома [1—4]. Аллоксан, применяемый в моделировании сахарного диабета, генерирует токсичные свободные радикалы, повреждающие В-клетки островков Лангерганса, клетки почек, печени, легких, а также адипоциты [5] и способствует активации ПОЛ.
Эпидидимальная жировая ткань характеризуется высоким содержанием общего глута-тиона, но низким редокс-состоянием и повышенной чувствительностью системы глутатиона к окислительному стрессу [6]. Глутатион в комплексе с глутатионпероксидазой и глутатион-редуктазой образует систему, обладающую антиперекисной активностью, играет важную роль в регуляции углеводного и липидного обмена. В настоящее время недостаточно изучено состояние ПОЛ и системы про- и антиоксидантов в жировой ткани при аллоксановом диабете. Поэтому целью настоящего исследования явилось изучение состояния ПОЛ и глутатион-зависимой системы антиоксидант-ной защиты в эпидидимальной жировой ткани крыс при развитии аллоксанового диабета.
Материалы и методы
Исследования проводили на 20 беспородных крысах-самцах массой 210 ± 25 г, которые были получены из ОАО Питомник «Рассвет» г. Томска. Содержание, питание, уход за крысами и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755). Методом случайной выборки животные были распределены на две группы: 12 крыс составили «контроль» и 8 — «опыт». В опытной группе экспериментальный диабет у крыс вызывали четырехкратной инъекцией аллоксана (90 мг/кг). В группе «контроль» животным вводили физиологический раствор с той же частотой и дозировкой, что и в опытной группе. Через 2 недели после введения аллоксана животных усыпляли СО2-асфиксией. В плазме крови определяли содержание глюкозы глюкозооксидаз-ным методом («Вектор», Россия), инсулина — твердофазным радиоиммунным методом. Об активности процессов ПОЛ в плазме крови и гомогенате эпидидимальной жировой ткани судили по содержанию гидроперекисей липидов, определяемых методом FOX-2 [7], и продуктов, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активные продукты), определяемых методом К. Yagi [8]. Состояние антиоксидант-ной защиты в плазме крови и эпидидимальной
Иванов В.В. — к.б.н., доцент кафедры биохимии и молекулярной биологии, e-mail: [email protected] Шахристова Е.В. — зав. лабораторией кафедры биохимии и молекулярной биологии, e-mail: [email protected] Степовая Е.А. — д.м.н., проф. кафедры биохимии и молекулярной биологии, e-mail: [email protected] Жаворонок Т.В. — к.м.н., доцент кафедры биохимии и молекулярной биологии, e-mail: [email protected] Новицкий В.В. — академик РАМН, зав. кафедрой патологической физиологии, e-mail: [email protected]
жировой ткани оценивали по содержанию общего, восстановленного и окисленного глутатиона, измеряемого циклическим методом M.E. Anderson [9], и активности глутатионпе-роксидазы, которую определяли по интенсивности окисления НАДФН [10].
Полученные результаты представлены в таблицах в виде медианы (Ме), верхнего и нижнего квартилей (Q1—Q3). Оценку соответствия выборки данных нормальному закону распределения проводили с помощью критерия Шапиро — Вилка. Достоверность различий средних величин оценивали с помощью непараметрического критерия Манна — Уитни. Различия считались достоверными при уровне значимости р < 0,05.
Результаты и обсуждение
Развитие диабета при введении аллоксана сопровождалось активацией ПОЛ и снижением редокс-состояния системы глутатиона в плазме крови. Через две недели после окончания курса введения аллоксана концентрация инсулина в плазме крови крыс с аллоксановым диабетом снижалась в 2,8 раза (р < 0,05) и составляла 9,2 (7,6—10,9) мкЕд/мл (в контроле 25,5 (22,3— 28,2) мкЕд/мл). Это является результатом селективного поглощения В-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы аллоксана, который в результате превращения в диалуровую кислоту генерирует свободные радикалы и способствует наработке активных форм кислорода, вызывающих разрывы ДНК и гибель инсулин-секретирующих клеток [5]. Снижение секреции инсулина приводило к стойкой гипергликемии, характеризующейся повышением концентрации
глюкозы в крови крыс с аллоксановым диабетом в 3,7 раза (р< 0,01) по сравнению с контрольными величинами и составляло 20,2 (18,9—24,2) ммоль/л (в контроле 5,5 (4,7—5,9) ммоль/л).
Развитие экспериментального аллоксано-вого диабета у крыс сопровождалось увеличением содержания в плазме крови продуктов липидной пероксидации и уменьшением антиоксидантного потенциала системы глута-тиона (табл. 1). Это выражалось в снижении общей концентрации трипептида и соотношения восстановленной и окисленной форм глу-татиона. Формирование окислительного стресса и снижение антиоксидантного потенциала широко описаны в литературе на различных экспериментальных моделях диабета 1 и 2 типа и в клинических наблюдениях [1, 3, 11]. Однако остаются малоизученными при аллок-сановом диабете в адипоцитах процессы свободнорадикального окисления и состояние антиоксидантной защиты.
В ходе экспериментальных исследований нами было зарегистрировано в эпидидимальной жировой ткани крыс с аллоксановым диабетом повышение концентрации гидроперекисей липидов в 3,0 раза (р < 0,05) (табл. 2). Деградация первичных метаболитов ПОЛ приводит к накоплению вторичных и конечных продуктов свободнорадикального процесса. Установлено повышение содержания в 1,6 раза (р < 0,05) ТБК-активных продуктов в жировой ткани крыс с экспериментальным диабетом (табл. 2). Повышение содержания гидроперекисей липидов и ТБК-активных продуктов может быть следствием окисления ненасыщенных фосфо-
Таблица 1
Содержание гидроперекисей липидов, общего, восстановленного и окисленного глутатиона в плазме крови крыс с аллоксановым диабетом (Ме (QI—Q3))
Показатель Контроль (введение физиологического раствора), n = 12 Аллоксановый диабет, n = 8
Содержание гидроперекисей липидов, мкмоль/л 6,7 (4,926-7,902) 18,6* (13,213-24,145)
Содержание общего глутатиона, нмоль/мг белка 0,128 (0,118-0,135) 0,047* (0,039-0,070)
Содержание восстановленного глутатиона, нмоль/мг белка 0,117 (0,010-0,028) 0,038* (0,031-0,057)
Содержание окисленного глутатиона, нмоль/мг белка 0,011 (0,006-0,015) 0,009* (0,007-0,012)
Соотношение концентраций восстановленного и окисленного глутатиона 12,4 (6,8-17,4) 4,2* (2,8—5,6)
Примечание: здесь и в таблице 2 звездочкой обозначено достоверное (р < 0,05) отличие от величины соответствующего показателя в контроле.
Таблица 2
Содержание гидроперекисей липидов, ТБК-активных продуктов, общего, восстановленного и окисленного глутатиона, активность глутатионпероксидазы в жировой ткани крыс с аллоксановым диабетом (Ме (й—йц))
Показатель Контроль (введение физиологического раствора), n = 12 Аллоксановый диабет, n = 8
Содержание ТБК-активных продуктов, 51,44 82,83*
нмоль/мг белка (46,65-57,24) (73,81-92,34)
Содержание общего глутатиона, 4,23 2,24*
нмоль/мг белка (3,91-5,34) (1,89-2,51)
Содержание восстановленного глутатиона, 3,74 1,93*
нмоль/мг белка (3,42-4,34) (1,64-2,21)
Содержание окисленного глутатиона, 0,49 0,31*
нмоль/мг белка (0,45-0,62) (0,28-3,3)
Соотношение концентраций восстановленного 8,12 5,83*
и окисленного глутатиона (6,75-8,56) (5,24-6,75)
Активность глутатионпероксидазы, 20,13 44,41*
нмоль НАДФН/(мин х мг белка) (18,35-21,87) (42,25-45,79)
липидов в биологических мембранах адипоци-тов при действии аллоксана. Аллоксан известен как прооксидант, который способствует генерации свободных радикалов и активации ПОЛ [5].
Активация ПОЛ в жировой ткани крыс с аллоксановым диабетом приводила к снижению концентрации общего глутатиона в 2,7 раза, восстановленной формы трипептида в 3,0 раза, окисленной—в 1,2 раза по сравнению с контрольными величинами (р < 0,05) (табл. 2). При этом значительно снижалась величина отношения содержания восстановленного глута-тиона к содержанию окисленного, что свидетельствует о сокращении емкости редокс-потенциала глутатион-зависимой системы в жировой ткани крыс с аллоксановым диабетом. У этих крыс в жировой ткани одновременно регистрировался рост активности глутатионпероксидазы в 2,2 раза (р < 0,05) относительно контрольных величин (табл. 2). Высокая активность глута-тионпероксидазы, использующей восстановительный потенциал глутатиона, может способствовать снижению содержания глутатиона при чрезмерной продукции липопероксидов в условиях экспериментального диабета.
Известно, что в жировой ткани обнаруживается высокая концентрация ТБК-активных продуктов несмотря на повышенную активность глутатионпероксидазы и каталазы [6]. При активации липолиза, в том числе при сахарном диабете 1 типа, происходит накопление свободных жирных кислот, окисление которых способствует значительному увеличению продукции супероксидного анион-радикала в дыхательной цепи митохондрий [12, 13],
что приводит к активации ПОЛ и снижению редокс-потенциала системы глутатиона в клетках жировой ткани.
Заключение
При аллоксановом диабете, который является моделью сахарного диабета 1 типа, возникает окислительный стресс в жировой ткани, характеризующийся увеличением содержания в ней продуктов липидной пероксидации и нарушением тиолдисульфидного обмена. Активация ПОЛ и снижение антиоксидантного потенциала системы глутатиона в жировой ткани крыс при экспериментальном диабете может приводить к стимуляции спонтанного липолиза в адипоцитах и к возникновению инсулинорезистентности.
Список литературы
1. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З. и др. Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания. Новосибирск: АРТА, 2008. 284 с.
Menshchikova E.B., Zenkov N.K., Lankin V.Z. et al. Oxidative stress: pathological conditions and diseases. Novosibirsk: ARTA, 2008. 284 p.
2. Evans J.L., Goldfine I.D., Maddux B.A. et al. Are oxidative stress-activated signaling pathways mediators of insulin resistance and p-cell dysfunction? // Diabetes. 2003. 52. 1-8.
3. Furukawa S., Fujita T., Shimabukuro M. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome // Clin. Invest. 2004. 114. (12). 1752-1761.
4. Robertson R.P. Chronic oxidative stress as a central mechanism for glucose toxicity in pancreatic islet beta cells in diabetes // Biol. Chem. 2004. 279. 42351-42354.
5. Szkudelski T. The mechanism of alloxan end streptozotocin action in B cells of the rat pancreas // Physiol. Res. 2001. 50. 536-546.
6. Galinier A., Carriere A., Fernandez. Y. et al. Adipose tissue pro-adipogenic redox changes in obesity // Biol. Chem. 2006. 281. 12682-12687.
7. Hermes-Lima M., Willmore W.G., Storey K.B. Quantification of lipid peroxidation in tissue extracts based on Fe(III)xylenol orange complex formation // Free Radic. Biol. Med. 1995. 19. 271-280.
8. Yagi Y., Matsuda M., Yagi K. Formation of lipoperoxide in isolated sciatic nerve by chinoform-ferric chelate // Experementia. 1976. 32. (7). 905-906.
9. Anderson M.E. Determination of glutathione and glutathione sulfide in biological samples // Methods Enzymol. 1985. 113. 548-555.
10. Little C., O'Brien P.J. An intracellular GSH-peroxidase with a lipid peroxide substrate // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1968. 31. (2). 145-150.
11. Faure P. Protective effects of antioxidant micronutrients (vitamin E, zinc and selenium) in type 2 diabetes mellitus // Clin. Chem. Lab. Med. 2003. 41. 995-998.
12. Hickson-Bick D.L., Sparagna G.C., Buja L.M. et al. Palmitate-induced apoptosis in neonatal cardiomyocytes is not dependent on the generation of ROS // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2002. 282. 656-664.
13. Listenberger L.L., Han X., Lewis S.E. Triglyceride accumulation protects against fatty acid-induced lipotoxicity // Proc. Natl. Acad. Sci. 2003. 100. 3077-3082.
LIPID PEROXIDATION AND GLUTATHIONE SYSTEM IN ADIPOSE TISSUE OF RATS WITH ALLOXANIC DIABETES
Vladimir Vladimirovich IVANOV, Evgeniya Viktorovna SHAKHRISTOVA, Elena Alekseevna STEPOVAYA, Tat'yana Vasil'evna ZHAVORONOK, Vyacheslav Vikorovich NOVITSKY
Siberian State Medical University of Roszdrav
2, Moskovsky tract, Tomsk, 634050
The lipid peroxidation and glutathione system state in epididymal adipose tissue of rats with alloxanic diabetes has been analyzed. The increase of lipid hydro peroxides and malonic dialdehyde content, the decrease of content of total glutathione and its fractions in adipose tissue of rats with experimental diabetes has been revealed. The decrease of reduced-oxidized three-peptide forms ratio, which is the characteristic of glutathione system redox-state in adipose tissue under alloxanic diabetes, is accompanied with lipid peroxidation products content increase and attests to oxidative stress development.
Key words: adipose tissue, oxidative stress, glutathione, alloxanic diabetes.
Ivanov V.V. — candidate of biological sciences, professor assistant of the chair for biochemistry and molecular biology, e-mail: [email protected]
Shakhristova E.V. — head of the chair for biochemistry and molecular biology, e-mail: [email protected] Stepovaya E.A. — doctor of medical sciences, professor of the chair for biochemistry and molecular biology, e-mail: [email protected] Zhavoronok T.V. — candidate of medical sciences, professor assistant of the chair for biochemistry and molecular biology, e-mail: [email protected]
Novitsky V.V. — academician of RAMS, head of the chair for pathophysiology, e-mail: [email protected]
