Переход спираль-клубок в ДНК в присутствии денатурирующего агента Текст научной статьи по специальности «Физика»

УДК 544.232

ПЕРЕХОД СПИРАЛЬ-КЛУБОК В ДНК В ПРИСУТСТВИИ ДЕНАТУРИРУЮЩЕГО АГЕНТА

Е.В. Петровская, В.В. Василевская*^, А.Р. Хохлов

(.кафедра физики полимеров и кристаллов) E-mail: vvvas@ineos.ac.ru

Предложена теория перехода спираль-жлубож в растворах, содержащих денатурирующий спираль агент. Пожазано, что если переход спираль-жлубож индуцируется увеличением жонцентрации денатурирующего агента, то ширина жонформационного перехода сужается по мере усиления ажтивности агента. Напротив, если переход спираль-жлубож индуцируется изменением температуры, то введение денатурирующего агента приводит ж снижению резжости перехода спираль-жлубож тем более значительному, чем выше ажтивность денатурирующего агента. Результаты расчетов находятся в соответствии с литературными эжспериментальными данными.

Введение

Молекула ДНК представляет собой комплекс из двух закрученных относительно друг друга по-линуклеотидных цепочек, связанных между собой межмолекулярными силами. При повышении температуры взаимодействия между полинуклеотидными цепочками ослабляются, двойная спираль дестабилизируется и цепочки расходятся. Это явление называется плавлением, денатурацией ДНК, или переходом спираль-клубок. Схематически переход спираль — клубок изображен на рис. 1.

Для нуклеиновых кислот и синтетических по-линуклеотидов переход спираль-клубок происходит в определенной узкой температурной зоне, которая зависит от первичной последовательности ДНК и от ионной силы раствора [1, 2]. Кроме того, температуру плавления ДНК можно существенно снизить, если ввести в раствор вещества, обладающие сильными специфическими взаимодействиями с пу-рин-пиримидиновыми основаниями одиночной ДНК [3-5]. Такие вещества называются денатурирующими спираль агентами. Связываясь с одиночными нуклеотидными цепочками, денатурирующие агенты нарушают специфическую комплементарность цепей

ДНК и препятствуют образованию двойной спирали. Денатурирующими двойную спираль агентами являются производные нуклеозидов, наиболее активным из которых является пурин, а также кофеин, инозин, мочевина и фенол. При концентрации 0.3 М пиримидина и уридина температура перехода спираль-клубок снижается на 5°С, тимидина — на 5.5°С, а пурина — на 9°С [3]. Введение в раствор 0.25 М фенола приводит к падению температуры плавления полиадениновой кислоты на 4°С [3].

Если концентрация фенола в водно-солевом растворе, содержащем одиночные макромолекулы ДНК, становится настолько большой, что образуется эмульсия из капель фенола в воде, то одиночные ДНК объединяются в двойные ДНК, т.е. наблюдается обратный переход клубок-спираль, или рена-турация ДНК. Это связано с тем, что вследствие сильных специфических взаимодействий одноните-вые ДНК (оДНК) адсорбируются на поверхности капель фенола. Такое концентрирование приводит к значительному росту скорости реакции ренату-рации ДНК просто из-за значительного повышения концентрации оДНК в ограниченном объеме [6, 7]. Экспериментально было показано, что если в эмульсии вода-фенол присутствуют комплементарные

о

Рис. 1. Схематическое изображение перехода спираль-клубок в ДНК: (а) полностью спиральное состояние (низкая температура); (б) частично расплавленное состояние (температура в области перехода); (в) полностью расплавленное состояние с полностью разошедшимися нитями

Институт элементоорганических соединений им. А. Н. Несмеянова РАН.

однонитевые молекулы ДНК (оДНК), то именно на поверхности капель фенола, и только там, между ними идет реакция ренатурации [5].

Причиной концентрирования одиночных макромолекул ДНК на поверхности капель эмульсий фенола является амфифильный характер составляющих ее звеньев — гидрофильность еахаро-фоефат-ного остова и высокое сродство азотистых оснований А, Г, Т и Ц с фенолом вследствие специфических взаимодействий ароматических частей оснований ДНК с ароматическим кольцом фенола. Такое строение приводит к тому, что наиболее выгодным состоянием для звена является размещение на поверхности капель фенола, когда еахаро-фоефатный остов экспонирован в водную фазу, а основания — в фазу фенола. Следует отметить, что амфифильны-ми являются не только звенья ДНК, но и звенья многих аминокислотных остатков, формирующих макромолекулы белков.

Такой взгляд на строение мономерных звеньев позволил ввести новую двумерную классификацию аминокислот [8, 9], а также объяснить ряд особенностей поведения белковых макромолекул, в частности растворимость глобулярных белков [10, 11], формирование коллагеноподобных структур [12], причины стабилизации а-спирали [13].

Таким образом, исследование молекул ДНК в растворах, содержащих вещества с сильными специфическими взаимодействиями с азотистыми основаниями ДНК, является весьма важной и актуальной задачей. В настоящей работе в качестве первого шага мы рассмотрим случай, когда раствор ДНК содержит небольшое количество такого вещества. Вследствие специфических взаимодействий с этим веществом энергетический выигрыш спирального состояния растет и происходит плавление ДНК. В следующей статье мы рассмотрим растворы с высоким содержанием денатурирующих агентов, когда вследствие их избытка они образуют капли в водной фазе и конформационный переход спираль-клубок сопровождается адсорбцией и десорбцией макромолекулы на межфазных границах. Модель, принятая нами для расчетов, приведена в следующем разделе. Далее представлены результаты расчетов и их обсуждение.

Модель

Итак, в соответствии с поставленной задачей рассмотрим переход спираль-клубок в макромолекуле, помещенной в раствор, содержащий агент, дестабилизирующий двойную спираль. Предположим, что концентрация <р дестабилизирующего агента и тенденция его сегрегации с водой малы, так что молекулы дестабилизирующего агента не образуют отдельных фаз (капель) в растворе.

Пусть у нас имеется макромолекула, степень полимеризации которой равна N. Предположим, что эта макромолекула претерпевает переход епи-

раль-клубок и пусть Л^ ее мономерных звеньев находятся в клубковом состоянии, а остальные Л^ мономерных звена — в спиральном состоянии:

ЫХ+Щ = Ы. (1)

Эти звенья неравномерным образом разбросаны вдоль цепи и образуют области, содержащие клуб-ковые и спиральные участки (рис. 1). Обозначим через п число однотипных (спиральных или клуб-ковых) областей.

Энергетически клубковое и спиральное состояния различны. Обозначим через ¡\ свободную энергию, приходящуюся на одно звено участка цепи, находящегося в клубковом состоянии, а через /2 соответственно свободную энергию, приходящуюся на одно звено участка цепи, пребывающего в спиральном состоянии. Расплетение двойной спирали приводит к появлению напряжения на контактном спираль-клубок участке, что приводит к росту свободной энергии. Обозначим через Р3 проигрыш в свободной энергии, приходящийся на каждый контакт спирального и клубкового участков.

В этих обозначениях свободную энергию Р макромолекулы можно записать в виде [2, 14]

F = Я1/1+iV2/2 + «Fs-ГS. (2)

В уравнении (2) первые два слагаемых — это свободные энергии клубкового и спирального состояний, третье — свободная энергия межконтактных взаимодействий клубковых и спиральных участков цепи, четвертое слагаемое описывает энтропийную часть свободной энергии. Энтропия 5 спиральных и клубковых участков равна сумме логарифмов чисел Щ возможных размещений Л^- (г=1 — клубок; 1 = 2 — спираль) мономерных звеньев по п клубковым (спиральным) участкам цепи:

5 = 1п + 1п Щ, = (3)

гаЩ-га)!

Добавление дестабилизирующего двойную спираль агента в раствор делает спиральное состояние энергетически менее выгодным. Ясно, что при малых концентрациях <р дестабилизирующего агента зависимость энергии /2 от концентрации <р может быть аппроксимирована линейной функцией:

/2=/20 + Д/у>. (4)

В уравнении (4) /2о — свободная энергия спирального состояния в водном растворе, не содержащем дестабилизирующего агента; а Д/ — изменение свободной энергии спирального состояния при добавлении дестабилизирующего агента в раствор.

Уравнения (2)-(4) полностью задают свободную энергию макромолекулы. С учетом выражения (1) и выражения Стирлинга {' 1 гг А *! ~А; 1пА; при N —)■ оо) свободная энергия Р может быть представлена как функция двух переменных — числа мономерных звеньев , приходящихся на участки

цепи в клубковом состоянии, и числа спиральных и клубковых участков п.

Равновесные значения и п определяются минимизацией свободной энергии Р(Ы\,п) по соответствующим переменным:

ои ол/,

= о,

оп

= 0.

(5)

п=согЫ \ / Д?]=согЫ

После простых вычислений из системы (5) мы получили систему уравнений

1 - п!Щ

1 - л/Л/,

= £</1-/02 -ЫчЫТ = 5<?-Д/*>/7\

щ

п

Л/о

1 =

1

(6)

а

где 5 = —/«.0/7- и а = е-г*/т

Параметр 5 характеризует энергетическую выгодность того или иного (спирального или клубко-вого) состояния в водном растворе, не содержащем дестабилизирующих добавок. Если в водном растворе выгодна спираль, т.е. /, >/2, то 5> 1; если /2 > /,, а это означает, что более выгодна клубковая конформация, то 5 < 1. В общем случае параметр 5 изменяется в пределах 0<5<ос. Экспериментально параметр 5 изменяется при изменении температуры — чем ниже величина 5, тем выше значение температуры Т.

Параметр а характеризует кооперативность перехода: поскольку /%, > , то (т<1. Чем меньше параметр <7, тем энергетически менее выгодна граница между клубковыми и спиральными участками, что способствует, как мы увидим ниже, увеличению резкости перехода спираль-клубок.

Введем степень спиральности полимерной цепи в как долю звеньев, входящих в спиральные участки: в = N2/N. В новых обозначениях система уравнений (6) может быть переписана как

1

1 _ £ Г\ = Бе^ГГ Л -N в) \ N 1

N

п /а

(7)

После простых алгебраических преобразований из (7) можно получить явный вид зависимости степени спиральности в от концентрации <р дестабилизирующего агента в растворе:

0М

= I (1 - - 5) (1

4(т3еА 1ф \

-1/2>

(8)

где

1,

51^п(д:) = < -1, 0,

если х > 0, если х < 0, если х = 0.

Нами были рассчитаны зависимости степени спиральности полимерной цепи в от концентрации <р денатурирующего агента и от зависящего от температуры системы параметра 5 при различных значениях а и Д/.

Результаты и обсуждение

На рис. 2-4 приведены зависимости степени спиральности в полимерной цепи от концентрации <р денатурирующего агента в растворе, построенные при различных значениях параметров 5, а и Д/.

При 5 = 3, а = 0.01 (рис. 2) в отсутствие денатурирующего агента практически все звенья цепи находятся в спиральном состоянии, и добавление в раствор слабых денатурирующих агентов (Д/ = 1, кривая а) не влияет на состояние цепи. Введение более сильных денатурирующих агентов (Д/ = 5, 10, 50; кривые б-г) приводит к тому, что доля звеньев в спиральном состоянии в падает и происходит переход спираль-клубок. Видно, что чем больше сродство денатурирующего агента с ДНК (чем больше значение Д/), тем более резко и при меньших концентрациях <р денатурирующего агента происходит переход спираль-клубок. В случае очень сильного денатурирующего агента (Д/ = 50, кривая г) переход спираль-клубок происходит при <р = 0.025, а ширина области перехода составляет несколько сотых объемных долей.

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 ср

Рис. 2. Зависимость степени спиральности в от концентрации денатурирующего агента ¡р при 5 = 3, сг = 0.01 и различных значениях Л/: 1 (а), 5 (б), 10 (в), 50 (г)

На рис. 3 приведены зависимости степени спиральности в полимерной цепи от концентрации <р денатурирующего агента для 5 = 3 и большего значения параметра кооперативности а = 0.1. Видно, что в этом случае введение денатурирующего агента меньше влияет на состояние полимерной цепи, чем в рассмотренном выше случае с а = 0.01. Так, при Д/= 5, <7 = 0.1 и высоких концентрациях денатурирующего агента = 0.3) лишь незначительная

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 <р

Рис. 3. Зависимость степени спиральности в от концентрации денатурирующего агента ¡р при 5 = 3, <т = 0.1 и различных значениях Д/: 1 (а), 5 (б), 10 (в), 50 (г)

часть (не более 10%) звеньев переходит в клубковое состояние (рис. 3, кривая б), тогда как в случае ДНК с а = 0.01 (рис. 2, кривая б) при столь высоких концентрациях денатурирующего агента «¿) = 0.3, напротив, не более 10% звеньев пребывают в спиральном состоянии. Введение более сильных денатурирующих агентов и в этом случае вызывает переход спираль-клубок (рис. 3, кривые в и г). Однако в целом из сравнения рис. 2 и 3 видно, что чем больше значение параметра кооперативности <7, т.е. чем более энергетически выгодна граница между спиральными и клубковыми участками цепи, тем менее резко и при больших концентрациях <р происходит переход спираль-клубок.

В случаях, представленных на рис. 4, значение параметра а и силы денатурирующего агента Д/ являются фиксированными, а параметр 5 (характеризующий температуру системы) меняется. При 5 = 1 в отсутствие денатурирующего агента {<р = 0) спиральное и клубковое состояния одинаково выгодны и в = 0.5, т.е. одинаковые количества звеньев

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 <р

Рис. 4. Зависимость степени спиральности в от концентрации денатурирующего агента ¡р при сг = 0.01, Д/ = 10 и различных значениях 5: 1 (а), 3 (б), 10 (в)

находятся в клубковом и спиральном состояниях. Введение денатурирующего агента в такую систему приводит к плавному уменьшению доли в звеньев в спиральном. При 5 = 3 и 10 (рис. 4, кривые б, в) в отсутствие денатурирующего агента практически все звенья цепи находятся в спиральном состоянии а введение в раствор денатурирующего агента приводит к переходу спираль-клубок, причем чем больше значение параметра 5(ниже температура), тем при больших концентрациях денатурирующего агента происходит переход спираль-клубок. Интересно, что значения ширины переходов в обоих случаях приблизительно равны: в области перехода зависимости в(<р) имеют одинаковый наклон (рис. 4, кривые б, в).

Ширину перехода спираль-клубок А<р можно

яд

легко оценить, если вычислить производную Щ в точке, где одинаковые количества звеньев находятся в клубковом и глобулярном состоянии, т.е. в= 1/2:

, / .'00

(9=1/2

47Уа А/ '

(9)

Таким образом, ширина перехода спираль-клубок, вызванного добавлением денатурирующего агента, тем выше, чем выше параметр кооперативности а и обратно пропорциональна активности Д/ этого денатурирующего агента: чем выше активность Д/ денатурирующего агента, тем резче происходит переход спираль-клубок.

На рис. 5 приведены зависимости степени спиральности в от температуры (параметра 5) при <7 = 0.01, фиксированной силе денатурирующего агента Д/ = 10 и трех различных концентрациях <р. Видно, что изменение температуры в системе приводит к переходу спираль-клубок. Введение денатурирующего агента вызывает смещение перехода в область более низких температур. Интересно, что при

1 2 3

^ = ехр[(/соа-/Ьеих)/Л

Рис. 5. Зависимость степени спиральности в от параметра 5 при <т = 0.01, Д/ = 10 и различных концентрациях р денатурирующего агента: 10"3 (а); 10"2 (б); Ю^1 (в)

небольших концентрациях денатурирующего агента (рис. 5, кривые а и б) ширина перехода (наклон зависимости 0(5)) изменяется слабо. При высоких концентрациях денатурирующего агента (рис. 5, кривая в) переход спираль-клубок наблюдается при существенно более низких температурах и занимает гораздо более широкую область.

Аналогично ширину перехода спираль-клубок в этом случае можно оценить, если определить

производную ^Ц^ при 0= 1/2. Из уравнения (9)

ясно, что 6= 1/2 при 5 = и, таким образом,

ширина перехода Д5 равна

Д5=1/(|Р) = (10)

/ \6S J S=eWT

При невысоких концентрациях денатурирующего агента {Afip/T <С 1) для ширины перехода Д5 можно записать:

Д5 ~ A\fo + -p-^j ■

Таким образом, в случае когда переход спираль-клубок вызывается изменением температуры системы, его ширина растет по мере увеличения параметра кооперативности а и введения денатурирующего агента. Чем выше концентрация денатурирующего агента <р и его сила Д/, тем более плавно происходит переход спираль-клубок. При небольших концентрациях <р зависимость ширины Д5 линейным образом зависит от <р, и только при достаточно больших концентрациях <р зависимость Д5(<^) отклоняется от линейной.

Построенные нами зависимости ширины перехода Д5 спираль-клубок от концентрации <р (рис. 6) подтверждают эти выводы. Видно, что добавление денатурирующего агента увеличивает ширину перехода. Причем чем больше активность денатурирующего агента Д/, тем значительнее растет ширина перехода. Действительно, при добавлении слабого денатурирующего агента, для которого Д/ = 1, величина Д5 практически не меняется. Если Д/= 3, то при концентрациях <р = 0.3 ширина перехода увеличивается в 2.5 раза, а при Д/ = 5 и концентрации «¿) = 0.3 отношение д^^о) равно 4.5.

В статье [3] экспериментально была получена зависимость ширины перехода спираль-клубок ДНК Д5 от концентрации различных денатурирующих агентов <р и показано, что ширина перехода Д5 возрастает с увеличением концентрации и активности денатурирующего агента, причем при малых концентрациях денатурирующего агента эта зависимость линейная. Эти данные полностью согласуются с представленными нами результатами теоретических расчетов.

Рис. 6. Зависимость нормированной ширины перехода спираль-клубок от концентрации р денатурирующего агента при а = 0.01 и различных значений Д/: 1 (а); 3 (б); 5 (в)

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 05-03-33077), Программы фундаментальных исследований Отделения химии и наук о материалах Российской академии наук и Благотворительного фонда поддержки российской науки.

Литература

1. Веденов A.A., Дыхне A.M., Франк-Каменский М.Д. // УФН. 1971. 105. С. 479.

2. Волькенштейн М.В. Биофизика. М., 1981.

3. Paul O.P. Ts'o, Helmkamp G.К., Sander С. / / PN AS.

1962. 48. P. 686.

4. Levine L., Gordon I.A., Jencks W.P. // Biochemistry.

1963. 2. P. 168.

5. Goldar A., Sikorav J.-L. // Eur. Phys. E. 2004. 14, N 3. P. 211.

6. Vasilevskaya V.V., Aerov A.A., Khokhlov A.R. // Dok-lady Phys. Chem. 2004. 398, N 6. P. 258.

7. Vasilevskaya V.V., Aerou A.A., Khokhlov A.R. // Polym. Colloid Sei. 2006. 284, N 5. P. 459.

8. Okhapkin I.M., Makhaeva E.E, Khokhlov A.R. // Polym. Colloid Sei. 2005. 284, N 2. P. 117.

9. Okhapkin ¡.M., Askadskii A.A., Markov V.A., Makhaeva E.E., Khokhlov A.R. // Polym. Colloid Sei. 2005 (in print).

10. Vasilevskaya V.V., Khalatur P.G., Khokhlov A.R. 11 Macromolecules. 2003. 36, N 26. P. 10103.

11. Vasilevskaya V.V., Klochkov A.A., Lazutin A.A., Khalatur P.G., Khokhlov A.R. // Macromolecules. 2004. 37, N 14. P. 5444.

12. Vasilevskaya V.V., Markov VA., Khalatur P.G., Khokhlov A.R. Ц J. Chem. Phys. 2006. N 1. P. 124.

13. Ермилов В.А., Василевская В.В., Хохлов А.Р. // Высокомолекулярные соединения. 2007. 49А. С. 109.

14. Гросберг А.10., Хохлов А.Р. Статистическая физика макромолекул. М., 1989.

Поступила в редакцию 03.04.06