Pedf неингибиторный серпин с нейропротекторной и антиангиогенной активностями Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 577.112.017

PEDF - неингибиторный серпин с нейропротекторной и антиангиогенной активностями

Н. И. Минкевич, В. М. Липкин, И. А. Костанян*

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 *E-mail: iakost@mx.ibch.ru Поступила в редакцию 29.06.2010 г.

РЕФЕРАТ Фактор дифференцировки из пигментного эпителия PEDF (Pigment epithelium-derived factor), гликопротеин с молекулярной массой 50 кДа принадлежит к семейству неингибиторных серпинов. PEDF регулирует большое число физиологических процессов: стимулирует дифференцировку клеток ретинобла-стомы в нейроны, потенцирует рост и жизнеспособность фоторецепторных клеток и нейронов центральной нервной системы. Более того, этот фактор защищает нейрональные клетки от апоптоза. PEDF является не только нейротрофным фактором, но и природным ингибитором ангиогенеза. Точные молекулярные механизмы действия PEDF в настоящее время еще не полностью ясны. Тем не менее, учитывая огромный нейропротекторный, нейротрофный и антиангиогенезный потенциал PEDF, а также его биологически активных фрагментов, к этому белку проявляется огромный интерес исследователей как к перспективному препарату для терапии широкого спектра нейродегенеративных, офтальмологических и онкологических заболеваний. В обзоре суммированы современные данные о структурных особенностях, биохимических свойствах PEDF, его многомодальных функциях.

ключевые слоВА PEDF (pigment epithelium-derived factor, фактор дифференцировки из пигментного эпителия), серпин, нейротрофный фактор, ангиогенез.

введение

Фактор PEDF (Pigment Epithelium-Derived Factor -фактор дифференцировки из пигментного эпителия) был впервые идентифицирован в 1989 г. группой американских исследователей под руководством L.V. Johnson в культуральной среде клеток пигментного эпителия сетчатки глаза, выделенных из плода человека [1, 2]. При изучении действия данной среды на клетки ретинобластомы линии Y-79 было обнаружено, что она вызывает остановку неограниченного роста и деления клеток. При этом более 90% клеток приобретают морфологические и биохимические характеристики зрелых нейронов [1]. С помощью электрофоретических и хроматографических методов из культуральной среды был выделен белок с молекулярной массой около 50 кДа, обладающий указанным действием на клетки Y-79. Как было установлено позднее, PEDF человека состоит из одной по-липептидной цепи, содержащей 418 а.о. (рис. 1) [3].

Практически одновременно PEDF был выделен из культуры легочных фибробластоподобных клеток человека линии WI-38 [4]. Был также обнаружен и его

мышиный аналог, каспин [5]. Степень гомологии кДНК человеческого PEDF и каспина составляет 82.7%, а их аминокислотных последовательностей - 85.6%.

К настоящему времени известно, что PEDF экспрессируется почти во всех тканях млекопитающих и птиц и выполняет множество функций. К их числу относятся: дифференцирующее действие на эмбриональные и опухолевые клетки; протекторное действие на зрелые нейроны и другие клетки, входящие в состав нервной ткани; антиангиогенная активность - способность ингибировать образование новых сосудов. Поэтому данный белок представляет большой интерес как регуляторный фактор развития клеток и тканей.

особенности первичной структуры PEDF и кодирующего его гена

Ген PEDF человека и кодируемый им белок

Ген pedf человека локализован в коротком плече хромосомы 17 на его дистальном участке - 17р13.3 [6, 7]. Он имеет длину около 16 т.п.н. и включает в себя 8 эк-

MQALVLLLC IGAL L GH S SCQ 20

21 NPASPPEEGSP

71 animal 11

21IYKELLDTVTA

!ПК!Ш11!1Шфр?!1Ни^;Т!

PQ|NL|SAS|| V F E IILI I |S $FVAP L E К S YG T

II llll 70

S P D I H G 120 | P | V L T 170

71GN PRLDLQE I NNWVQAQM|g|lARSTKEIPDE IS I L L LG VA|F | GQWV T K220 21FDSRKTSLEDFY L DE ER T V R V P MM S DP КА V L R YG L |S |L S С К I A Q L PLTG270 71SMS I I FFLPLKV T QN L T L I | | S L T S | F I H| I |R | L К T VQA V L T V PK L KLS320 21Y EGEVTKS LQEMK LQSL FDSPDF SKITGKP I KLTQVEHRAGFEWNE DGAG370

71T T PSPGLQPAHL T FPLDYHLNQP F IFVLRDTDTGALLFIGKILDPRGP

418

Рис. 1. Аминокислотная последовательность фактора PEDF. Жирным красным шрифтом выделена связь Leu382-Thr383. Желтым фоном - серпиновая петля, голубым - сайт ^гликозилирования. Зеленым - пептид, ответственный за антиангиогенную функцию; сиреневым - пептид, ответственный за нейротрофную функцию. Серым - сайты фосфорилирования. Синим - кластер отрицательно заряженных аминокислот, коричневым - положительно заряженных аминокислот.

зонов, разделенных 7 интронами. Экзон-интронные контакты подчиняются консенсусному правилу GC/AG. Длина экзонов варьирует от 92 до 377 п.н. Промоторный регион гена расположен в 5'-фланки-рующей области; при этом СААТ-блок находится в позиции -43 относительно точки инициации транскрипции. В 5'-концевой области гена pedf, вплоть до -5 т.п.н., находится кластер А1и-повторов, включающий 8 полных и 3 частичных А1и-элемента [8].

Ген pedf кодирует последовательность из 418 а.о. [3]. В П-концевой части PEDF, сразу после инициа-торного метионина, находится 17-членный гидрофобный участок с последовательностью, характерной для сигнального фрагмента, обеспечивающего секрецию белка из клетки [3, 9]. Однако, по некоторым данным, последовательность зрелого PEDF, секретируе-мого из клеток-продуцентов, начинается с позиции Asn21; в соответствии с этим, зрелая полипептид-ная цепь содержит 398 а.о. [10, 11]. Посттрансляци-онные модификации PEDF плазмы крови включают П-концевой остаток пироглутаминовой кислоты, образующийся в результате дезаминирования остатка Gln2, и канонический сайт П-гликозилирования -Asn-Leu-Thr- в положениях 285-287. Присоединяемые полисахаридные структуры гетерогенны и имеют молекулярный вес около 4 кДа; их наличие объясняет разницу между расчетной и реальной массами фактора [12]. По данным двумерного электрофореза, секретируемый клетками пигментного эпителия человека PEDF существует в четырех изоформах, изоэлектрические точки которых равны 6.0; 6.2; 6.4 и 6.6 [13].

PEDF - член семейства неингибиторных серпинов

На основании анализа первичной структуры белка и соответствующей ему кДНК, PEDF был отнесен к семейству серпинов - ингибиторов сериновых протеиназ [14]. Гомология аминокислотной после-

довательности фактора с а:-антитрипсином составляет 27% (с учетом равноценных замен - 42%), с а:-антихимотрипсином и а2-плазминовым ингибитором - 27 и 26% (с учетом равноценных замен -44 и 43% соответственно) (рис. 2) [3]. Идентичность 51 а.о., необходимых для формирования пространственной структуры серпинового типа [15], в PEDF и других серпинах составляет более 76% [16]. Несмотря на высокую гомологию первичных и третичных

HUMA1AT

PEDF

HUMA1AT

PEDF

HUMA1AT

PEDF

HUMA1AT

PEDF

HUMA1AT

PEDF

HUMA1AT

PEDF

HUMA1AT

PEDF

HUMA1AT

PEDF

HUMA1AT

PEDF

Рис. 2. Сравнение аминокислотных последовательностей PEDF человека и а1-антитрипсина человека (НиМА1АТ). Двоеточием отмечены одинаковые аминокислоты, точками - консервативные замены [3].

структур с ингибиторами сериновых протеиназ, сам фактор не является ингибитором этих ферментов [17]. Возможно, это объясняется структурными особенностями экспонированной реакционной петли фактора. Хотя она имеет равную с другими серпина-ми длину (17 а.о., Glu366-Leu382) [18, 19], в ее составе отсутствуют характерные для ингибиторных серпи-нов элементы - Ala-обогащенная последовательность (положения в петле с 9 по 12) и Thr в положениях 8 и 14, но присутствуют нехарактерные для них остатки пролина [16].

В структуре PEDF, как и в структурах прочих сер-пинов, имеется наиболее подверженная протеолизу связь, расположенная в экспонированной в цитоплазму петле [14]. При ограниченном протеолизе PEDF многими сериновыми протеиназами (химотрипси-ном, эластазой, субтилизином и др.) его молекулярная масса уменьшается примерно на 4 кДа. Установлено, что данные протеиназы гидролизуют связь Leu382-Thr383, что приводит к отделению от молекулы 36-членного фрагмента с С-конца. В отличие от ингибиторных серпинов, ковалентная связь между молекулой PEDF и активным центром протеиназы не образуется. PEDF с отщепленным С-концевым фрагментом в полной мере сохраняет свою способность вызывать дифференцировку клеток линии Y-79 в зрелые нейроны [20].

После отделения 36-членного фрагмента (в результате протеолиза связи Leu382-Thr383) наблюдается уменьшение общей эллиптичности молекулы, что свидетельствует об уменьшении ее а-спиральности. При этом в противоположность ингибиторным серпинам устойчивость молекулы к термической денатурации снижается. Конформа-ционные изменения, однако, не носят глобального характера и затрагивают лишь С-концевую часть молекулы, приближенную к экспонированной петле. Функциональная роль последней, а также отделяемого при ее расщеплении С-концевого фрагмента молекулы PEDF изучены недостаточно. По некоторым данным, остатки, расположенные в этой части молекулы, наряду с N-концевым сигнальным пептидом необходимы для секреции PEDF из клеток.

Удаление фрагментов Pro415-Pro418 и Pro373-Ala380, а также точечные замены какого-либо из остатков Gly376, Leu377, Pro393, Phe394 или Phe396 (первые два расположены в экспонированной петле) приводят к изменению пространственной структуры молекулы или изменению ее взаимодействия с другими белками, предположительно, переносчиками. Нарушается транспорт PEDF из эндоплазматического ретикулума в комплекс Гольджи, вследствие чего он не секретирует-ся [16, 21].

Рис. 3. Трехмерная кристаллическая структура PEDF. Показаны две проекции молекулы по вертикальной оси со сдвигом в 90°. Ответственный за антиангио-генную функцию пептид выделен зеленым, ответственный за нейротрофную функцию - оранжевым. Красным цветом показаны отрицательно заряженные аминокислоты, образующие коллагенсвязывающий кластер, фиолетовым - положительно заряженные, формирующие «ядро» гликозаминогликан-связывающего кластера. Сайты фосфорилирования (Ser114 и Ser227) показаны желтым, сайт гликозилиро-вания Asn285 с присоединенными остатками сахаров -голубым [23].

Пространственная структура PEDF. Асимметричное расположение положительных и отрицательных зарядов в молекуле PEDF

Зрелая молекула фактора представляет собой глобулу с радиусом <3.05 нм. Около 60% а.о. PEDF участвуют в образовании десяти а-спиралей и трех Р-слоев [22]. В положениях Ser24, Ser114 и Ser227 находятся сайты фосфорилирования. Фактор содержит две аминокислотные последовательности, 34-членную (Asp34-Asn77) и 44-членную (Val78-Thr121), ответственные за антиангиогенные и нейротрофные взаимодействия соответственно (рис. 3) [23].

Характерной структурной особенностью молекулы PEDF является наличие кластеров положительно и отрицательно заряженных аминокислот, расположенных на разных сторонах глобулы. Они обусловливают способность фактора к электростатическому связыванию с элементами внеклеточного матрикса -гликозаминогликанами и коллагеном [24-25].

Кластер отрицательно заряженных остатков Asp и Glu локализован в двух областях полипептидной цепи, расположенных на поверхности глобулы и пространственно сближенных: Glu41-Asp64 (остатки Glu41, Glu42, Glu43, Asp44, Asp64) и Asp256-Glu304

(остатки Asp256, Asp258, Glu290, Glu291, Glu296, Asp300, Glu304). Наличие этого кластера обусловливает сродство PEDF к коллагенам типов I, II и III [25]. Связывание PEDF как с коллагенами, так и с глико-заминогликанами, имея электростатическую природу, ослабляется при повышении ионной силы окружающей среды. Пептидные фрагменты Val40-Arg67 и Phe277-Ile301, участвующие в образовании кластера, эволюционно чрезвычайно консервативны от млекопитающих до рыб [16].

Мастер положительно заряженных аминокислот, включающий 12 остатков Arg, Lys и His, расположен в области Lys134-Lys214. Остатки Lys134, Lys137, Lys189, Lys191, His212 и Lys214 формируют «ядро» кластера, остатки Arg141, Lys146, Lys147, Arg149, Arg165, Arg167 расположены по его краям. За счет локального положительного заряда молекула PEDF способна связываться с полианионными матрицами, богатыми отрицательно заряженными сульфогруп-пами - гепарином, хондроитинсульфатом и др. Данный кластер принимает участие во взаимодействии PEDF с гликозаминогликанами интерфоторецепторного матрикса сетчатки [24].

Помимо цитоплазмы, PEDF был обнаружен во внутриядерном пространстве. По всей вероятности, положительно заряженный фрагмент фактора Lys146-Arg149 может представлять собой сигнал внутриядерной локализации. Следует отметить, что только 10 из 6000 изученных белков, подобно PEDF, имеют С-концевой сайт гликозилирования; при этом все они - ядерные белки [16]. Возможно, PEDF в качестве ядерного белка принимает участие в регулировании клеточного цикла.

Заряды расположены на поверхности молекулы PEDF асимметрично - кластеры кислых и основных аминокислот находятся на противоположных сторонах глобулы. Это обеспечивает PEDF возможность взаимодействовать с гликозаминогликанами и коллагеном одновременно. Взаимодействие с гликозами-ногликанами усиливает сродство PEDF к коллагену и наоборот [25]. Таким образом, PEDF способен к модуляции процессов клеточной адгезии, включающих в себя интегрин-коллагеновое взаимодействие. Поскольку клеточная адгезия является одной из ключевых стадий ангиогенеза, этим может объясняться антиангиогенное действие фактора [25].

Степень фосфорилирования молекулы PEDF влияет на его антиангиогенную и нейротрофную активности

На поверхности молекулы PEDF расположены три сайта фосфорилирования (Ser24, Ser114 и Ser227). Выделяемый из плазмы крови человека фактор является фосфопротеином. Фосфорилирование осущест-

вляется в процессе циркуляции фактора в крови ферментами казеинкиназой 2 и протеинкиназой А [26]. ^зеинкиназа 2 фосфорилирует фактор по остаткам Ser24 и Ser114, протеинкиназа А - по единственному остатку Ser227. Показано, что фосфорилиро-вание PEDF обеими киназами существенно влияет на его физиологические функции. Фосфорилирован-ный только по сайтам казеинкиназы 2 фактор имеет сниженную нейротрофную активность; при этом его антиангиогенная активность значительно повышена. Фосфорилированный только протеинкиназой А фактор имеет сниженную антиангиогенную и практически не измененную нейротрофную активности. Полностью фосфорилированный фактор имеет высокие и антиангиогенную, и нейротрофную активности. При добавлении к отрицательному заряду, образовавшемуся в результате фосфорилирования фактора казеинкиназой 2, отрицательного заряда в сайте фосфорилирования протеинкиназой А усиливается способность фактора ингибировать клеточную пролиферацию. Следует отметить, что в составе PEDF имеются и другие потенциальные сайты фосфорили-рования, однако при нормальном фолдинге молекулы они остаются недоступными для киназ.

Фосфорилирование по сайтам казеинкиназы 2 предотвращает возможное модифицирование третьего сайта протеинкиназой А, в то время как фос-форилирование по Ser227 никак не влияет на взаимодействие PEDF с казеинкиназой 2. Потеря протеинкиназой A способности взаимодействовать с фактором при уже фосфорилированных Ser24 и Ser114 объясняется конформационной маскировкой Ser227 при фосфорилировании сайтов казеинкина-зы 2, несмотря на то, что эти два сайта расположены в разных областях молекулы [27].

Распространенность и эволюционная консервативность фактора PEDF

Ген pedf эволюционно консервативен - он присутствует в геномах различных видов от человека до рыб (рис. 4, 5) [16].

Методом ДН^РН^гибридизации установлено наличие мРНK PEDF почти во всех из 44 исследованных тканей взрослого человека и человеческого эмбриона. Предположительно, PEDF экспрессируется главным образом теми типами клеток, которые не утратили способность к делению in vivo [28]. В различных отделах глаза и слоях сетчатки взрослого человека и эмбриона антитела к полипептиду PEDF взаимодействовали с цитоплазмой развивающихся фоторецепторов, глиальным слоем, отдельными клетками слоя нейробластов и пигментными гранулами клеток пигментного эпителия с 8-й недели эмбрионального развития. У взрослого организма они

Рис. 4. Сравнение аминокислотных последовательностей фактора PEDF. Четырнадцать последовательностей фактора разных биологических видов (человек, Homo sapiens; шимпанзе, Pan troglodytes; бык, Bos taurus; свинья, Sus scrofa; собака, Canis canis; мышь, Mus muscu-lus; крыса, Rattus norvegicus; курица, Gallus gallus; тропическая лягушка, Xenopus tropicalis; шпорцевая лягушка, Xenopus laevis; японская рисовая рыбка, Oryzias latipes; рыба фугу, Takifugu rubripes; радужная форель, Oncorhynchus mykiss; данио рерио (zebra fish), Danio reno) проанализированы с помощью программы ClustalW. Звездочкой отмечены позиции, занимаемые полностью консервативным остатком. Двоеточие - консервативна одна из «сильных» функциональных групп; точка - консервативна одна из «слабых» групп. Синей линией обозначена лидерная последовательность PEDF. Двойной красной линией выделены области высокой консервативности между всеми последовательностями PEDF. Прочерки использованы для максимального выравнивания последовательностей [16].

H. sapiens P. troglodytes

B. taurus S. scrofa

C. canis

M. musculus R. norvegicus G. gallus X. tropicalis X. laevis O. latipes T. rubripes O. mykiss

D. rerio

Консенсусные мотивы

10 20 3

MQALVLLLCI GALLGHSSCQ N AS EEGS MQALVLLLCI GALLGHSSCQ N AS EEGS MQALVLLL<-T GALLGFGRCQ NAG - -QBAGS MQALVLLL*T GALLGSGSCQ HAG-- EEGS MQALVLLL..T GALLGHSSCO HDAGG QEDS MQALVLLLT GALLGHGSSQ HV S-SSEGS MOTLVLLL.-.T GALLGHGSSQ HV D-SSQDS MQZ AVLLLL GLLTI SKSQ HS --AGQHS

MKIYLALLFT GSFLSYTSAQ HAA............

MKIYLALLFT GTPLSSTSAQ HAA............

MKGTTPLLVI GVILRFCQAQ SET............

MKRFSLLLML AAVLSFCQAQ SES............

MMRTTLLLCL GFLLSLSYAQ -LL------------

MKKIVLLVGL SLLSLSHAQ LAD.............

0 40

D DSTGALV EEED- FFKV D DSTGALV EEED- FFKV LT ESTGA V EEED- FFKV A DTVGA V EEED- FFKV A DATGV V EEED- FFRV V DSTGE V EEED- FFKV A DSTGE V VEEDD FFKA TTDGTVGEV EEED- FYKT

---DEV TEV EEED- FYKS

---EEVL EV EEED- FYKS

50 60 70 80 90

VHKLAAAVS HFGYDLYRVR SSMS TTHVL LS LSVATAL

VHKLAAAVS HFGYDLYRVR SSMS TTHVL LS LSVATAL

VHKLAAAVS HFGYDLYRVR SGES TAHVL LS LSVATAL

VHKLAAAVS HFGYDLYRVR SSES TAHVL LS LSVATAL

VHKLAAAIS HFGYDLYRVR SSFS AAHVL LS LSVATAL

VHKLAAAVS HFGYDLYRLR SGAS TGHVL LS LSVATAL

VHKLAAAVS HFGYDLYRLR SGAVSTGHIL LS LSVATAL IHKLAAAVS HFGYDLYRQQ SSRTATAHVL LS FSLATAL IHRLASSAS HFGYDLYRMQ AHKH NSHII IS LSIATSL

LMRLTSSAS HFGYDLYRMQ AHKH HSHIF IS LSIATSL

EAEESVA EEEHVELFTT AQTKMGAATS DFGYHLFRAL ASQEAGHHVF LA ISVSAVL

GGEGEGL EEE VELFTT TTKLGAAVS DFGYHLPRAL ASRETSSHVF LS ISVSAAL

ETEEAGG EEEAVELFTT RAKMAAATS DFGYHLFRAL AGRH KTHVF LA ISISAVL

TTDAEG- EBEAVDLFTT RTKLAAATS DFGYHLFRQL ASRDTKASVF LS MSISAAF

H. sapiens P. troglodytes

B. taurus S. scrofa

C. canis

M. musculus R. norvegicus G. gallus X. tropicalis X. laevis O. latipes T. rubripes O. mykiss

D. rerio

Консенсусные мотивы

100 110 120 130 140 150 160 170 180

SALSLGAE-Q RTESIIHRAL YYDLISS DI HGTYKELLDT VTARQKHLKS ASRIVFEKKL RIKSSFVA L EKSYGTR RV LTGH RLDLQ SALSLGAE-Q RTESIIHRAL YYDLISS DI HGTYKELLDT VTA QKHLKS ASRIVFEKKL RIKSSFVA L EKSYGTR RV LTGH RLDLQ

SALSLGAE-Q RTESNIHRAL YYDLISH DI HGTYKDLLAS VTA QKHLKS ASRIIFERKL RIKASFI L EKSYGTR RI LTGHSRVDLQ

SALSLGAE-Q RTESSLHRAL YYDLISH DL HGTYKELLAA VTA QKHLKS ASRIIFEKKL RIKASFVA L EKSYGTR RI LTGHSRLDLQ

SALSLGAE-Q RTESTIHRAL YYDLISH DI HSTYKELLAS VTA EKHFKS ASRIVFEKKL RIKSSFVA L EKSYSTR RI LTGH RLDLQ

SALSLGAE-H RTESVIHRAL YYDLITN DI HSTYKELLAS VTA EKHLKR ASRIVFERKL RVKSSFVA L EKSYGTR RI LTGH RVDLQ

SALSLGAE-Q RTESVIHRAL YYDLIHH DI HSTYKELLAS VTA EKHFKS ASRIVFERKL RVKSSFVA L EKSYGTR RI LTGH RIDLQ

SGLSLGAG-E RTEDVISRAL FYDLLHKAEV HHTYKDLLAS VTG EKSLKS ASRIIVEKRL RVKSTFHSQL EKSYRMRLRA LSGHTQLDLQ SSLSLGGG-Q RTESLIQRSL YYDLLHD EV HATYKDLLAS FTSQASGLKS TRIMLERRL RLRMDFVTQV EKFYGHK KV LTGSTRLDLQ

SSLSLGSG-Q RTESLIHRSL YYDLLHD EL HATYKELLAS LTSHGSGLKS T RIMLERKL RLRLDFVTQV EKFYGHK RI LTGHTRLDLQ

TQLSMGGS-E HAQSQLFRAL RYHTLHD QL HDTLKHILAT VKA GKGLST AARLYLSRRL RLKQEFLALV EHQYHVR KA VLG-- -KDIK SQLSLGAS-E GSQRQLFRAL RYHTLQD QL HSTLKTMLAS VTATGKGLST AARLYLARRL R KQDFFKAV EQQYGVR К LMGGA-KDAK

TQLSMGAS D RSEK LYRAL RYHTLQD QL HDTLRDLLAS LRA GKGLSI AARVYLARRL RLKQEYFGW EKQYGVR KT LMGGA-KDVH

TQLSMGAS-E RAEKQIYRAL RYHTLQDSQL HDTLRDLLSS LRASAKGFKS AERILLARKL RLRLEYLHSV EKQYGER QI LAGGA-RDLK

H. sapiens P. troglodytes

B. taurus S. scrofa

C. canis

M. musculus R. norvegicus G. gallus X. tropicalis X. laevis O. latipes T. rubripes O. mykiss

D. rerio

Консенсусные мотивы

190 200 210 220 230 24

---I-----I

EIHH VQAQM KGKLARST-K El DEISILL LGVAHFKGC VTKFDSRKTS LEDFYLDEER

EIHH VQAQM KGKLARST-K El DEISILL LGVAHFKGQ VTKFDSRKTS LEDFHLDEER

EIHH VQAQM KGKVARST-R EM SEISIFL LGVAYFKGQ VTKFDSRKTS LEDFYLDEER

EVHH.VQAQT KGKVARST-R EL GEISILL LGVAYFKGQ VTKFDSRKTS LEDFHLDEER

EVHH VQAQM KGKIARST-R El SGISILL LGVAYFKGQ VTKFDSRKTS LEDFHLDEER

EIHH VQAQM KGKIARST-R EM SALSILL LGVAYFKGQ VTKFDSRKTT LQDFHLDEDR

EIHH VQAQM KGKIARST-R EM SALSILL LGVAYFKGQ ATKFDSRKTT LQDFHLDEDR

EIHH VRQQT RGRILRFM-K DM TDVSILL AGAAYFKGT KTKFDTKRTV LKDFHLDEDR

EAHDFIQKQT QGKWKFF-K El TSVSILL LGTTYLKGC AYKPH RETV QREFHLDEQT

EAHDFVQKQT QAKWKFF-K El AGVSILL LGTSYFKGC AYKFH RETV QSEFHLDEQT

EVHD.VSQQT GRKVQGFLAS HF RHSGAHA VSAAYFKGK VTRFS-QSGA MDTFQVADGA

DVHDrrVSQQT GRKVQQFLAK F RAAGVHA VSASYFKGK VTRFG-QSGA LDHFQVEGEV

EIHDVKQQT GGKVDRFMSK ALGRHSGW LGAAYPKVK MTRPS-KSGV MEDFQLVGEA

TVHDbVKQQT GGKVDQW S L RHTALL VGSAYFKGK ITRFG-K HK METFRRDGQA

0 250 26

....

TVRV MMSD KAVLRYGLDS TVRV MMSD KAVLRYGLDS TVKV MMSD QAVLRYGLDS TVKV MMSD KAVLRYGLDS TVKV MMSD KAILRYGLDS TVRV MMSD KAILRYGLDS TVRV MMSD KAILRYGLDS TVQVSMMSD KAILRYGFDS

SVTV MMSSK HI VRYGLDS SVTV MISSK HL VRYGLDS VSI MMKQD NY VKMGVDS AVRV MMQQD NY VKMGSDS ARISMMQQD NY VKMGVD AVI MMEQE NY VKMGIDS

270

....I....|

DLSCKIAQL

DLSCKIAQL

DLHCKIAQL

DLXLQIAQL

DLSLQIAQL

DLHCKIAQL

DLHCKIAQL

ELHCKIAQL

DFNCKIVQL

DFNCKIVQL

DLKCTLAQI

DLSCVIAQIQ

DLGCTIAQIQ

DLGCTIAQV

H. sapiens P. troglodytes

B. taurus S. scrofa

C. canis

M. musculus R. norvegicus G. gallus X. tropicalis X. laevis O. latipes T. rubripes O. mykiss

D. rerio

Консенсусные мотивы

280

.

LTGSMSIIFF LTGSTSIIFF LTGSTSIIFF LTXSMSIIFF LTXSMSIIFF LTGSMSIIFF LTGSMSIIFF LTEGVSAMPF LTGGVSIMFF LTGGVSIMFF MQDDVSMFLF MQDGVSMFIF MQDDVSMFVF MEDGVSMYFF

290 300 310 320 330 340 350 360

----|----|

LKVTQNLT LIEESLTSEF IHDIDRELKT VQAVLTV KL KLSYEGEVTK SLQEMKLQSL FDS DPSKIT GK IKLTQVB

LKVTQHLT LIEESLTSEF IHDIDRELKT VQAVLTV KL KLSYEGEVTK SLQEMKLQSL FDS DFSKIT GK IKLTQVB

QKVTQHLT LIEESLTSEF IHDIDRELKT VQAVLTI KL KLSYEGELTK SVQELKLQSL FDA DFSKIT GK IKLTQVB

LKVTQHLT MIEESLTSEF IHDIDRELKT VQAVLTV KL KLSYEGELTK SVQELKLQSL FDS DFSKIT GK IKLTQVB

LKVTQHLT MIEESLTSEF IHDIDRELKT IQAVLTI KL KLSYEGEVTK SLQEMKLQSL FDS DFSKIT GK IKLTQVB

LTVTQHLT MIEESLTSEF IHDIDRELKT IQAVLTV KL KLSFEGELTK SLQDMKLQSL FES DFSKIT GK VKLTQVB

LTVTQHLT MIEESLTSEF VHDIDRELKT IQAVLTV KL KLSYEGDVTH SLQDMKLQSL FES DFSKIT GK VKLTQVB

TKVTQHMT LIEESLTSEF VHDVDRELKT VHAVLSL KL KLHYEEALGH TVKBTRLQSL FTS DPTKIS AK IKLSHVQ

HTVTQHLT MIEEGLTSEF VHDIDQALQ IHLVLSV KL KLHYEAELKE ALQESKLQSL FAT DFSKIS SK LKLSYW

HTVTQHLT MIEEGLTSEF IHDIDQALQT VHMDLRI KL KLHYEVELKE ALQESKLQSL FST DFSKIS SK LKLSHW

DDLSSHMT QLEESLTAEF VQDLSMTLL AQVSLTL VL RLSYSKDLL LLGDLGLSD LLHTELQKIS Q VKLTSVH

DGVTAHMT LLEESLTAEF VQDLAMTLL AKVSLTL VL RLSPSTDLL LLGDLGL..................................

DDVTQHMT LVEESLTAEF VQDLSMTLH CRR SHCLSI KFSYSTDLL LLTDLGLDEF LADTDLTKIT SQVAKLSSLH

DEVTQHLT LIEEALTAEF VQDLSHSLHT VKVLLTL VI KLSYKTHLL SLSDLGLSE LAETDLTKIT SQ VKLHAVH

H. sapiens P. troglodytes

B. taurus S. scrofa

C. canis

M. musculus R. norvegicus G. gallus X. tropicalis X. laevis O. latipes T. rubripes O. mykiss

D. rerio

Консенсусные мотивы

370 380 390

---|-----| ....|

HRAGFE HED GAGTT S GL Q AHLTF LD YHLNQ

HRAGFE NED GAGTT S GL Q AHLTF LD YHLNQ

HRVGFB NED GAGTNSS GV Q ARLTF LD YHLHQ

HRIGFBNED GGSATSS G-

HRAGPB HED GAGTT S GL

HRAAFB НЕЕ GAGSS S GL L VRLTF LD YHLNQ

HRAAFE NEE GAGTSSH DL Q VRLTF LD YHLHR

HKAILELHED GEKST H GV HAARLTF IB YHVDR

HKATLELHEE GAETA К E- DSHRHYF LE YHLDH

HKATLELHED GAETA KAE- ASSRKYF LE YHLDH

HKWMEMA E GHQY SSS- A T---HLS YRADR

-- RLTF LD YHLHQ Q TRLTP LD YHLHR

400 4

...|------|-----|

FIFV LRDTDTGALL FIFV LRDTDTGALL PIPV LRDTDTGALL FIFV LRDTDTGALL FIFV LRDTDTGALL FLFV LRDTDTGALL FIFV LRDTDTGALL PLLV LRDDTTGTLL FLFV LRAHDHGALL FLFV LRAHDHGALL PLYL IRDETSGALL

10

FIGKILD

FIGKILD

FIGKILD

PIGKILD

PIGKILD

PIGRILD

PIGRILD

PIGKILD

FIGKVMD

FIGKVMD

FIGRWH

420

• | ... RG -RG T--RG T--RS T--RG T--SS T--SS T--RS V--KG FSF KG PSF TG-------

HKWMEMA E GTQYASSH - AST--------LS YCVDH FLFL VRD BAS GALL FIGKWH RH LRI

HKWLETA В GAEYASTT - SATGQSLGLS YRVDR FLFL VRDE SXALL PIGKC..................

Hs Chimp Bt Pig Dog Mm Rt Chick Xt Xl Fugu Trout Zebra

Hs 100

Chimp 99 100

Bt 87 88 100

Pig 88 88 90 100

Dog 90 90 87 88 100

Mm 86 85 84 84 87 100

Rt 83 83 82 82 87 93 100

Chick 63 63 63 63 62 63 63 100

Xt 55 55 55 56 56 56 56 55 100

Xl 56 57 57 58 57 57 56 53 89 100

Fugu 34 35 36 36 36 36 35 35 34 35 100

Trout 37 37 39 38 36 37 37 39 38 38 64 100

Zebra 40 40 41 41 41 40 39 42 41 40 56 65 100

Рис. 5. Межвидовая гомология аминокислотных последовательностей фактора PEDF в процентах. Таблица получена с помощью программы PSI- Blast [16].

взаимодействовали с ядрами палочек (но не колбочек), цитоплазмой некоторых клеток во внутреннем ядерном и глиальном слоях, с клетками пигментного эпителия, хориокапиллярным слоем роговицы, зрачком, а также цилиарным эпителием [29].

Наибольшей видовой консервативностью среди пептидных фрагментов фактора обладают следующие последовательности [16]. Эволюционно консервативен лидерный N-концевой участок фактора, ответственный за секрецию PEDF из клетки [30]. Высоко консервативна последовательность Asn285-X-Thr287, являющаяся сайтом N-гликозирования. Также консервативными участками являются четыре пептидных фрагмента, два из которых уникальны для PEDF и образуют кластер отрицательно заряженных аминокислот, а два других (в положениях Val78-Gly95 и Phe384-Pro415) имеют высокую гомологию с другими серпинами. Видимо, присущие им функции фундаментальны для всех серпинов.

эффекты, оказываемые pedf на клетки и ткани различного происхождения

Дифференцирующее действие PEDF и его влияние на метаболизм

Дифференцирующее действие нейротрофного фактора PEDF было показано и изучено на тканях нейрального происхождения - как на эмбриональных (незрелые нейроны, развивающиеся фоторецепто-

ры) [31, 32], так и на опухолевых (нейробластома, ретинобластома, карцинома) [3, 33, 34]. Человеческий и бычий PEDF оказывают дифференцирующее действие in vitro на клетки культуры незрелых двигательных нейронов спинного мозга, выделенных из эмбрионов цыплят в возрасте 5.5 сут [35]. PEDF - основной фактор, обеспечивающий нормальный морфогенез и метаболизм фоторецепторных и глиальных клеток при эмбриональном развитии сетчатки глаза [32, 36, 37].

PEDF оказывает дифференцирующее и антипро-лиферативное воздействие на клетки ретинобласто-мы линии Y-79 [1, 3]. Противоопухолевое действие фактора распространяется и на нейробластому. При этом заболевании клинический прогноз бывает тем лучше, чем больше в популяции дифференцированных нейронов и Шванновских клеток, культуральная среда которых обладает противоопухолевыми свойствами [38]. Именно PEDF, являющийся секреторным продуктом Шванновских клеток, определяет противоопухолевые свойства их культуральной среды [33].

PEDF оказывает противоопухолевое действие на карциному эпителия яичников, являющуюся наиболее летальной из гинекологических раковых опухолей. Уровень экспрессии PEDF в раковых опухолях яичников и их клеточных линиях значительно снижен по сравнению с нормальным эпителием яичников. Экзогенный PEDF ингибирует рост клеток

линий нормального и ракового эпителия яичников, в то время как снижение активности эндогенного PEDF путем введения ингибиторов усиливает рост этих клеток.

Действие PEDF в клетках эпителия яичников в значительной степени регулируется эстрогенами. Обработка культивируемых клеток 17Р-эстрадиолом снижает экспрессию фактора и его мРН^ угнетая транскрипцию гена pedf. В регуляции принимает участие рецептор эстрогена. 17Р-Эстрадиол способствует росту нормальных и раковых клеточных линий эпителия яичников, в то время как совместная обработка 17Р-эстрадиолом и PEDF отменяет ростовое стимулирование [34].

В некоторых линиях клеток карциномы яичника делетирован участок 17-й хромосомы 17p13.3, имеющий длину 15 т.п.н. и включающий в себя почти весь ген pedf [39]. На эти клеточные линии 17Р-эстрадиол не оказывает пролиферативного воздействия, что позволяет предположить делецию участка его воздействия, расположенного в 5'-фланкирующей области гена фактора. Эпигенетические изменения, такие, как гиперметилирование промотора, могут служить альтернативным механизмом регуляции уровня экспрессии фактора [34].

PEDF в клетках пигментного эпителия стимулирует синтез и накопление меланина [40], о важности которого в развитии нейронов сетчатки свидетельствует тот факт, что все млекопитающие альбиносы независимо от причин альбинизма имеют те или иные нарушения передачи зрительного сигнала [41]. Фактор также повышает активность промотора гена ти-розиназы - фермента, ответственного за синтез меланина [42].

Нейропротекторное действие PEDF

Показана способность PEDF предотвращать апоп-тотическую гибель клеток культуры сетчаточных нейронов под действием H2O2 [43]. Предварительная обработка фактором защищает пигментный эпителий от вызываемых H2O2 нарушений его барьерных функций. Он также предохраняет клетки от вызываемых перекисью водорода перераспределения синаптических белков окклудина и N-кадгерина в составе клеточных мембран пигментного эпителия, от реорганизации актина и активации сигнального каскада белка теплового шока p38/27-кДа, который ее опосредует [44].

Фактор оказывает протекторное действие на культуру первичных гранулярных клеток мозжечка, выделенных из 8-дневных крысят, значительно замедляя апоптоз клеток этой культуры, происходящий спонтанно или же вызванный депривацией сыворотки [45, 46]. Также PEDF предохраняет грануляр-

ные клетки мозжечка [47], нейроны гиппокампа [48] и двигательные нейроны спинного мозга [49] от токсического действия глутамата. По некоторым данным, основой механизма антиапоптотического действия PEDF на гранулярные клетки является активация транскрипционного фактора NF-xB [50].

Антиангиогенное действие PEDF

PEDF является одним из наиболее мощных анти-ангиогенных факторов. Он ингибирует рост сосудов в роговице крысы, стимулированный сильнейшим ангиогенным фактором - bFGF. Действующая концентрация PEDF меньше, чем для наиболее мощных из известных антиангиогенных агентов - ангиостати-на, эндостатина и тромбоспондина [51]. Фактор участвует в комплексном сбалансированном контроле ангиогенеза, противодействуя эффекту ангиогенных факторов, прежде всего VEGF (vascular endothelial growth factor) и bFGF (basic fibroblast growth factor) [52-55].

Насыщение тканей кислородом влияет на концентрацию PEDF. При гипероксигенации у животных формируется сетчатка с пониженным количеством сосудов, при этом уровень экспрессии PEDF оказывается повышенным [56]. Гипероксигенация стимулирует выработку фактора; гипоксия, напротив, угнетает ее.

В настоящее время выясняется механизм антиан-гиогенного эффекта PEDF. Эндотелиальные клетки обладают положительным хемотаксисом в отношении ангиогенных факторов. Соответственно один из предположительных механизмов такого действия PEDF заключается в ингибировании хемотаксиса эндотелиальных клеток, образующих стенки кровеносных сосудов, по отношению ко всем исследованным ан-гиогенным факторам - VEGF, PDGF, IL-8 и др. [51].

По другим данным, причиной антиангиогенного эффекта PEDF является апоптоз эндотелиальных клеток [57]. Характерной особенностью фактора является селективное влияние только на развивающиеся сосуды, повреждения уже существующих он не вызывает [58]. Причиной такого избирательного действия служит инициация апоптоза, опосредованная Fas-лигандом [59]. Ангиогенные агенты стимулируют экспрессию эндотелиальными клетками ряда анти-апоптотических молекул, повышающих их жизнеспособность [60], а также экспрессию Fas-рецепторов. Показано, что PEDF индуцирует выработку эндотелиальными клетками Fas-лигандов, что при наличии достаточной плотности Fas-рецепторов ведет к Fas-индуцированному апоптозу клеток развивающихся сосудов [59]. В сформированных же сосудах клетки эндотелия находятся в состоянии «ростового запрета» и в плотном контакте друг с другом; экспрессия

Fas-рецепторов в них снижена [61], что делает их защищенными от апоптотического действия PEDF.

Однако, помимо того что PEDF может вызывать апоптоз путем увеличения экспрессии Fas/FasL, должны быть дополнительные способы его воздействия на клетки, так как оно сохраняется у нока-утных по Fas и FasL мышей [57, 62, 63]. Показано, что PEDF способен активировать p38 MAPK в культуре эпителиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC), способствуя их фосфорилированию. Активация p38 приводит к дальнейшей активации каспаз 3, 8 и 9 и апоптотической гибели клетки [64].

Следует отметить, что фактор VEGF тоже способствует фосфорилированию p38, причем при совместной обработке с PEDF происходит потенцирование эффекта. Одной из важнейших функций VEGF является защита эндотелиальных клеток от апопто-за, в том числе и в условиях обеднения среды. Активация киназы p38 VEGF связана с регуляцией ее транскрипции [65, 66], реорганизацией цитоскелета и миграцией клеток [67]. Представляется вероятным, что пороговая концентрация фосфорилированной p38 MAPK, необходимая для проявления проангио-генных эффектов, ниже концентрации, требуемой для активизации клеточной гибели. Опосредованное PEDF повышение уровня содержания активированной p38 может приводить к превышению апоптотиче-ской пороговой концентрации белка и гибели клетки [64].

Стимулируя апоптоз эндотелиальных клеток, PEDF в то же время предотвращает апоптоз различных клеток нейрального происхождения. На эндотелиальные клетки разных фенотипов PEDF может оказывать и противоположное по характеру воздействие [68]. Вероятно, в таких случаях действие фактора реализуется по разным, не связанным между собой механизмам.

РЕцЕПЮР PEDF

Разнообразные функции PEDF, очевидно, реализуются по разным механизмам. Однако представляется вероятным, что в большинстве случаев взаимодействие PEDF с клеткой идет по лиганд-рецепторному типу; эффекты фактора блокируются антителами-антагонистами связывания с клеточной поверхностью [47, 69, 70].

Недавно в клетках сетчатки глаза методом двухгибридной системы был идентифицирован ген [72], белковый продукт которого представляет собой рецептор PEDF, названный PEDF-R. Ген локализован на участке 11p15.5 11 хромосомы и содержит 10 экзонов и 9 интронов. мРНК транскрипты pedf-r содержат 2122 основания. Они кодируют белковую последовательность из 504 аминокислот (масса

55.315 кДа), содержащую четыре консенсусных сайта N-гликозилирования. Экспрессируемый в эукариотических системах рецептор имеет массу около 81 кДа, близкую к массе ранее идентифицированных в клетках линии ретинобластомы человека Y-79, а также в гранулярных нейронах мозжечка крысы и в сетчатке быка, PEDF-связывающих белков клеточной поверхности [70, 71].

Рецептор встречается главным образом в клетках ретинального пигментного эпителия, на внутренних сегментах фоторецепторов и нейрональных клетках сетчатки, хотя во внешних сегментах палочек он не обнаружен. Помимо нормального ретинального пигментного эпителия, PEDF-R присутствует также в ряде других тканей и органов - в оптическом нерве, сосудистой оболочке глаза, в клетках ретинобласто-мы и раковых опухолей различного происхождения, а также в клетках мозга животных в условиях истощения серотонина и катехоламинов. Ген рецептора у млекопитающих эволюционно консервативен. Наибольшая его консервативность показана для PEDF-R человека и мыши (89%) и для PEDF-R человека и крысы (также 89%). Гомологичные гену PEDF-R последовательности обнаружены в геномах нематод (Caenorhabditis elegans) и комаров (Anopheles gam-biae).

PEDF-R представляет собой трансмембранный белок, имеющий четыре трансмембранных, два внеклеточных и три внутриклеточных домена; N- и С-концы молекулы экспонированы во внутриклеточное пространство (рис. 6) [72].

PEDF-R способен связываться с PEDF с Kd ~ 3.03 ± 0.716 нМ как в растворе, так и в условиях иммобилизации одного из белков, не теряя эту способность даже после денатурации и ре-фолдинга. Посттрансляционные модификации, в частности N-гликозилирование, не являются необходимым условием для связывания фактора с ре-

Рис. 6. Прогнозируемая по аминокислотной последовательности топология PEDF-R. Жирными линиями показаны трансмембранные участки [72].

цептором - экспрессированный в бактериальных системах PEDF-R взаимодействует с PEDF с практически неизменной константой диссоциации. Идентифицирован ответственный за связывание фактора фрагмент PEDF-R - 12с ^1п250-А^383). Показано, что этот фрагмент высокогомологичен коллагену I крысы. Вероятно, однако, что не только этот фрагмент отвечает за связывание PEDF, поскольку фактор взаимодействует с полноразмерным рецептором с более высокой аффинностью, константа диссоциации последнего почти на 2 порядка выше, чем у фрагмента 12с (Кй12с ~ 134 нМ).

Во взаимодействии фактора с рецептором принимает участие фрагмент молекулы PEDF Val78-Т^121. Его синтетический 44-членный пептидный аналог сохраняет способность связываться с рецептором [70].

Помимо способности связывать PEDF, PEDF-R проявляет фосфолипазную активность и классифицирован как член семейства кальций-независимых фосфолипаз А2. В последовательности PEDF-R идентифицировано 2 пространственно сближенных пататин-подобных фрагмента (Asn39-Ala54 и Ser158-Тyr177), образующих каталитическую диаду Ser47/Asp166, присутствующую в активных центрах пататина В2 и цитозольных фосфолипаз А2 человека [73].

Фосфолипазы А2 высвобождают лизофосфолипи-ды, участвующие в клеточной сигнализации и влияющие на развитие и функционирование всех систем органов млекопитающих [74]. Также фосфолипазы А2 высвобождают из клеточной мембраны биологически активные жирные кислоты, служащие вторичными мессенджерами или предшественниками эйкозаноидов, опосредующих передачу сигналов [75]. Наиболее часто встречающиеся в мембранах клеток сетчатки и центральной нервной системы арахидо-новая и докозагексаеновая кислоты способны влиять на выживаемость клеток сетчатки и нервных клеток [76, 77] и подобно PEDF обладают противоопухолевой и антиангиогенной активностями [78, 79].

PEDF-R способен расщеплять арахидоноил-эте-глицерин-3-фосфохолин, высвобождая арахидоно-вую кислоту [80]; и, хотя в настоящий момент нет эмпирических данных о высвобождении PEDF-R докозагексаеновой кислоты, показано, что PEDF в субнаномолярных концентрациях способен активировать синтез и высвобождение ее производных в клетках линии ARPE-19 человека [81, 82]. Эти данные говорят о том, что PEDF может способствовать выживанию клеток сетчатки посредством влияния на липидные сигнальные пути, связанные с PEDF-R. При взаимодействии PEDF со своим рецептором PEDF-R происходит высвобождение из клеточных мембран жирных кислот и лизофосфолипидов, дей-

ствующих как пара-, так и аутокринно, с одной стороны повышая выживаемость и способность к диф-ференцировке нейрональных клеток, а с другой вызывая необратимую гибель опухолевых и эндотелиальных клеток [72].

PEDF КАК субсТРАТ MMP-2 И MMP-9

^к уже упоминалось выше, регуляция ангиогенеза тесно связана с количественным соотношением между факторами дифференцировки VEGF и PEDF. Показано, что при возрастании концентрации экзогенного PEDF в модели хороидальной неоваску-ляризации стимулируется продукция VEGF эндотелиальными клетками. Увеличение концентрации VEGF, в свою очередь, может индуцировать продукцию матриксных металлопротеиназ MMP-2 и -9 (или соответственно желатиназ A и B). Активированные протеиназы расщепляют компоненты внеклеточного матрикса, а также связанный с ними PEDF, не воздействуя при этом на VEGF. Таким образом, в ответ на повышение концентрации PEDF усиливается его инактивация MMP, возрастает соотношение факторов VEGF/PEDF и стимулируется ангиогенез.

Наиболее доступным для протеолиза MMP-2 и -9 сайтом в составе PEDF является участок экспонированной петли, содержащий в своем составе связь Leu382-Thr383. Однако, помимо этой связи, последовательность PEDF содержит ряд частично или полностью “скрытых” третичной структурой сайтов протеолиза MMP-2 и -9, в меньшей степени доступных для атаки матриксными металлопротеиназами. Вероятно, в результате действия MMP-2 и/или -9 происходит постепенная потеря третичной структуры молекулы PEDF, что делает доступными для ме-таллопротеиназ дополнительные внутренние связи. При полном протеолизе образуется множество пептидных продуктов, которые не проявляют антиангио-генной и нейротрофной активностей, хотя сохраняют способность связываться с внеклеточным матриксом. Таким образом, матриксные металлопротеиназы могут инактивировать PEDF тем же путем, что и в случае ингибиторных серпинов (например, антитрипсина и антитромбина III), действуя на реакционный центр петли и, предположительно, образуя с молекулой фактора устойчивый неактивный комплекс (хотя существование такого комплекса пока не обнаружено). Однако нельзя исключить возможность, что потеря PEDF его биологических активностей достигается путем постепенного полного протеолиза белка [83].

заключение

Белок PEDF интенсивно изучается в течение ряда лет, причем с каждым годом число этих исследований возрастает. Выявлено, что этот белок является

регулятором широкого спектра процессов, происходящих в клетках и тканях различных эукариотических организмов, в том числе человека. PEDF находится в центре внутриклеточных взаимодействий высокого уровня, и, возможно, еще не все узлы мета-болитических путей клетки, в которых он участвует, выявлены. Антипролиферативная, антиангиогенная, протекторная, дифференцирующая и другие активности PEDF представляют чрезвычайный интерес

не только с точки зрения фундаментальной науки, но и в свете возможного терапевтического использования этого белка при лечении различных заболеваний, в том числе нейродегенеративных поражений зрительной и нервной систем, а также опухолевых процессов.

Работа финансировалась Программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Tombran-Tink J., Johnson L.V. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1989. V. 30. P. 1700-1707.

2. Tombran-Tink J., Chader G.J., Johnson L.V. // Exp. Eye Res. 1991. V. 53. P. 411-414.

3. Steele F., Chader G.J., Johnson L.V., Tombran-Tink J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 1526-1530.

4. Pignolo R.J., Cristofalo V.J., Rotenberg M.O. // J. Biol. Chem.

1993. V. 268. P. 8949-8957.

5. Kozaki K., Miyaishi O., Koiwai O., et al. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 15125-15130.

6. Tombran-Tink J., Pawar H., Swaroop A., et al. // Genomics.

1994. V. 19. P. 266-272.

7. Goliath R., Tombran-Tink J., Rodriguez I.R., et al. // Mol. Vis. 1996. V. 2. P. 5.

8. Tombran-Tink J., Mazuruk K., Rodriguez I., et al. // Mol. Vis. 1996. V. 2. P. 11.

9. von Heijne G. // Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. P 4683-4690.

10. Stratikos E., Alberdi E., Gettins P.G., Becerra S.P. // Protein Sci. 1996. V. 5. P 2575-2582.

11. Ortego J., Escribano J., Becerra S.P, et al. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1996. V. 37. P. 2759-2767.

12. Petersen S.V., Valnickova Z., Enghild J.J. // Biochem. J. 2003. V. 374. P 199-206.

13. Tombran-Tink J., Shivaram S.M., Chader G.J., et al. // J. Neurosci. 1995. V. 15. P. 4992-5003.

14. Carrell R.W., Pemberton P.A., Boswell D.R. // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1987. V. 52. P. 527-535.

15. Irving J.A., Pike R.N., Lesk A.M., Whisstock J.C. // Genome Res. 2000. V. 10. P. 1845-1864.

16. Tombran-Tink J., Aparicio S., Xu X., et al. // J. Struct. Biol. 2005. V. 151. P 130-150.

17. Becerra S.P, Palmer I., Kumar A., et al. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P 23148-23156.

18. Huber R., Carrell R.W. // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 89518966.

19. Zhou A., Carrell R.W., Huntington J.A. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 27541-27547.

20. Becerra S.P, Sagasti A., Spinella P., Notario V. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 25992-25999.

21. Shao H., Schvartz I., Shaltiel S. // Eur. J. Biochem. 2003.

V. 270. P. 822-831.

22. Simonovic M., Gettins PG.W., Volz K. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 11131-11135.

23. Becerra S.P // Exp. Eye Res. 2006. V. 82. P. 739-740.

24. Alberdi E., Hyde C.C., Becerra S.P. // Biochemistry. 1998.

V. 37. P. 10643-10652.

25. Meyer C., Notari L., Becerra S.P // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 45400-45407.

26. Maik-Rachline G., Shaltiel S., Seger R. // Blood. 2005. V. 105. P. 670-678.

27. Gettins PG., Simonovic M., Volz K. // Biol. Chem. 2002.

V. 383. P. 1677-1682.

28. Pignolo R.J., Rotenberg M.O., Cristofalo V.J. // J. Cell.

Physiol. 1995. V. 162. P. 110-118.

29. Karakousis P., John C., Behling K., et al. // Mol. Vis. 2001.

V. 7. P. 154-163.

30. Tombran-Tink J., Shivaram S.M., Chader G.J., et al. // J. Neurosci. 1995. V. 15. P 4992-5003.

31. Isobe M., Emanuel B.S., Givol D., et al. // Nature. 1986. V. 320. P 84-86.

32. Jablonski M.M., Tombran-Tink J., Mrazek D.A.,

Iannaccone A. // J. Neurosci. 2000. V. 20. P. 7149-7157.

33. Crawford S.E., Stellmach V., Huang X., et al. // Cell Sci. 2001. V. 114. P 4421-4428.

34. Cheung L.W.T., Au S.C.L., Cheung A.N.Y., et al. // Endocrinology. 2006. V. 147. P 4179-4191.

35. Houenou L.J., D’Costa A.P, Linxi L., et al. // J. Comp. Neurol. 1999. V. 412. P 506-514.

36. Jablonski M.M., Tombran-Tink J., Mrazek D.A.,

Iannaccone A. // Glia. 2001. V. 35. P. 14-25.

37. Sugita Y., Becerra S.P, Chader G.J., Schwartz J.P. // J. Neurosci. Res. 1997. V. 49. P. 710-718.

38. Brodeur G.M. // New Engl. J. Med. 1996. V. 334. P. 1537-1539.

39. Phillips N.J., Ziegler M., Radford D.M., et al. // Cancer Res.

1996. V. 56. P 606-611.

40. Malchiodi-Albedi F., Feher J., Caiazza S., et al. // Int. J. Dev. Neurosci. 1998. V. 16. P 423-432.

41. Guillery R.W. // Trends Neurosci. 1986. V. 9. P. 364-367.

42. Abul-Hassan K., Walmsley R., Tombran-Tink J., Boulton M. // Pigment Cell Res. 2000. V. 13. P 436-441.

43. Cao W., Tombran-Tink J., Chen W., et al. // J. Neurosci. Res. 1999. V. 57. P 789-800.

44. Ho T.C., Yang Y.C., Cheng H.C., et al. // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 2006. V. 342. P. 372-378.

45. Taniwaki T., Becerra S.P, Chader G.J., Schwartz J.P// J. Neurochem. 1995. V. 64. P 2509-2517.

46. Araki T., Taniwaki T., Becerra S.P., et al. // J. Neurosci. Res.

1998. V. 53. P. 7-15.

47. Taniwaki T., Hirashima N., Becerra S.P, et al. // J. Neurochem. 1997. V. 68. P. 26-32.

48. DeCoster M.A., Schabelman E., Tombran-Tink J., Bazan N.G./ / J. Neurosci. Res. 1999. V. 56. P. 604-610.

49. Bilak M.M., Corse A.M., Bilak S.R., et al. // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1999. V. 58. P. 719-728.

50. Yabe T., Wilson D., Schwartz J.P. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 43313-43319.

51. Dawson D.W., Volpert O.V., Gillis P, et al. // Science. 1999.

V. 285. P. 245-248.

52. Ferrara N., Davis-Smyth T. // Endocr. Rev. 1997. V. 18. P. 4-25.

53. Klagsbrun M., Vlodavsky I. // Prog. Clin. and Biol. Res. 1988. V. 266. P. 55-61.

54. O’Reilly M.S., Holmgren L., Shing Y., et al. // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1994. V. 59. P. 471-482.

55. DiPietro L.A., Nebgen D.R., Polverini P.J. // J. Vasc. Res.

1994. V. 31. P 178-185.

56. Smith L.E., Wesolowski E., McLellan A., et al. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1994. V. 35. P 101-111.

57. Stellmach V., Crawford S., Zhou W., Bouck N. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P 2593-2597.

58. Bouck N. // Trends Mol. Med. 2002. V. 8. P. 330-334.

59. Volpert O.V., Zaichuk T., Zhou W., et al. // Nat. Med. 2002.

V. 8. P 349-357.

60. Gerber H.P, Dixit V., Ferrara N. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 13313-13316.

61. Aoudjit F., Vuori K. // J. Cell. Biol. 2001. V. 152. P. 633-644.

62. Barreiro R., Schadlu R., Herndon J., et al. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2003. V. 44. P. 1282-1286.

63. Mori K., Duh E., Gehlbach P, et al. // J. Cell Physiol. 2001.

V. 188. P. 253-263.

64. Chen L., Zhang S., Barnstable C.J., Tombran-Tink J.// Biochem. and Biophys. Res. Commun. 2006. V. 348. P 1288-1295.

65. Mayo L.D., Kessler K.M., Pincheira R., et al. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 25184-25189.

66. Read M.A., Whitley M.Z., Gupta S., et al. // J. Biol. Chem.

1997. V. 272. P 2753-2761.

67. Rousseau S., Houle F., Landry J., Huot J. // Oncogene. 1997.

V. 15. P. 2169-2177.

68. Hutchings H., Maitre-Boube M., Tombran-Tink J.,

Plouet J. // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 2002. V. 294.

P. 764-769.

69. Wu Y.Q., Notario V., Chader G.J., Becerra S.P // Protein Expr. Purif. 1995. V. 6. P. 447-456.

70. Alberdi E., Aymerich M.S., Becerra S.P. // J. Biol. Chem.

1999. V. 274. P. 31605-31612.

71. Aymerich M.S., Alberdi E.M., Martinez A., Becerra S.P. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2001. V. 42. P З2Я7—З29З.

72. Notari L., Baladron V., Aroca-Aguilar J.D., et al. // J. Biol. Chem. 2006. V. 2Я1. P. ЗЯ022—ЗЯ0З7.

73. Gettins P.G., Simonovic M., Volz K. // Biol. Chem. 2002.

V. ЗЯЗ. P. 1677—16Я2.

74. Goetzl E.J., Tigyi G. J. // Cell. Biochem. 2004. V. 92. P Я 67— Я6Я.

75. Balsinde J., Winstead M.V., Dennis E.A. // FEBS Lett. 2002.

V. 531. P. 2—6.

76. SanGiovanni J.P, Chew E.Y. // Prog. Retin. Eye Res. 2005.

V. 24. P Я7—1ЗЯ.

77. Kim H.Y., Akbar M., Kim K.Y. // J. Mol. Neurosci. 2001. V. 16. P 279—2Я4.

7Я. Rose D.P., Connolly J.M. // Pharmacol. Ther. 1999. V. ЯЗ.

P. 217—244.

79. Rose D.P., Connolly J.M. // Int. J. Oncol. 1999. V. 15. P. 1011— 1015.

Я0. Jenkins C.M., Mancuso D.J., Yan W., et al. // J. Biol. Chem.

2004. V. 279. P 4Я96Я—4Я975.

Я1. Bazan N.G., Marcheselli V.L., Hu J., et al. // Invest.

Ophthalmol. Vis. Sci. 2005. V. 46. P 167.

Я2. Marcheselli V.L., Bazan N.G., Hu J., et al. Program 14Я.9.

Washington, D.C.: Society for Neuroscience, 2005.

Я3. Notari L., Miller A., Martinez A., et al. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2005. V. 46. P 2736—2747.