CC BY
25
УДК 619:611-018:636.97
патоморфологические реакции в лимфоузлах, вызванные Mycobacterium bovis на фоне воздействия иммуномодулятора
Т.С. ДУДОЛАДОВА, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
B.C. ВЛАСЕНКО, доктор биологических наук, зав. лабораторией
Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных, ул. Лермонтова, 93, Омск, 644001, Россия E-mail: [email protected]
Резюме. В работе показаны особенности реакции паховых лимфатических узлов морских свинок при экспериментальном туберкулезе и под действием комплексного иммуномодулятора микробного происхождения КИМ-М2 при разной кратности его введения. С целью изучения влияния этого препарата на регионарные лимфатические узлы морскихсвинокприэкспериментальном инфицировании Mycobacterium bovis шт. 14 было отобрано 20 животных, из которых сформировали 4 группы. У морских свинок, экспериментально инфицированных патогенными микобак-териями без предварительного введения КИМ-М2 (контрольная группа), патоморфологические изменения в паховых лимфоузлах соответствовали генерализованной форме туберкулеза с индек-сомпораженностипоА.И. Тогуновойна30сут. -5,67. Трехкратное введение иммуномодулятора в нарастающей дозе с коротким интервалом между инъекциями тормозило формирование противотуберкулезного иммунитета (индекс пораженности составил 5,0). Изменения характеризовались наличием обширных очагов некроза в узле с формирующейся вокруг них соединительнотканной капсулой, при этом лимфоидные фолликулы практически не дифференцировались, а основную массу составляли разрастающаяся соединительная ткань, пролиферирующие эпителиоидные и гигантские клетки, не отграниченные валом из лимфоцитов от окружающей здоровой ткани. При двух- и однократном введении препарата защитная функция организма более выражена, о чем свидетельствовало нарастание пролиферативных процессов эпи-телиоидных клеток и клеток ретикулоэндотелиальной системы, а также отсутствие в лимфатическихузлахобширных очагов некроза (индекс пораженности составил 3,8 и 3,75 соответственно). Это доказывает положительное влияние КИМ-М2 на регионарные лимфоузлы морских свинок при экспериментальном туберкулезе. Ключевые слова: лимфатический узел, морская свинка, туберкулез, патоморфологические и гистологические исследования. Для цитирования: Дудоладова Т.С., Власенко В.С. Патоморфоло-гические реакции в лимфоузлах, вызванные Mycobacterium bovis на фоне воздействия иммуномодулятора //Достижения науки и техники АПК. 2015. Т.29. №4. С. 75-76.
Среди иммуномодуляторов, используемых в ветеринарной медицине, эффективны конъюгаты, приготовленные на основе антигенов БЦЖ и синтетических полиэлектролитов, обладающие протективными свойствами. К числутаких препаратов относится комплексный иммуномодулятор микробного происхождения КИМ-М2, разработанный во ВНИИБТЖ [1].
Специальными исследованиями установлена особая роль лимфатических узлов в иммунопатогенезе туберкулеза [2]. В наибольшем количестве и раньше всего антиген поступает в регионарный лимфатический узел [3], в котором происходит локальная антиген-обусловленная клональная клеточная пролиферация [4]. Следовательно, иммунитет инициируется в регионарном лимфатическом узле. В нем на клетках стромы в наибольших количествах фиксируются антигены, антитела и иммунные комплексы, а в лимфоидной ткани продуцируются лимфокины и депонируются антитела.
Цель нашей работы - определить влияние комплексного иммуномодулятора КИМ-М2 на регионарные
лимфатические узлы морских свинок, экспериментально зараженных туберкулезом.
Условия, материалы и методы. Исследования проводили на животных [5], которых содержали в виварии ФГБНУ ВНИИБТЖ в заразной зоне, в стандартных условиях; кормление осуществляли согласно нормам рациона. За подопытными особями вели постоянное наблюдение [6].
Схема опыта предусматривала формирование 4 опытных группы по 5 гол. в каждой. В первой группе морским свинкам вводили КИМ-М2 в дозе 125 мкг, через 15 сут. -250 мкг, через 30 сут. - 500 мкг, через 30 сут. M. bovis шт.14 в дозе 0,001 мг/мл; во второй - КИМ-М2 в дозе 250 мкг, через 30 сут. - 500 мкг, через 30 сут. M. bovis в дозе 0,001 мг/мл; в третьей - КИМ-М2 - 500 мкг, через 30 сут. M. bovis в дозе 0,001 мг/мл; в четвертой (контрольной) группе - M. bovis в дозе 0,001 мг/мл подкожно.
Комплекс антигенов для конъюгации с полиэлектролитами (ПВП и ПЭГ) для приготовления КИМ-М2 выделяли из культуры вакцинного штамма БЦЖ, которую выращивали на среде Сотона, подвергали ультразвуковой дезинтеграции. Полученную взвесь центрифугировали и в надосадочной жидкости определяли содержание белка биуретовой пробой на фотометре-5010 V5+. В составе 99,3 мл раствора содержится: 100 мг белка; 0,7 мл 37%-ного медицинского формальдегида; 40000 мг ПВП и 10000 мг ПЭГ [7].
Исследования проводили в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами [8, 9] и рекомендациями [10]. Через 30 сут. после инфицирования животных выводили из эксперимента путем декапитации (под эфирным наркозом) и подвергали тотальному обескровливанию. Индекс пораженности органов морских свинок определяли по А.И. Тогуновой [11].
Гистологические исследования проводили на паховых лимфатических узлах, которые фиксировали в 10%-ном нейтральном растворе формалина на фосфатном буфере. Материал заливали в парафин по общепринятой методике с использованием станции пробоподготовки STP-120 и станции заливки парафином EC-350. На микротомах санного и роторного типа готовили срезы толщиной 3-5 мкм, размещали на стандартных по толщине предметных стеклах с последующей окраской гематоксилином и эозином. После окраски срезы заключали в синтетическую среду BioMount и покрывали стандартными покровными стеклами. Микрофотосъемку гистологических препаратов осуществляли на микроскопе AxioImager A1 в программе AxioVisionrev.4.7.
результаты и обсуждение. При гистологическом исследовании места введения культуры у животных, зараженных М. bovis (контроль) в подкожной жировой клетчатке и регионарном лимфатическом узле, выявлено формирование множественных сливающихся гранулем и намечающаяся общая капсула. Центр гранулем представлял собой некроз, состоящий из центрально расположенного детрита из распавшихся кариорексисом ядер нейтрофилов, небольших скоплений фибрина. Образовавшиеся некрозы были окружены эпителиоидными и гигантскими клетками. Окружающая подкожная клетчатка инфильтрирована сегментоядерными нейтрофилами, макрофагами и лимфоидными клетками. Регионарные к месту заражения лимфатические узлы имели аналогичные грану-
Достижения науки и техники АПК. 2015. Т. 29. № 4
75
лемы, как правило, лежащие в корковом слое. Индекс пораженности по А.И. Тогуновой составил 5,67.
При микроскопическом исследовании лимфатических узлов наблюдали увеличение в объеме лимфоидных фолликулов коркового вещества. Их центральная часть выглядела светлее вследствиетого, что состояла из более крупных клеток с большими светлыми ядрами - герминативными центрами, которые занимали 56,2% площади всего фолликула. В центральной части герминативных центров встречали лейкоциты на разных стадиях некробиоза и некроза, в связи с этим регистрировали повышение активности макрофагов, которые захватывают и фагоцитируют погибающие клетки. Синусы расширены, их эндотелий набухший, местами слущен.
При микроскопическом исследовании лимфатических узлов животных I группы (3-х кратное введение КИМ-М2) наблюдали расширенные синусы с набухшим эндотелием, слой частично слущен. Установлено разрастание волокнистой соединительной ткани в органе и замещение ею паренхимы. Выявлены обширные очаги некроза в узле с формирующейся вокруг них соединительнотканной капсулой. При этом лимфоидные фолликулы практически не дифференцировались, а основную массу составляли разрастающаяся соединительная ткань, пролиферирующие эпителиоидные и гигантские клетки, не отграниченные валом из лимфоцитов от окружающей здоровой ткани. Размножающиеся клетки сдавливали лимфоидные фолликулы коркового вещества, приводя к их атрофии. Регистрировали утолщение стенок кровеносных сосудов (склероз). Индекс пораженности по А.И. Тогуновой - 5,0.
При микроскопическом исследовании региональных лимфатических узлов у животных II и III групп (двух- и однократное введение КИМ-М2). Наблюдали тенденцию нарас-
тания пролиферативных процессов эпителиоидных клеток и клеток ретикулоэндотелиальной системы. Размножающиеся клетки приводили к атрофии корковой зоны, в связи с чем лимфоидные фолликулы трудно дифференцировались или полностью отсутствовали. Мелкие кровеносные сосуды были переполнены кровью. Наблюдалось разрастание волокнистой соединительной ткани в паренхиме узла, но в отличие от животных I группы в лимфатических узлах отсутствовали обширные очаги некроза, что может свидетельствовать об их более выраженной защитной функции. Индекс пораженности у особей II и III опытных групп составлял 3,8 и 3,75 соответственно.
Результаты патоморфологических исследований подтверждены аллергическими, бактериологическими и иммунологическими методами.
выводы. Патоморфологические изменения, вызываемые микобактериями типичной формой M.bovis в органах, соответствовали генерализованной форме туберкулеза. Индекс пораженности по А.И. Тогуновой на 30 сут. после инъекции был равен 5,67.
Трехкратное введение КИМ-М2 с коротким интервалом между инъекциями в нарастающей дозе тормозит формирование противотуберкулезного иммунитета, однако при двух- и однократном введении иммуномодулятора защитная функция организма была более выражена.
Однотипная клеточная воспалительная реакция у морских свинок, только зараженных микобактериями М. bovis (контроль) и привитых КИМ-М2 в разных дозах и кратности введения (опытные группы), характеризуется развитием катарально-гнойного воспаления в месте введения культуры и пролиферацией ретикуло-эндотелиальных элементов стромы в лимфатических узлах.
Литература.
1. Способ получения специфического иммуномодулятора / М.А. Бажин, B.C. Власенко, А.Н. Новиков, Г.П. Неворотова, Е.М. Шулико, Т.С. Реутова//Интеллектуальная собственность. Промышленная собственность. 2010. № 5. С. 67.
2. Weissler J.C. Tuberulosis. Immunophatogenesis and therapy//Amer. J. Med. Sci. 1993. V. 305. N 1. P. 52-65.
3. Fojtasek M.F. et al Local immunity in lung-associated lymph nodes in a murine model of pulmonary histoplasmosis // Infect. and Immun. 1993. V. 61. N 11. P. 4607-4615.
4. Meyer E.M. Zur functio. nellen Bedeutung der histologizchen Lymphknotenreactionen // Klin. Wschr. 1982. B. 60. N 6. P. 265-273.
5. Правила работы с использованием экспериментальных животных (Приложения к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977г. №755).
6. Батрак Г.Е., Кудрин А.Н. Дозирование лекарственных средств экспериментальным животным. М.: Медицина, 1979. 168 с.
7. Пат. 2478399 РФ. Способ получения специфического иммуномодулятора / Бажин М.А., Новиков А.Н., Власенко В.С., Неворотова Г.П., Петров С.Ю., Шулико Е.М., Назарова В.А. - № 2011124695; заявл. 16.06.11; опубл. 10.04.13, Бюл. № 10. - 12 с.
8. Санитарно-эпидемиологические правила (СП 1.3.2322-08) «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV группы патогенности и возбудителями паразитарных болезней» М. - 2008.
9. Санитарно-эпидемиологические правила (СП 1.3.2322-08) «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-lV группы патогенности» М. - 2008.
10. Рекомендации «Лабораторнаядиагностика туберкулеза», 1988; МУ 1.3.1888-04.
11. Тогунова А.И. Туберкулез // Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней. М.: «Медицина», 1964. 422 с.
PATHOMORPHOLOGICAL REACTIONS IN LYMPH NODES CAuSED BY MYCOBACTERIuM BOVIS AGAINST The BACKGROuND OF IMMuNOMODuLATOR ACTION
T.S. Dudoladova, V.S. Vlasenko
All-Russian Research Institute of brucellosis and tuberculosis of animals, Lermontov str., 93, Omsk, 644001, Russia Summary. The article presents the features of the reaction of inguinal lymph nodes of guinea pigs during experimental tuberculosis and under the influence of complex microbial immunomodulator KIM-M2 at different multiplicities of its introduction. We selected 20 animals and formed four groups to study the effect of this drug on the regional lymph nodes of guinea pigs experimentally infected with Mycobacterium bovis strain 14. In guinea pigs experimentally infected by pathogenic mycobacteria without preliminary administration of KIM-M2 (control group) pathomorphological changes in the inguinal lymph nodes corresponded to the generalised form of tuberculosis with affect index according to A. I .Togunova on 30 days equal to 5.67. The triple injection of the immunomodulator in increasing doses with short intervals between injections inhibited the formation of antituberculous immunity (affect index was 5.0). The changes were characterized by extensive necrosis in the node with connective tissue capsule forming around it, at that the lymphoid follicles virtually did not differentiate, and the bulk was composed of growing connective tissue, proliferating epithelioid and giant cells, not delimited by lymphocytes from the surrounding healthy tissue. The protective function of the body is more expressive with double and single administration of the drug, which is indicated by the increase in proliferative processes of epithelioid cells and cells of the reticuloendothelial system, as well as the lack of extensive necrosis in lymph nodes (affect index was 3.8 and 3.75, respectively). Thus, there was proved the positive influence of KIM-M2 on regional lymph nodes of guinea pigs with experimental tuberculosis. Keywords: lymph node, guinea pig, tuberculosis, pathomorphological and histological studies.
Author Details: T.S. Dudoladova, Cand. Sc. (Biol.), Senior Researcher (e-mail: [email protected]); V.S. Vlasenko, Dr. Sc. (Biol.), Head of Laboratory
For citation: Dudoladova T.S., Vlasenko V.S. Pathomorphological reactions in lymph nodes caused by Mycobacterium bovis against the background of immunomodulator action. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2015. T.29. №4. pp. 75-76 (In Russ)
76
Достижения науки и техники АПК. 2015. Т 29. № 4
