CC BY
32
МУТАГЕНЕЗ И КАНЦЕРОГЕНЕЗ
Е.Д. Гаврилова1,
О.В. Антоненко1,
Л.А. Васильева12
1 Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск;
2 Новосибирский государственный университет, кафедра цитологии и генетики
$§ Исследован феномен возрастания скоростей индукции транспозиций МГЭ412 у потомков самцов, обработанных различными дозами паров этанола. Показано, что по сравнению с контролем (А,к =1,84х10'3) скорость транспозиций при обработке самцов парами этанола в течение 1,5 минут увеличивалась до А,=3,79х10'2, при обработке в течение 2-х минут - Х=6,89х10'2, в течение 3-х минут - А,=6,29х10‘2. Констатировано, что эксперименты с предельной алкоголизацией должны заканчиваться либо гибелью особей, либо вспышками генетической изменчивости в их потомстве. Таким образом доказано, что этанол наряду с другими стрессовыми факторами, является достаточно мощным индуктором транспозиций МГЭ у дрозофилы.
Ключевые слова: мобильный генетический элемент (МГЭ), пары этанола, транспозиции, изогенная линия, сайт.
ПАРЫ ЭТАНОЛА ИНДУЦИРУЮТ ТРАНСПОЗИЦИИ МГЭ412 У DROSOPHILA MELANOGASTER
ВВЕДЕНИЕ
Мобильные генетические элементы (МГЭ) обнаружены во многих исследованных геномах эукариот. Одной из основных характеристик МГЭ является их способность к перемещениям в различные участки генома. Именно это их свойство является причиной инсерционного мутагенеза. Ранее было показано, что внешние стрессовые факторы, такие как тепловой и Холодовой шок, у-облучение и внутригеномные стрессовые факторы (аутбридинг, индбридинг, изогенизация, селекция) индуцируют перемещение мобильных генетических элементов [2, 5, 6, 7, 11, 12]. При этом скорость индуцированных транспозиций возрастает на 2-
3 порядка по сравнению со спонтанной скоростью. В компактном виде полученные результаты можно представить в виде табл. 1.
Мы продолжили исследование роли внешних стрессовых факторов в индукции транспозиций мобильных генетических элементов в геноме D. melanogaster. В данной работе в качестве фактора, вызывающего индукцию транспозиций мобильного генетического элемента Dm412, использованы различные дозы паров этанола.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Изогенная линия. Эксперимент осуществлялся на изогенной линии №51 Drosophila melanogaster, которая была выведена в 1991 году из гетерогенной линии (riC), несущей менделевскую мутацию radius incompletus (ri). Линия riC ранее использована в различных экспериментах и описана в работах Васильевой и соавт. [12,13]. Изогенизация осуществлялась путем скрещивания одного самца или одной самки из линии riC с особью из балансерной линии. Конкретная балансерная линия была выведена в лаборатории и содержала запиратели кроссинговера на трех больших хромосомах, маркированных доминантными мутациями: М5 (Х-хромосома), Су/Pm (2-я хромосома) и D/Sb (3-я хромосома) [9]. Изогенная линия № 51 также неоднократно использована нами ранее в исследованиях явлений индукции транспозиций мобильных генетических элементов [2, 6, 12]. Линия легко откликается на стрессовые воздействия, а при наличии индуцированного стрессом генетического разнообразия — на селекцию по количественному признаку [4].
Обработка самцов дрозофилы парами этанола. При обработке самцов дрозофилы парами этанола в начале необходимо было подобрать дозу, которая не была бы смертельной для мух, но в то же время эффективной. Трудность состояла в том, что при предъявлении самцам любой дозы паров этанола они засыпали и не просыпались достаточно длительное время. В процессе подбора времени экспонирования выяснилось, что обработка самцов более 5-ти минут смертельна [5]. При обработке в течение 4-5 минут погибает часть самцов. Поэтому были выбраны одновременно
Таблица 1
Оценки скоростей транспозиций МГЭ412 до и после индукции транспозий различными факторами
более щадящие, но в то же время эффективные дозы обработки 1.5, 2 и 3 минуты. При таких дозах все самцы также засыпали, но все просыпались через 2-3 часа.
Три десятка самцов изогенной линии № 51 помещали в чистые пустые пробирки при 25°С, закрытые пипеткой с резервуаром для жидкости, в котором находилась вата, смоченная этанолом. Пары спирта проникали в пробирку по каналу пипетки. Мерой дозы служило время экспонирования: 1.5, 2 и 3 минуты. Затем самцов сразу переносили в другие чистые пробирки без паров этанола, что позволило четко ограничить временную дозу экспонирования.
Через двое суток после воздействия обработанных самцов скрещивали с необработанными самками той же линии в пропорции 1СҐх5? в пробирки с питательной средой. Из личинок-потомков F1 приготавливали давленые препараты политенных хромосом слюнных желез, на которых выявляли рисунок локализации копий МГЭ412 путем гибридизации in situ.
В качестве контроля использовали такие же скре-щевания при тех же условиях, но самцы при этом не были обработаны парами этанола. Контрольная выборка представлена 27-ю препаратами, объем опытной выборки составил 53 препарата.
Гибридизация in situ. Гибридизацию выполняли по стандартной методике [9, 10, 12]. Зонд содержал 3Н-ДНК клона pOR708, которая имела встроенную полноразмерную копию МГЭ412 в векторе рАТ153 [11] (клон получен от К. О'Наге). Зонд гибридизовали с ДНК политенных хромосом на давленых препаратах клеток слюнных желез личинок-потомков, полученных от скрещивания обработанных парами этанола самцов с виргинными необработанными самками.
Препараты в фотоэмульсии экспонировали в течение 15-30 суток. Далее исследовали включение радиактив-ной метки в сегменты политенных хромосом карты Бриджеса. Обнаруженные новые сайты локализации МГЭ можно было считать инсерциями транспозиций.
Статистический анализ. Оценку скоростей индуцированных транспозиций, X, проводили согласно формуле (Ратнер, Васильева 1996):
тхп
п = п-----,
т
где Ап — среднее число транспозиций на гаплоидный геном за поколение; п — число сайтов, занятых копиями МГЭ в исходной изогенной линии, не подвергавшейся стрессовому воздействию; т — число сайтов, которые были заняты МГЭ412 в каком-либо из экспериментов с линией riC и ее производными; (т-п) — число вакантных сайтов в данной изогенной линии для данного МГЭ; X—искомая скорость транспозиций (событий) на сайт, на геном, за поколение.
Важно отметить, что таким способом можно провести только нижнюю оценку скорости индуцированных транспозиций, поскольку в качестве т было принято число позиций в геноме, которые оказывались занятыми данным МГЭ, хотя бы в одном из предыдущих экспериментов, следовательно:
^ _ Апхт пх(т-п)
Статистическую значимость различий между частотами транспозиций в опытном и контрольном вариантах определяли при помощи критерия Фишера F [3], разработанного для оценки достоверности различий частот с низкими значениями и выраженных в радианах углов, по формуле: ф = 2arcsin ~{~р.
Тогда критерий Фишера:
г, , k.xk.
где и &2 — размеры сравниваемых выборок. В данном случае к = (число личинок) х (число сайтов), поскольку оценивается скорость транспозиций на сайт исходной изогенной линии, ф, и (р2 берется в стандартных таблицах для соответствующих рх и рг.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты индукции транспозиций МГЭ412 до и после обработки самцов дрозофилы парами этанола представлены в табл. 2. В левом столбце таблицы представлены данные по гибридизации in situ в исходной изогенной линии, где изначально зафиксировано 32 стабильных сайта. Следует заметить, что в течение нескольких лет такое число сайтов и их мономорф-ность оставались неизменными, однако обработка этанолом самцов этой линии резко меняет картину.
Стрессовые факторы А. (скорость транспозиций на сайт, на геном) Авторы, годы
Линия 51 (изогенная) Контроль Аутбридинг Инбридинг Двойной рекомбинантный перенос 1,8x10-’ 6,9x10 1 2,07x10-' 1,87x10-' Васильева и др., 1998 г.
Тяжелый температурный шок Холодовой шок Тепловой шок 3,8х102 1,16x10 1 Бубенщикова и др., 1,46x10 1
Линия 49 (изогенная) Контроль у-облучение 300Р 800Р 1300Р <3,31x10 5 0,39x102 1,05x10-2 1,87x10-2 Забанов и др., 1995 г.
Таблица 2
Паттерн МГЭ412 до и после обработки самцов дрозофилы парами этанола
Сайты Время обработки Суммарное
Хромосомы политенных хромосом Контроль (N=27) 1,5 мин (N=21) 2 мин (N=13) 3 мин (N=19) число личинок с транспозициями (N=53)
X 6Е + + + + +
12В - *(1) *(1) - *(2)
16Р + + + + +
17С + + + + +
19А + + + + +
20А + + + + +
2Ь 2 Ю + + + + +
24Е + + + + +
25 Р + + + + +
26С + + + + +
30А + + + + +
32С + + + + +
34В - *(1) - *(2) *(3)
36Е - - - *(1) *(1)
39С + + + + +
ж 42В - *(1) - - *(1)
42Е + + + + +
42Р + + + + +
43В - *(1) *(3) *(2) *(6)
43И - - *(1) - *(1)
45С + + + + +
47В - - *(1) *(2) *(3)
48В - - *(1) - *(1)
49С + + + + +
5Ш - _ *(1) *(2) *(3)
56В - *(3) *(2) *(1) "(6)
56Е - *(3) *(4) *(4) "(11)
57В - - *(1) _ *(1)
60С + + + + +
зь 62Р - - *0) _ *(1)
64А + + + + +
65А - _ *(1) - *(1)
65Е + + + + +
670Е + + + + +
75А + + + + +
75С - *(1) *(1) *(3) "(5)
76А + + + + +
ЗЯ 82Е + + + + +
84Э + + + + +
85Е + + + + +
88Е + + + + +
88Р + + + + +
90В + + + + +
96А + + + + +
970Е - *(5) - *(3) *(8)
98СЭ + + + + +
99А + + + + +
99В + + + + +
100В - - - *(4) *(4)
Всего сайтов 32 40 44 42 49
Число новых сайтов <1 8 12 10 17
Всего событий <1 16 18 24 58
Среднее число событий на геном Ап 0,037 0,762 1,385 1,263 1,283
Скорость транспозиций на сайт на геном, X 1,84x10 3 3,79х10-2 6,89х10“: 6,29х10-2 6,39х10”2
Примечание: «+» — означает стабильное присутствие МГЭ412 в данном сайте карты Бриджеса; «-» — отсутствие метки в данном сайте; *() — число инсерций транспозиций в данном сайте.
Результаты обработки самцов парами этанола в течение 1.5, 2 и 3 минут представлены в табл. 2 в столбцах 2-4 соответственно. После 1,5-минутного воздействия этанолом в выборке из 21-й личинки выявлено 16 транспозиций в 8-ми сегментах (сайтах). Более половины транспозиций (11 из 16) зафиксированы в трех сайтах: 56В (3 события), 56Е (3 события) и 97DE (5 событий). Такая высокая частота инсерций позволяет эти сайты занести в список «горячих», по крайней мере, для данной выборки [2, 11]. После 2-минутной обработки в выборке из 13-ти личинок обнаружено 18 транспозиций в 12-ти новых сайтах. Из них сайт 43В (3 события) и сайт 56Е (4 события) могут претендовать на звание «горячих». Выборка из 19-ти личинок после 3-минутной обработки содержит 24 инсер-ции в 10 сайтах. Причем обнаружены явные признаки преобладания транспозиций в сайтах 56Е (4 события), 75С (3 события), 97DE (3 события) и 100В (4 события).
Суммарные результаты по трем экспериментам представлены в последнем столбце табл. 2. Всего в выборке, состоящей из 53-х личинок, обнаружено 58 транспозиций в 17-ти сайтах. Почти половина транспозиций сосредоточена в четырех сегментах (43В, 56В, 56Е и 75С), которые встречаются с достаточно высокой частотой во всех трех экспериментальных выборках независимо от продолжительности обработки самцов парами этанола. Представляется важным подчеркнуть тот факт, что некоторые из перечисленных сайтов являлись «горячими» при индукции транспозиций и различными температурными воздействиями [2,12].
Кроме того, к списку «горячих» новых сайтов следует отнести сайты 34В, 97DE, 100В, транспозиции в которых встречаются с высокой частотой, но в отдельных выборках. Эти сайты также проявляли свойства «горячих» в других экспериментах по индукции транспозиций [1, 2, 12]. Этот факт позволяет предположить, что в основе индукции парами этанола лежат механизмы, сходные по своему действию с таковыми и при температурных воздействиях; по-видимому, у дрозофилы существует общая система генерализованного ответа на стрессовые воздействия. Оценки скоростей транспозиций в опыте для 1.5, 2 и 3 минут представлены в последней строке табл. 2 и имели значения: 3,79х10~2, 6,89x10 ^ и 6,29х10"2 соответственно, а в контроле ^.к = 1,84x10 3, т.е. значение скоростей транспозиций в опыте на порядок выше возможной максимальной скорости спонтанных транспозиций.
В табл. 3 приведено значение частоты транспозиций МГЭ412 до обработки самцов изогенной линии № 51 парами этанола при допущении, что существует возможность появления хотя бы одной транспо-зициии, т. е. максимально возможная оценка часто-
Таблица 3
Оценка частот транспозиций до и после обработки самцов дрозофилы парами этанола
Признак Частота транспозиций до обработки, контроль Время обработки самцов дрозофилы парами этанола
1.5 мин 2,0 мин 3,0 мин
Частота инсерций транспозиций, р 0,00006 0,001 0,002 0,002
Частота транспозиций, выраженная в радианах углов, ф 0,0155 0,0632 0,0895 0,0895
Примечание: FrJi} =16,1, Р>0,999;FkI2 =28,8 , /^>0,999;Ft 5/20=3,0, Р<0,95; F, 5/3 0= 3,0, /-<0,95; F2 0/3 0=0, Р<0,95.
ты спонтанных транспозий, а также частоты транспозиций в опыте. Как видно, различия между частотами в опыте и контроле достоверны (/'>0,999). Достоверных различий между частотами появления транспозиций при обработке самцов дрозофилы различными дозами паров этанола не обнаружено. По-видимому, уже самая непродолжительная обработка самцов парами этанола является ощутимым стрессом, приводящим к существенному увеличению скорости транспозиций. Тем не менее существование дозового эффекта требует более обстоятельного исследования.
Таким образом, доказано, что этанол, наряду с другими внешними стрессовыми факторами, является достаточно мощным индуктором транспозиций МГЭ у дрозофилы, ответственным за возникновение новой генетической изменчивости в потомстве родителей, подвергнутых воздействию алкоголя.
Работа частично поддержана грантам РФФИ № 03-04-49609, грантом Минобразования РФ по фундаментальным исследованиям в области естественных наук № Е02-6.0-48 и грантом по Программе «Фундаментальные исследования» Президиума РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека» № 24.
Литература
1. Аникеева Н. В., Забапов С. А., Васильева Л. А. и др. Влияние теплового шока на транспозиции МГЭОт412 в трех изогенных линиях Drosophila melanogaster // Генетика. — 1994. — Т. 30, —№2,—С. 212-217.
2. Бубепщикова Е.В., Антипенко О.В., Васильева Л.А. и др. Индукция транспозиций МГЭ412 раздельно тепловым и Холодовым шоком в сперматогенезе у самцов дрозофилы // Генетика. — 2002. -- Т. 38. — № 1. — С. 46-55.
3. ВасильеваЛ.А. Биологическая статистика. — Новосибирск, 2000.
4. Васильева Л. А., Бубенщикова Е.В., Антоненко О.В. и др. Отклик паттерна МГЭ412 на отсекающий отбор количественного признака в изогенной линии дрозофил после тяжелого теплового шока (ТТШ) // Генетика. — 2000. — Т. 36. — № 6. — С. 774-781.
5. Васильева Л. А., Ратнер В. А., Антоненко О.В. и др. Индукция транспозиций МГЭ412 различными дозами паров этанола в изо-генной линии Drosophila raelanogaster // Генетика. — 2003. — Т. 39. — № 5. — С. 717-720.
6. Васильева Л. А., Ратнер В.А., Бубенщикова ЕВ. Стрессовая индукция транспозиций ретротранспозонов дрозофилы: реальность явления, характерные особенности и возможная роль в быстой эволюции // Генетика. — 1997. — Т. 33. — № 8. — С. 1083-1093.
7. Забанов С. А., Васильева Л. А., Ратнер В. А. Индукция транспозиций МГЭ412 при помощи у-облучения в изогенной линии D. melano-gasterllГенетика, — 1995, — Т. 31,—№6, —С. 798-803.
8. Ратнер В. А., Васильева Л. А. Мобильные генетические элементы (МГЭ): «эгоистическая ДНК» или функциональная часть генома? // Современные концепции эволюционной генетике / Ред. В.К. Шумный, А.Л. Маркель. — Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, 2000, —С. 128-150
9. AshburnerМ. Drosophila: ALaboratoryhandbook.N.Y.:ColdSpring Harbor Press. —1989,1331.
10. Finnegan D.J., Rubin G.M., Young H.M. et al. Repeated gene families in Drosophila melanogaster // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. — 1978. — Vol. 2d. — P. 225-294.
11. Shepherd B.M., Finnegan D.J. Structure of circular copies of the 412 transposable element present in Drosophila melanogaster tissue culture cells and isolation of terminal repeats // J. Mol. Biol. — 1984. — Vol. 180. — P. 21^10.
12. Vasilyeva L.A., Bubenshchikova E.V., Ratner V.A. Heavy heat shock induced retrotransposon transpositions in Drosophila // Genet. Res. Cambr. — 1999. — Vol. 74., N 2. — P. 111-119.
13. Vasilyeva L.A., Zabanov S.A., Ratner V.A. et.al. Expression of the quantitative character radius incompletus, temperature effects, and localization of mobile genetic element Dm-412 in D. melanogaster // Genet. Sel. Evol. — 1998. — Vol. 20., N 2. — P. 159-180.
Steams of ethanol induct transpositions of the MGE412 in isogenic lines of Drosophila melanogaster
E D. Gavrilovava', O. V. AntonenkoL A. Vasilyeva 1 Institute of Cytology & Genetics, SB RAS, Novosibirsk, Russia;2 Novosibirsk State University, Russia
SUMMARY: Influence of treating with limited doses of steams of ethanol on a transpositions MGE412 was investigated in the males from isogenic lines of Drosophila melanogaster. It was proved the phenomenon of the induction. The rates of induced transpositions was estimated. Ones was 3,79-6,89x10~2 in comparison with control, Xt=l,84xl0x’. It was established that alcohol made be finished either death of individuals or increase genetic variability in the posterity. It was proved that ethanol is powerful inductor of transpositions MGEs of Drosophila like other different external (temperature shock, ^-irradiation) and genetic factors, the main of them are isogenization and selection.
$5 KEY WORDS: mobile genetics element, induction of transpositions, stress, ethanol.
