CC BY
32МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 612.82;616.00.1;577.112.115 ББК 52.28.707
В .А. КОЗЛОВ, С.П. САПОЖНИКОВ, А.И. ФУФАЕВА, О.В. НИКОЛАЕВА, Е.С. ДЕОМИДОВ
ПАРЕНТЕРАЛЬНОЕ ВВЕДЕНИЕ АЛЬБУМИНА ИНДУЦИРУЕТ АМИЛОИДНОЕ ПОРАЖЕНИЕ ГОЛОВНОГО МОЗГА
Ключевые слова: альбумин человека, мыши, модель амилоидоза, амилоид, конго красный, головной мозг, дорзовентральные парафиновые срезы.
Цель исследования - получение амилоидоза у лабораторных мышей в эксперименте с парентеральным введением аптечного альбумина человека.
Известны экспериментальные модели генерализованного амилоидоза, индуцированные введением альбуминов сыворотки крупного рогатого скота либо яичного. Собственный сывороточный альбумин человека также участвует в формировании амилоида. Тем не менее в медицине широко используется внутривенное введение препаратов альбумина человека для дегидратации при различных тяжелых состояниях. Такое лечение считается безопасным, но так ли это?
Молодым одномесячным мышам вводили подкожно соевый заменитель сливок ТУ 9199004-58706213-10 (контроль формирования амилоидоза по стандартной модели - КМ) или 10%-ный водный раствор аптечного альбумина человека в дозе 0,9 мл в сутки 14 инъекций внутрибрюшинно (подопытная группа). Это вызывало генерализованное амилоидное поражение внутренних органов, гистологически верифицированное по окрашиванию красным конго, в том числе подкорковых областей головного мозга и мозжечка. Площадь отложения (SA) амилоида в 4 у-парафиновых срезах составила в контрольной группе (КМ) 61,4±15,48% по сравнению с 40,18±14,82% в подопытной группе. Дожитие в течение 30 дней после окончания введения амилоидогенов сопровождалось увеличением SA до 51,51±17,92%. В мозжечке SA в КМ составила 44,01 ±12,86%, на тех же сроках введения альбумина - 24,87±10,18%, 30-дневное дожитие сопровождалось увеличением SA - 39,21±14,75.
Таким образом, внутрибрюшинное введение альбумина человека мышам вызывает у них прогрессирующее амилоидное поражение подкорковых областей головного мозга и мозжечка. Сделан вывод, что альбумин и все белковые препараты крови человека, содержащие альбумин, должны быть исключены из клинического применения для парентерального введения.
V. KOZLOV, S. SAPOZHNIKOV, A. FUFAEVA, O. NIKOLAEVA, E. DEОMIDOV
PARENTERAL ADMINISTRATION OF ALBUMIN INDUCES AMYLOID BRAIN DAMAGE
Key words: human albumin, mice, amyloidosis model, amyloid, congo red, brain, dorsoventral paraffin sections.
The aim of the study was to obtain amyloidosis in laboratory mice in experiment with a parenteral administration of human pharmacological albumin.
Experimental models of generalized amyloidosis, induced by administration of bovine serum albumin or ovi albumin are known. It is also known that human genuine serum albumin participates in amyloid formation. Nevertheless, in medicine, intravenous administration of human albumin preparations for dehydration in various critical conditions is widely used. Such treatment is considered to be safe, but is it?
Young one-month-old mice were injected subcutaneously with soya cream substitute TU 9199-004-58706213-10 (control of amyloidosis formation according to the standard model -KM), or 10% aqueous solution of human pharmacological albumin at a dose of 0.9 ml per day, 14 injections intraperitoneally (experimental group). This caused generalized amyloid involvement of internal organs, including subcortical areas of the brain and cerebellum, which was histologically verified by staining with red Congo. Amyloid deposition square area (SA) in 4 y-paraffin sections in control group (CG) made: 61,4±15,48%, against 40,18±14,82% in experimental group. Within 30 days after the end of amyloidogens administration, survival was accompanied by SA increase to 51,51±17,92%. In the cerebellum in CG, SA was 44,01±12,86%
versus 24,87±10,18% at the same periods of albumin administration and 39,21±14,75% after 30 days of survival.
Thus, intraperitoneal human albumin injection in mice causes a progressive amyloid affection of subcortical areas of the cerebrum and cerebellum. It was concluded that albumin and all protein preparations of human blood containing albumin should be excluded from clinical use for parenteral administration.
Проведенный нами ранее анализ экспериментальных моделей амилои-доза [1], разработка и изучение собственных амилоидных моделей [2, 3], суп-рамолекулярных механизмов формирования амилоида [4], а также литературы, посвященной исследованию амилоидоза и созданию современной классификации амилоидных поражений [6], позволили нам предположить, что любой белок, содержащий в своей структуре амилоидную последовательность аминокислот, при парентеральном введении будет вызывать амилоидное поражение. В клинической практике парентерально вводится немалое количество белков, например, альбумины, либо препараты плазмы крови, также содержащие альбумины. Альбумины как человека, так и животных являются амилоидогенными белками [6] и, как таковые, могут представлять теоретическую опасность как факторы запуска амилоидоза у пациентов. Между тем настороженности к парентеральным белковым препаратам, как возможным факторам запуска амилоидогенеза, в среде ни практикующих врачей, ни исследователей - нет. В частности, это обусловлено настолько длительными сроками развития амилоидного поражения у людей, что связать клинически выраженный амилоидоз с ранее применявшимися белковыми препаратами не представляется возможным.
В связи с вышесказанным целью нашего исследования являлось получение амилоидного поражения у лабораторных мышей в эксперименте с парентеральным введением аптечного альбумина человека.
Материалы и методы исследования. В эксперименте были использованы 12 белых лабораторных половозрелых 35-дневных мышей-самцов массой 21,4±2,5 г. Все процедуры по содержанию и выведению животных из эксперимента соответствовали правилам, принятым в ФГБОУ ВО «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова», рекомендациям Национального совета по исследованиям и законодательству Российской Федерации и принципам Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным. Системный амилоидоз воспроизводили с помощью разработанной нами модели амилоидоза у молодых мышей, получаемой в результате подкожного введения соевого заменителя сливок ТУ 9199-004-58706213-10 [2, 3]. Мыши были разделены на четыре группы по три мыши в группе случайным образом: 1) контроль - интактные мыши, содержавшиеся в тех же условиях; 2) контроль модели - группа мышей, каждая из которых в течение месяца через день получала подкожно 10%-ный водный раствор соевого заменителя сливок ТУ 9199-004-58706213-10 из расчета 0,1 мл на 10 г массы мыши, всего 15 инъекций; 3) подопытные мыши, каждая из которых в течение месяца через день получала внутрибрюшинно 10%-ный раствор аптечного альбумина в дозе 0,9 мл/сут., 14 инъекций; 4) подопытные мыши, каждая из которых в течение месяца через день получала внутрибрюшинно 10%-ный раствор аптечного альбумина в дозе 0,9 мл в сутки, 14 инъекций - декапитацию мышей 4-й группы проводили через 1 месяц после последнего введения 10%-ного
раствора альбумина. Все мыши в течение всего времени эксперимента находились в одной клетке со свободным доступом к корму и воде.
Через месяц мыши 1-, 2-, 3-й групп были выведены из эксперимента методом декапитации. Головной мозг был зафиксирован 10%-ным нейтральным формалином. После фиксации, отмывки проточной водой, обезвоживания забранный материал был залит в парафин. Из парафиновых блоков были приготовлены дорсовентральные срезы толщиной 5 мкм, которые монтировали на предметных стеклах. После депарафинации их окрашивали 1%-ным раствором конго красным для выявления амилоида и докрашивали гематоксилином. Для подтверждения наличия амилоида срезы микроскопиро-вали на поляризационном микроскопе МИН-8 для обнаружения дихроизма амилоидных депозитов, окрашенных конго красным. После этого осуществляли видеофиксацию срезов в белом свете с помощью цифровой камеры Levenhuk D320L NG, 3 Мпикс, USB 2.0.
На полученных микрофотографиях срезов с помощью программы Photoshop CS3 Extended измеряли относительную площадь конго-положительных участков (в % от общей площади снимка), которую исследовали как статистическую величину. Полученный цифровой материал обработан методами дискриптивной статистики, различия средних значений определяли с 2
помощью метода % .
Результаты исследования и их обсуждение. Полученные результаты представлены в таблице. Как и ожидалось, конгорот не окрашивал срезы головного мозга интактных мышей - 1-я группа, соответственно площадь конго-положительных участков равна 0. Описание этих срезов не представляет интереса, поскольку является типичной морфологической нормой.
Максимальная площадь конго-положительных участков была выявлена у животных 2-й группы (контроль модели). Амилоидные депозиты выявлялись в стенках артериальных сосудов в виде диффузного прокрашивания однородной цветовой плотности в большей степени в подкорковых областях (рис. 1). Сами ядра не прокрашивались. В мозжечке прокрашивание конго-положительного вещества наблюдалось в зернистом слое и белом веществе непосредственно рядом с ним с внутренней стороны зернистого слоя (рис. 2). Конго-положительную реакцию давали и грушевидные клетки мозжечка (рис. 3).
Площадь конго-положительных участков головного мозга и мозжечка (% от площади среза, увеличение 400х)
Показатель n M±m Д Значение p=,
Головной мозг
контроль модели 32 61,4±15,48 27,23-88,04
альбумин 55 40,18±14,82 12,68-69,77 0,0000™™
дожитие 30 дней после введения альбумина 38 51,51±17,92 11,2-80,39 0,0170™™; 0,0013А
Мозжечок
контроль модели 18 44,01±12,86 22,81-58,9 0,0002™'™
альбумин 16 24,87±10,18 9,18-36,83 0,0011 кмм
дожитие 30 дней после введения альбумина 18 39,21±14,75 20,32-59,18 0,5373™'"; 0,0188А
Примечание. КМгм - значения р по отношению к срезам головного мозга на контроле модели; КМм - значения р по отношению к срезам мозжечка на контроле модели; А - значения р между моделями с введением альбумина и 30-дневным дожитием после введения альбумина.
Рис. 1. Подкорковые области головного мозга мыши после моделирования амилоидоза альбумином человека. Ув. *40
Рис. 2. Участок белого вещества мозжечка мыши после моделирования амилоидоза альбумином человека. Окраска конго красным. Ув. *40
Рис. 3. Мозжечок - грушевидные клетки (показаны стрелками) на границе зернистого слоя, заполненные конго-положительным веществом. Окраска конго красным. Ув. *40
В обеих подопытных группах (альбумин и альбумин + 30 дней дожития) морфологическая картина поражения в целом не отличалась от группы «контроль модели». Различия, как показано в таблице, обусловлены только интенсивностью поражения, что видно по различию площадей закрашивания конго красным. В группе мышей с тридцатидневным дожитием наблюдалось увеличение площади амилоидного поражения на срезах как головного мозга, так и мозжечка. Эта картина хорошо согласуется с известным фактом нарастания тяжести однажды начавшегося амилоидного поражения, даже в отсутствие причины, вызвавшей амилоидоз.
В настоящее время известно, что амилоид образуется как из белковых фрагментов длиной 38-42 аминокислотных остатков, вычленяемых в результате -С-С- протеолиза из белка предшественника [7], так и из самостоятельных аминокислотных гексамеров, образующих при самосборке ту же последовательность 38-42 аминокислотных остатков, являющуюся мономером амилоидной нанотрубки. В результате генетического картирования большой группы белков было установлено, что большинство белков содержит несколько «амилоидогенных» сегментов [5]. Поскольку сборка амилоидного мономера может происходить спонтанно при участии не только белков-предшественников, но и нескольких белков-носителей различных гексамеров, существует опасность, что, по крайней мере, белки с установленной способностью образовывать амилоидную конформацию, например альбумин, прошедшие фармацевтическую обработку - выделение, стерилизацию, стабилизацию в растворе, хранение, высушивание - после парентерального введения могут образовывать амилоид в организме больного. Амилоидогенез как осложнение терапии альбумином (или другими белками медицинского назначения) в литературе не описан, поскольку сама возможность такого процесса до сих пор казалась невозможной - настороженность в отношении ятрогенного амилои-доза отсутствует в принципе. Эта ситуация осложняется тем, что посмертная диагностика амилоидоза осуществляется только в явных случаях клинически выраженного врожденного или приобретенного амилоидоза.
Таким образом, наше предположение, что альбумин человека, как и альбумин животных, может вызвать амилоидное поражение, подтвердилось.
Выводы. 1. Парентеральное введение альбумина мышам вызывает у них прогрессирующее амилоидное поражение подкорковых областей головного мозга и мозжечка.
2. При разработке белковых препаратов для парентерального введения необходимо проводить их сиквенс на предмет выявления амилоидогенных последовательностей аминокислот.
3. При разработке иммунотропных препаратов небелкового происхождения необходимо исследовать их влияние на синтез АЬамилоида из легких цепей иммуноглобулинов.
4. По-видимому, альбумин и все белковые препараты крови человека, содержащие альбумин, должны быть исключены из клинического применения.
Литература
1. Козлов В.А., Сапожников С.П., Шептухина А.И., Голенков А.В. Сравнительный анализ различных моделей амилоидоза // Вестник Российской академии медицинских наук. 2015. № 1. С. 5-11.
2. Козлов В.А., Сапожников С.П., Карышев П.Б., Шептухина А.И., Николаева О.В. Модель системного амилоидоза у молодых мышей // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2016. Т. 162, № 10. С. 523-527.
3. Пат. 2572721 РФ, МПК7 G09B23/28 A61K35/54. Способ моделирования экспериментального амилоидоза у животных / Козлов В.А., Сапожников С.П., Шептухина А.И., Карышев П.Б.; заявитель и
патентообладатель Чувашский государственный университет. № 2014144674/15(072131); заявл. 11.05.2014; опубл. 20.01.2016, Бюл. № 2. 13 с.
4. Козлов В.А., Сапожников С.П., Шептухина А.И., Голенков А.В. Параметаболизм как неспецифический модификатор супрамолекулярных взаимодействий в живых системах // Вестник Российской академии медицинских наук. 2015. № 4(70). С. 397-402.
5. Goldschmidt L, Teng P.K., Riek R., Eisenberg D. Identifying the amylome, proteins capable of forming amyloid-like fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010, vol. 107, no. 8, pp. 3487-3492. doi: 10.1073/pnas.0915166107.
6. Sipe J.D., Benson M.D., Buxbaum J.N., Ikeda S., Merlini G., Saraiva M.J., Westermark P. Amyloid fibril protein nomenclature: 2010 recommendations from the nomenclature committee of the International Society of Amyloidosis. Amyloid, 2010, vol. 17, no. 3-4, pp. 101-104. doi:10.3109/1350 6129.2010.526812.
7. Selkoe D.J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol. Rev., 2001, vol. 81, no. 2, pp. 741-766.
References
1. Kozlov V.A., Sapozhnikov S.P., Sheptukhina A.I., Golenkov A.V. Sravnitel'nyi analiz razlichnykh modelei amiloidoza [Comparative analysis of amyloidosis various models]. Vestnik Rossiiskoi akademii meditsinskikh nauk, 2015, no. 1, pp. 5-11.
2. Kozlov V.A., Sapozhnikov S.P., Karyshev P.B., Sheptukhina A.I., Nikolaeva O.V. Model' sistemnogo amiloidoza u molodykh myshei [Model of systemic amyloidosis in young mice]. Byulleten' eksperimental'noi biologii i meditsiny, 2016, vol. 162, no. 10, pp. 523-527.
3. Kozlov V.A., Sapozhnikov S.P., Sheptukhina A.I., Karyshev P.B. Sposob modelirovaniya eksperimental'nogo amiloidoza u zhivotnykh [A method for modeling experimental amyloidosis in animals]. Patent RF no. 2572721, 2016.
4. Kozlov V.A., Sapozhnikov S.P., Sheptukhina A.I., Golenkov A.V. Parametabolizm kak nespe-tsificheskii modifikator supramolekulyarnykh vzaimodeistvii v zhivykh sistemakh [Parametabolism as a nonspecific modifier of supramolecular interactions in living systems]. Vestnik Rossiiskoi akademii meditsinskikh nauk, 2015, no. 4(70), pp. 397-402.
5. Goldschmidt L., Teng P.K., Riek R., Eisenberg D. Identifying the amylome, proteins capable of forming amyloid-like fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010, vol. 107, no. 8, pp. 3487-3492. doi: 10.1073/pnas.0915166107.
6. Sipe J.D., Benson M.D., Buxbaum J.N., Ikeda S., Merlini G., Saraiva M.J., Westermark P. Amyloid fibril protein nomenclature: 2010 recommendations from the nomenclature committee of the International Society of Amyloidosis. Amyloid, 2010, vol. 17, no. 3-4, pp. 101-104. doi:10.3109/1350 6129.2010.526812.
7. Selkoe D.J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol. Rev., 2001, vol. 81, no. 2, pp. 741-766.
КОЗЛОВ ВАДИМ АВЕНИРОВИЧ - доктор биологических наук, профессор кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары (pooh12@yandex.ru).
KOZLOV VADIM - Doctor of Biological Sciences, Professor of Medical Biology Department with a Course of Microbiology and Virology, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
САПОЖНИКОВ СЕРГЕЙ ПАВЛОВИЧ - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой биологии и микробиологии, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары (adaption@mail.ru).
SAPOZHNIKOV SERGEY - Doctor of Medical Sciences, Professor, Head of Biology and Microbiology Department, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
ФУФАЕВА АЛЕНА ИГОРЕВНА - аспирантка кафедры биологии и микробиологии, Чувашский государственный университет, Чебоксары (priffetik@bk.ru).
FUFAEVA ALENA - Post-Graduate Student of Biology and Microbiology Department, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
НИКОЛАЕВА ОКСАНА ВЛАДИСЛАВОВНА - клинический ординатор кафедры психиатрии, медицинской психологии и неврологии, Чувашский государственный университет, Чебоксары (lovely667@mail.ru).
NIKOLAEVA OKSANA - Clinical Resident, Department of Psychiatry, Medical Psychology and Neurology, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
ДЕОМИДОВ ЕВГЕНИЙ СЕРГЕЕВИЧ - кандидат медицинских наук, доцент кафедры психиатрии, медицинской психологии и неврологии, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары (neurokaf@yandex.ru).
DEOMIDOV EVGENIY - Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Department of Psychiatry, Medical Psychology and Neurology Department, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
