CC BY
18
сии маркеров, входящих в стандартную панель ИГХ-исследования (Ег, Pg, Ю-67, НЕЯ2).
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК:
1. Рак молочной железы. Практическое руководство для врачей / Ю. Ю. Андреева [и др.]; под ред. Г. А. Франк, Л. Э. Завалишиной, К. М. Пожарисского. — М.: Практическая медицина, 2014. — 176 с.
2. Оценка скорости и полноты фиксации биопсийного материала добавлением в формалин пищевого красителя / А. Ю. Крылов [и др.] // Журнал «Судебная экспертиза Беларуси». — 2017. — № 1 (4). — С. 52-54.
3. Оценка скорости и качества фиксации биопсийного материала при раке молочной железы / А. Ю. Крылов [и др.] // Охрана материнства и детства». — 2016. — № 2(28). — С. 13-15.
Поступила 09.10.2017
УДК 618.19-006.6:53.086
ПАРАМЕТРЫ АРХИТЕКТОНИКИ АСМ-КАРТ ПОВЕРХНОСТИ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК КАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ MCF-7
М. Н. Стародубцева
Гомельский государственный медицинский университет Институт радиобиологии НАН Беларуси, г. Гомель
В связи с расширением использования атомно-силовой микроскопии (АСМ) в медико-биологической науке актуальным становится нахождение параметров, количественно характеризующих распределение значений различных свойств поверхности клеток на наномасштабном уровне. Целью исследования являлось выявление особенностей поведения параметров шероховатости (Я^) и фрактальной размерности оцененных для АСМ-изображений поверхности фиксированных глутаровым альдегидом эпителиальных клеток карциномы молочной железы МСБ-7 при изменении разрешения изображения, размеров области сканирования и участков поверхности клеток. Показано, что величина DF АСМ-карт ограничена минимально достижимым шагом сканирования. Совместный анализ Я и DF АСМ-изображений выявил различие возможностей этих параметров и преимущество использования параметра зависимости DF от коэффициента масштабирования по оси Ъ (ЭР = ОД) для характеристики тонкой структуры распределения значений локальных параметров карт топографии и механических свойств по поверхности клетки. Применяя зависимость DF = ОД к АСМ-изображениям, можно количественно охарактеризовать различные по структурным свойствам части клетки (лидирующий край, центр с ядром и переходная область).
Ключевые слова: атомно-силовая микроскопия, клетки карциномы молочной железы МСБ-7, шероховатость, фрактальная размерность.
THE ARCHITECTONICS PARAMETERS OF AFM MAPS OF THE EPITHELIAL CELL SURFACE OF MCF-7 BREAST CARCINOMA
M. N. Starodubtseva
Gomel State Medical University, Institute of Radiobiology of NAS of Belarus, Gomel
Due to the wide application of atomic force microscopy (AFM) in medical and biological sciences, the finding of parameters qualitatively characterizing the distribution of the values of various cell surface properties at the na-noscale level is becoming topical. The aim of the study was to reveal the features of the behavior of the parameters of roughness (Rq) and fractal dimension (DF) assessed for AFM images of the surface of glutaraldehyde-fixed breast carcinoma cells (MCF-7 cells) with changing of the image resolution, the scanning area size, and the regions of the cells. It has been proved that the value of DF for AFM images is limited by the minimal achieved scanning step. The mutual analysis of Rq and DF of AFM images has revealed some difference in the prospects of these parameters and the advantage of the application of the parameter DF = f(t) (dependence of the fractal dimension on the scale coefficient along the axis Z) to characterize the fine structure of the spatial distribution of the local topographic parameters and parameters of mechanical properties on the cell surface. The application of the dependence of the parameter Df = f(t) on AFM images, makes it possible to quantitatively characterize the different cell regions (the leading edge, central area over the nucleus, transitional (middle) area).
Key words: atomic force microscopy, MCF-7 breast carcinoma cells, roughness, fractal dimension.
Введение
В связи со стремительным развитием исследований клеток и клеточных структур на наномасштабном уровне, ускоренным, в свою очередь, созданием атомно-силовой микроскопии, актуальным в медико-биологической науке становится нахождение параметров, ко-
личественно характеризующих распределение значений различных свойств поверхности клеток на исследуемых участках [1]. Атомно-силовая микроскопия позволяет получать трехмерные карты не только рельефа участка натуральной поверхности, то есть характеристику его неровностей в вертикальном и горизонтальном
направлениях (этот режим работы прибора обычно именуется «топография»), но и трёхмерные карты распределения значений физико-механических свойств (например, упругих, фрикционных, адгезионных и др.). Среди параметров, используемых при анализе данных о свойствах трёхмерных карт поверхности, полученных с помощью атомно-силовой микроскопии, наиболее широко распространёнными являются шероховатость и фрактальная размерность [2-5]. Шероховатость является усредненной характеристикой отклонений профиля от среднего значения на заданном участке поверхности, например, среднее арифметическое отклонение профиля (Яа), среднее квадратиче-ское отклонение профиля (Я,) и др. [2]. Фрактальная размерность поверхности в трехмерном пространстве дает численную оценку степени заполнения этого пространства поверхностью [3, 4]. Так как топологическая (целочисленная) размерность плоскости 2, а куба — 3, то фрактальная (дробная) размерность поверхности лежит в пределах от 2 до 3.
Цель исследования
Выявить особенности поведения параметров шероховатости Я, и фрактальной размерности DF, оцененных для изображений (трехмерных карт) поверхности эпителиальных клеток карциномы молочной железы MCF-7, полученных с помощью атомно-силового микроскопа, при изменении разрешения изображения, размеров области сканирования и участков поверхности клеток.
Материалы и методы
В работе использована культура эпителиальных клеток карциномы молочной железы (MCF-7). Для приготовления образцов клеток для АСМ-исследования на специально подготовленные стеклянные пластины, помещенные в чашки Петри, вносили суспензию клеток в питательной среде и инкубировали в течение 24 ч при 37 °С и 5 % С02, затем клетки фиксировали в 0,5 % солевом буферном растворе глутарового альдегида (15 мин), трижды отмывали препараты клеток деионизированной водой и высушивали в вертикально-наклонном положении (75-85°) в ламинарном потоке воздуха (0,42 м/с) при комнатной температуре [5]. АСМ-исследования клеток проводили на атомно-силовом микроскопе «НТ-206» («Мик-роТестМашины», Беларусь) в контактном режиме сканирования с использованием игл-зондов CSC38 («MikroMasch», Эстония): уровень В, коэффициент жесткости 0,01-0,08 Н/м. Сканирование проводили при температурах 22 ± 5 °С и влажности 55 ± 10 % на воздухе. Термо-статирование образцов клеток во время АСМ-сканирования осуществляли с помощью термоплатформы ТТ-01. Использовали режимы
работы прибора «топография» и «латеральные силы». Обработку АСМ-данных, включая расчет шероховатости, осуществляли с помощью программы <^игТасеЕхр1оге 1.3.11» («МикроТест-Машины», Беларусь). Расчет фрактальной размерности проводили с помощью разработанного нами программного комплекса, основанного на методе подсчета кубов. Оценку среднего значения фрактальной размерности для участка поверхности клетки осуществляли с помощью разбиения участка на 9 или 4 квадратных участков одинаковой площади, оценки значения фрактальной размерности для каждого из участков и расчета среднего значения и границ 95 % доверительного интервала для целой выборки. Зависимость DF от коэффициента масштабирования t по оси Ъ = ОД), которая описывает структурные свойства поверхности лучше, чем единичное значение DF, строили на основе массива дополнительно созданных цифровых поверхностей, полученных с помощью умножения данных реального АСМ-изображения на коэффициент ^ изменяемый в широком диапазоне (от 0,0001 до 22027 с шагом е = 2,71828) [3].
Результаты и их обсуждение
Влияние разрешения АСМ-изображения на значения шероховатости и фрактальной размерности. Ранее было показано, что фрактальная размерность АСМ-изображений зависит от коэффициента масштабирования по оси Ъ. Эта зависимость описывается кривой с несколькими максимумами в области значений фрактальной размерности от 2 до 3. Соотношение и положение этих максимумов являются уникальной характеристикой изображения, отражающей особенность строения изучаемой поверхности. Однако как характеристика цифрового изображения она зависит от количества пикселей этого изображения и, следовательно -от разрешения. На рисунке 1 (а) представлены кривые DF = ОД для карт латеральных сил (карты, описывающие распределение механических свойств по поверхности) одного и того же участка поверхности клетки MCF-7, записанные с разным разрешением.
На рисунке 1 (в и г) представлены карты латеральных сил для участка клеточной поверхности с разрешением 64 х 64 пикселей и 500 х 500 пикселей. Фрактальная размерность карт латеральных сил возрастает с увеличением разрешения. Но с увеличением разрешения уменьшается шаг сканирования, что при увеличении количества точек на единицу длины сканирования (I = 2500 нм) до N = 250 приводит к достижению шага сканирования в 10 нм, сравнимого с радиусом кривизны используемого зонда. Дальнейшее уменьшение шага сканирования существенно не изменяет достигнутого значения фрактальной размерности изображе-
ния (рисунок 1 (б)). При этом для шероховатости карт латеральных сил участка поверхности клет-
ки какой-либо зависимости от разрешения изображения не наблюдается (рисунок 1 (д)).
D. 2.5
и
—т-1-1-I-1-I-1--—|-1-г-
-5 -J -3 -2 -! О
1 2 3 4 5 6 lg(t)
600
б
а
в г д
Рисунок 1 — Зависимость фрактальной размерности (DF) и шероховатости (Rq) АСМ-изображений (карт латеральных сил) поверхности клетки MCF-7 от разрешения (N х N): а—зависимости DF = f(t) для изображений с разным разрешением (от 64 х 64 пикселей до 500 х 500 пикселей); б — зависимости значений максимумов кривой DF = f(t) от разрешения изображения; д — зависимость шероховатости карт латеральных сил от разрешения изображения. Карты латеральных сил одного участка поверхности клетки MCF-7 размером 2,5 х 2,5мкм с разрешением 64 х 64 пикселей (в) и 500 х 500 пикселей (г). Фрактальная размерность оценена с использованием деления изображения на 9 квадратных участков одинаковой площади
Влияние размера области сканирования на значения шероховатости и фрактальной размерности АСМ-изображений. Клетка не является гомогенным объектом или объектом, сохраняющим свои структурные свойства на разных масштабах, то есть самоподобной структурой. На масштабах порядка нескольких десятков микрометров единичная распластанная на жесткой поверхности эпителиальная клетка является целым объектом, в то время как на участках с размером порядка одного и менее микрометра мы имеем дело с ен частью. Различные участки клетки имеют разную топографию, физико-механические и другие свойства. На рисунке 2 (и-о) видно, как изменяется структура топографических изображений поверхности клетки с изменением размеров площади сканирования. Крупные, характерные изменения рельефа поверхности на изображениях с размером I х I = 1 х 1 мкм оказываются мелкими особенностями структуры изображения с размером 6 х 6 мкм той же поверхности клетки (и, о). С увеличением размера участка поверхности увеличивается ше-
роховатость как топографического изображения, так и карт латеральных сил (рисунок 2 (б)). При этом шероховатость карт латеральных сил является более чувствительной к изменению размера участка поверхности клетки характеристикой в сравнении с шероховатостью топографических изображений. Фрактальная размерность топографических изображений, оцененная по первому максимуму кривой = А^), увеличивается с увеличением размера участка поверхности (рисунок 2 (а)) и достигает стабильных значений при размере участков 3 х 3 мкм и больше (рисунок 2 (а)). При этом фрактальная размерность карт механических свойств (карт латеральных сил) участков поверхности клетки МСБ-7 уменьшается в области малых размеров участка, достигает минимума при величине 1 = 34 мкм, а затем увеличивается (рисунок 2 (а)). На картах латеральных сил (рисунок 2 (в, г)) при малом размере участка видны мелкие особенности структуры, не различимые на соответствующих топографических изображениях (рисунок 2 (и, к)).
Рисунок 2 — Зависимость фрактальной размерности и шероховатости (Rq) АСМ-изображений от размеров области сканирования поверхности клетки МСР-7: а, б — влияние размера изображения на величину первого максимума зависимости DF = (а) и на величину шероховатости (Яч) (б) для топографического изображения и карты латеральных сил участка поверхности клетки МСР-7; Яч_1 - шероховатость изображения участка поверхности размером 1 х 1 мкм; в-о — топографические изображения (в-з) и карты латеральных сил (и-о) поверхности клетки МСР-7 с размерами 1 х 1 мкм (в, и), 2 х 2 мкм (г, к), 3 х 3 мкм (д, л), 4 х 4 мкм (е, м), 5 х 5 мкм (ж, н), 6 х 6 мкм (з, о). Фрактальная размерность оценена с использованием деления изображения на 9 и 4 квадратных участков одинаковой площади
При больших размерах участка клеточной поверхности структурные особенности обоих типов АСМ-изображений (карт) сходны (рисунок 2 (ж, з, н, о)). При записи изображений поверхности клетки с помощью АСМ боковые отклонения (латеральные, торсионные отклонения) зонда оказываются более чувствительными к изменению свойств сканируемой поверхности в сравнении с вертикальными отклонениями иглы-зонда микроскопа. Следовательно, карты латеральных сил для изучения малых участков поверхности клетки подходят лучше, чем топография.
Это подтверждается и тем, что фрактальная размерность карт латеральных сил на участках малых размеров достоверно выше фрактальной размерности топографических изображений этого же участка поверхности клетки. Карты латеральных сил, записанные на участках малых размеров ( l= 1-3 мкм), позволяют изучать особенности структуры, обусловленные кортикальным цитоскелетом.
Влияние выбора участка клеточной поверхности на значения шероховатости и фрактальной размерности его АСМ-изображения. Жесткая подложка (например, стекло) активирует цитоскелет эпителиальной клетки, способствуя созданию упорядоченных структур из актино-
вых филаментов (ламеллоподий, филоподий, стресс-фибрилл и др.). Клетка распластывается и поляризуется, образуя лидирующий край со структурами из актиновых филаментов (ламе ллоподиями). На рисунке 3 представлено АСМ-изображение и основанное на нем схематическое изображение эпителиальной клетки карциномы молочной железы MCF-7 на стеклянной пластине. На рисунке можно выделить лидирующий край клетки, область с ядром и переходную область. Первая область характеризуется развитой дендритоподобной структурой актинового цитоскелета, свойства третьей области определяются подлежащим под мембраной ядром с ядрышками. Вторая область является переходной, без существенного влияния цитоскелетных структур и ядра на свойства поверхности. На рисунке 4 (в-д и ж-и) представлены типичные АСМ-изображения из трех областей поверхности клеток МСБ-7.
Существенных различий в значениях шероховатости топографических изображений и карт латеральных сил для трех выбранных участков поверхности клетки не обнаружено (рисунок 4 (е и ж)). Зависимости DF = ОД для топографии и карт латеральных сил трех участков поверхности клетки различаются по форме. Для некоторых значений коэффициента масшта-
бирования по оси Ъ различия статистически значимы. Для топографии имеет место уменьшение значения второго максимума зависимости Бр = ОД (при г = 2,17 БР2 = 2,28 ± 0,16; 2,14 ± 0,12; 2,04 ± 0,12* для края, центральной области и переходной области соответственно, *р < 0,05 в сравнении с краевой областью). Для карт лате-
ральных сил первый максимум кривой сдвинут влево для образцов с краевой области клетки (г = -2,17: Бр = 2,09 ± 0,07; 1,87 ± 0,01*; 1,89 ± 0,03* для края, центральной области и переходной области соответственно, *р < 0,05 в сравнении с краевой областью). Есть различия и в параметрах второго максимума.
Рисунок 3 — Эпителиальная клетка карциномы молочной железы MCF-7 на стеклянной пластине: а — АСМ-изображение (топография) целой клетки, реконструированное из более мелких АСМ-изображений частей клетки; б — схематичное изображение поляризованной эпителиальной клетки на жестком субстрате с указанием структурных элементов цитоскелета и частей клетки, используемых при АСМ-исследовании
Например, при г = 1,73 Бр = 2,16 ± 0,07*; 2,32 ± 0,04; 2,15 ± 0,06* для края, центральной области и переходной области соответственно, *р < 0,05 в сравнении с центральной областью. Эти изменения количественно подтверждают сглаживание рельефа поверхности в ряду: краевая область, центральная область и переходная область. Сдвиг влево первого максимума Бр
топография
—•— край —©— центр
—переходная область
для карт латеральных сил участка лидирующего края клетки свидетельствует о присутствии в его структуре более выраженных мелких структурных элементов — актиновых микрофиламентов. Кроме того, различия в распределении механических свойств наблюдаются на более крупных масштабах между участками центральной области и участками края и переходной области.
карты латеральных сил
■•—край — центр
переходная область
-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5
¥0
-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 18(1))
•У^р
ш
Рисунок 4 — Влияние на значения фрактальной размерности и шероховатости (Rq) выбора участка поверхности клетки MCF-7
а, б — зависимости DF = ОД для топографических изображений (а) и карт латеральных сил (б) участков поверхности клетки; в-д — типичные топографические изображения участков поверхности клетки с края (в), в центре (г) и в переходной области (д); е — шероховатость топографических изображений поверхности клетки (с края, 1; в центре, 2; в переходной области, 3); ж-и—типичные карты латеральных сил участков поверхности клетки с края (ж), в центре (з) и в переходной области (и); к — шероховатость карт латеральных сил для клетки (с края, 1; в центре, 2; в переходной области, 3)
Б
Б
2.4
б
а
е
и
к
Заключение
Совместный анализ шероховатости и фрактальной размерности АСМ-изображений эпителиальных клеток карциномы молочной железы МСБ-7 выявил различие возможностей этих параметров и преимущество использования параметра БР = ОД для характеристики тонкой структуры распределения значений локальных параметров карт топографии и механических свойств по поверхности клетки. Применяя зависимость БР = ОД к АСМ-изображениям, можно количественно охарактеризовать различные по структурным свойствам части клетки. Параметр БР = ОД для карт латеральных сил участков поверхности микрометрового масштаба может использоваться для количественной характеристики развитости кортикального цитоскелета, обусловливающего тонкую струк-
туру карт механических свойств поверхности клетки. Величина фрактальной размерности АСМ-карт ограничена минимально достижимым шагом сканирования.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Multifractal characterization of morphology of human red blood cells membrane skeleton / §. "Jalu [et al.] // J. Microsc. — 2016. — Vol. 262(1). — P. 59-72.
2. Roughness of the plasma membrane as an independent morphological parameter to study RBCs: A quantitative atomic force microscopy investigation / M. Girasole [et al.] // Biochimica et Bio-physica Acta. — 2007. — Vol. 1768. — P. 1268-1276.
3. Starodubtseva, M. N. Novel fractal characteristic of atomic force microscopy images / M. N. Starodubtseva, I. E. Starodubtsev, E. G. Starodubtsev // Micron. — 2017. — Vol. 96. — P. 96-102.
4. Fractal properties of cell surface structures: A view from AFM / A. Bitler, R. S. Dover, Y. Shai // Semin. Cell Dev. Biol. — 2017. — pii: S1084-9521(17)30017-4. doi:10.1016//j.semcdb.2017.07.034.
5. Physical-mechanical image of the cell surface on the base of AFM data in contact mode / M. N. Starodubtseva [et al.] // IOP Conf. Ser.: Mater. Sci. Eng. — 2017. — Vol. 256. — P. 012016.
Поступила 31.10.2017
ОБЩЕСТВЕННОЕ ЗДОРОВЬЕ И ЗДРАВООХРАНЕНИЕ, ГИГИЕНА
УДК 616.12-008.331.1-084
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРИВЕРЖЕННОСТИ К ЛЕЧЕНИЮ ПАЦИЕНТОВ С АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ ПОСЛЕ ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО КОНСУЛЬТИРОВАНИЯ, ПРОВОДИМОГО ВРАЧАМИ-ТЕРАПЕВТАМИ УЧАСТКОВЫМИ И ПОМОЩНИКАМИ ВРАЧА
Я. И. Будник
Гомельский государственный медицинский университет, г. Гомель
Цель:провести сравнительный анализ приверженности к лечению пациентов с артериальной гипертен-зией после профилактического консультирования, проводимого врачами-терапевтами участковыми и помощниками врача в амбулаторных условиях.
Материал и методы. Исследование проведено на базе филиалов центральной городской поликлиники г.Гомеля.Выборочную совокупность составили 210 пациентов трудоспособного возраста (средний возраст 47,1 ± 3,4 года), страдающих артериальной гипертензией. Вся выборка была разделена на 2 группы: 1-ю группу составили 110 человек — мужчины и женщины,, с которыми провели индивидуальное профилактическое консультирование помощники врача, 2-ю — 100 пациентов, которых консультировали врачи-терапевты участковые.
Результаты. На основании полученных результатов были рассчитаны индексы ожидаемой эффективности модификации образа жизни (EUWL), лекарственной терапии (ЕМТ) и медицинского сопровождения (EMS). Оказалось, что они свидетельствуют о высокой результативности профилактического консультирования, в обеих группах ожидаемая эффективность лекарственной терапии (1,5) и медицинского сопровождения (1,3) одинакова. Итоговый показатель прогнозируемой эффективности лечения (IEET) не имел различий в выборках 1-й и 2-й групп (1,4).
Заключение. Профилактическое консультирование, проводимое медицинскими работниками в амбулаторных условиях, имеет сопоставимую эффективность. Результаты исследования по оценке приверженности к лечению пациентов трудоспособного возраста с артериальной гипертензией после профилактического консультирования, проводимого как врачами-терапевтами участковыми, так и помощниками врача, показали, что это способствовало позитивным изменениям в их образе жизни, что касалось, в частности, модификации образа жизни, лекарственной терапии и постоянного медицинского сопровождения.
Ключевые слова: профилактическое консультирование, факторы риска, болезни системы кровообращения, артериальная гипертензия, приверженность лечению, помощник врача, профилактика.
THE COMPARATIVE ANALYSIS OF ADHERENCE OFPATIENTS WITH ARTERIAL HYPERTENSION TO THE TREATMENT AFTER PREVENTIVE CONSULTATION PROVIDED BY LOCAL THERAPISTS AND PHYSICIAN ASSISTANTS
Ya. I. Budnik
Gomel State Medical University, Gomel, Republic of Belarus
Purpose: toper form the comparative analysis of adherence of patients with arterial hypertension to the treatment after preventive consultation provided by local therapists and physician assistants in outpatient conditions.
