CC BY
72
УДК 577.151.042, 577.152.27.10, 57.052.6
Панель тирозиновых киназ как инструмент для разработки противораковых препаратов
Т. В. Ракитина12*, О.В. Юдкина34, Е.В. Смирнова1, А.В. Липкин34
1 Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
2 Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071, Москва, Ленинский просп., 33
3 Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН, 119333, Москва, Ленинский просп., 59
4 Российский научный центр «Курчатовский институт», 123182, Москва, пл. Академика Курчатова, 1
* E-mail: taniarakitina@yahoo.com
РЕФЕРАТ Одно из направлений таргетной (целевой) терапии в онкологии связано с открытием фармакологического потенциала низкомолекулярных ингибиторов онкогенных тирозиновых киназ. В настоящее время исследования, направленные на создание новых терапевтически значимых ингибиторов, невозможны без комбинации информационных и экспериментальных подходов, включая биохимический, клеточный или in silico скрининг и изучение трехмерной структуры активного центра киназы в комплексе с ингибитором с помощью методов кристаллизации и рентгеноструктурного анализа или молекулярного моделирования. Настоящая работа является примером сочетания экспериментального подхода к поиску ингибиторов с компьютерным анализом потенциального механизма действия активных соединений, которое позволило предложить 2-гидроксифенольную группу в качестве основы для создания новых ингибиторов тирозиновых киназ.
Ключевые слова: тирозиновые киназы; низкомолекулярные ингибиторы; скрининг химической коллекции; 2-гидроксифенольная группа.
ВВЕДЕНИЕ
Открытие роли онкогенных тирозиновых киназ (ТК), получивших способность к неконтролируемой активации в результате генетических нарушений, в развитии раковых заболеваний и терапевтического потенциала их ингибиро-вания ознаменовало новую эру в онкологии, отмеченную появлением в клинической практике таргетных, направленных на определенную белковую мишень препаратов [1]. Наиболее перспективным подходом к ингибированию онкогенных ТК считают использование низкомолекулярных химических соединений, способных конкурировать с молекулой АТФ за связывание с активным центром фермента и тем самым ингибировать киназу [2]. Первым примером успешного использования этого подхода является создание лекарственного препарата иматиниб (гливек), подавляющего активность тирозинкиназных рецепторов Kit и PDGFR, а также нерецепторной слитой тирозинкиназы Bcr-Abl [3]. Сейчас в клинической практике помимо има-тиниба используют ряд препаратов аналогичного действия, но гораздо большее их число находится на разных стадиях разработки и испытаний, и параллельно идет активный поиск новых классов химических соединений, способных ингибировать тирозиновые киназы [4]. Неослабевающая активность исследователей в области разработки ингибиторов ТК связана как с уже отмеченной ролью белков этого класса в онкогенезе [2], так и со способностью мутантных форм ТК приобретать устойчивость к действию уже известных ингибиторов [5]. Кроме того, следует отметить проблему недостаточной селективности химических ингибито-
ров, действие которых направлено на АТФ-связывающие участки киназ [6], и наоборот, терапевтическую значимость одновременного ингибирования альтернативных сигнальных путей, вызывающих онкогенную трансформацию клетки [7].
Современные подходы к разработке новых терапевтически значимых ингибиторов основаны на комбинации информационных и экспериментальных методов, включая биохимический, клеточный или т silico скрининг и изучение трехмерной структуры активного центра киназы в комплексе с ингибитором с помощью кристаллизации и рент-геноструктурного анализа или методами молекулярного моделирования [8, 9]. Известно, что применение вычислительных методов требует информации о пространственной структуре активного центра белка-мишени или его близких гомологов, а результаты компьютерного моделирования должны быть подтверждены экспериментально. Таким образом, поиск и изучение специфичности ингибиторов требуют создания белковых панелей рекомбинантных ки-назных мишеней [6]. Следует отметить, что для наработки функционально активных тирозиновых киназ, как правило, используют бакуловирусную систему экспрессии [10].
Целью настоящей работы было создание панели функционально активных тирозиновых киназ и поиск ингибиторов в коллекции низкомолекулярных соединений. Анализ результатов скрининга с помощью молекулярного моделирования позволил предположить, что 2-гидроксифеноль-ная группа является перспективной основой для создания новых ингибиторов тирозиновых киназ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для получения функционально активных тирозиновых киназ использовали бакуловирусную систему экспрессии Вас^о-Вас (Invitrogen, США).
Коллекция низкомолекулярных органических соединений, содержащая более десяти тысяч химических веществ с молекулярными весами от 150 до 600, для поиска ингибиторов тирозиновых киназ была предоставлена ООО «Кембридж», Москва (http://chembridge.com/datasheets/ KINASet.pdf). Все соединения, растворенные в ДМСО до 1 мм концентрации, хранили в аликвотах на -20°С. Получение бакуловирусов. Фрагменты кДНК, кодирующие 16 белков, были клонированы с помощью классического подхода: обратная транскрипция на матрице тотальной РНК, ПЦР и лигирование в T-easy вектор (Promega, США). Полный список киназ и детали клонирования представлены в табл. 1. После проверки нуклеотидных последовательностей секвенированием фрагменты кДНК были перенесены в вектор pFastBacHT-B с сохранением рамки считывания при переходе от последовательности, кодирующей шесть гистидинов, к кДНК целевого белка. Полученные конструкции pFastBacHT-ТК использовали для трансформации клеток Е.соИ штамма DH10Bac, где плазмида рекомбини-ровала с геномом бакуловируса. Рекомбинантные бакмиды
выделяли из клеток E.coli и вводили в клетки насекомых Spodoptera frugiperda (Sf9), культивируемые на шести-луночных планшетах при 27°С. В трансфицированных клетках происходила сборка вирусных частиц, которые вызывали лизис клеток и накапливались в ростовой среде. В процессе развития инфекции клетки синтезировали и накапливали целевые 6*Гис-ТК. Все процедуры по работе с бакуловирусами проводили согласно рекомендациям к экспрессионной системе Bac-to-Bac (Invitrogen, США). Выделение 6*Гис-ТК. Клеточный осадок (~109 клеток или 10 г биомассы), полученный из 1 л инфицированной культуры, замораживали при -70°С, а затем лизирова-ли в 50 мл буфера А (500 мМ NaCl, 20 мМ Tris-HCl pH 8.5 и 0.1 % Triton Х-100) с добавлением ДНКазы и ингибиторов протеаз. Детергент-нерастворимую фракцию отделяли центрифугированием (15 000 g, 1 ч, +4°С), осветленный ли-зат инкубировали с 2 мл Ш2+сефарозы при +4°С в течение часа. По окончании связывания смолу отмывали буфером А, содержащим 30 мМ имидазол, до полного исчезновения белка в отмывке, а специфически связавшийся белок элю-ировали со смолы буфером А, содержащим 350 мМ имидазол. Выделенные 6*Гис~ТК переводили из элюирую-щего буфера в буфер, содержащий 50 мМ Tris-Hcl pH 8.5, 100 мМ NaCl, 0.05 % Triton X-100, путем обессоливания
Таблица 1. Детали создания панели тирозиновых киназ
Twp03MH0Bbie KHHa3H Acc. N AA Прямой и обратный праймеры1 (5'-3')
Abl - Abelson Murine Leukemia Viral Oncogene Homolog 1 NP_005148 2-601 GGATCCTTGGAGATCTGCCTGAAGCTG ACTCGAGCCGAACAAGTTGGTCTTTTG
Alk — Anaplastic Lymphoma Kinase Receptor NP_004295 1092-1406 CATGGATCCCTACAACCCCAACTAC GCTCGAGTTATTCCACAAGTGGACCAT
Blk — B-Lymphocyte Kinase NP_001706 2-505 GGATCCGGGCTGGTAAGTAGCA CTCGAGGGCTGCAGCTCGTACTG
CSF1R — Colony Stimulating Factor 1 Receptor NP_005202 545-972 GGATCCAAGTACCAGGTCCGCT CTCGAGCAGAACTGATAGTTGTTG
Csk — C-Terminal c-Src Kinase NP_004374 2-450 TGGATCCTCAGCAATACAGGCCGCC ACTCGAGAGGTGCAGCTCGTGGGTT
Eph A2 — Ephrin Receptor A2 NP_004422 562-976 AGATCTAGGAGGAAGAACCAGC CTCGAGATGGGGATCCCCACAG
FGFR1 — Fibroblast Growth Factor Receptor 1 NP_056934 398-820 GGATCCAAGAGTGGTACCAAGAAGAGT TTCTCGAGCGGCGTTTGAGTCCGCCATT
FGFR2 — Fibroblast Growth Factor Receptor 2 NP_075259 402-822 GGATCCAAGAACACGACCAAGAAGC CTCGAGGTTTTAACACTGCCGTTTATG
IGFR1 — Insulin-like Growth Factor 1 Receptor NP_000866 974-1294 GGATCCAGAAAGAGAAATAACAGCAGG GCTCGAGTTAATCCAGCTCCTCCGGCTC
InsR — Insulin Receptor NP_000199 982-1382 GGATCCAGGCAGCCAGATGGGCCGCTG CTCGAGGAAGGATTGGACCGAGGCAAG
Kit — Stem Cell Factor Receptor NP_000213 545-976 TGGATCCTACAAATATTTACAGAAACCC TTCTCGAGACATCGTCGTGCACAAGCAG
Lyn — Yamaguchi Sarcoma Viral Related Oncogene Homolog 2 NP_002341 полноразм. GGGATCCGGATGTATAAAATCAAAAGG GGAATTCTCGAGGGCTGCTGCTGGTATT
PDGFRa - Platelet-Derived Growth Factor Receptor-a NP_006197 552-1089 GGATCCAAGCCACGTTACGAGATCCGAT GTCGACAGGAAGCTATCCTCTGCTTCCG
Pyk2 — Focal Adhesion Kinase 2 NP_004094 353-762 TGGATCCCGGCTGCAGGGTGAGCACCA TTCTCGAGTTAACGGGAGATGGATACTC
Syk — Spleen Tyrosine Kinase NP_003168 полноразм. GGATCCGCCAGCAGCGGCATGGCTGAC CTCGAGTTCACCACGTCATAGTAGTA
Yes — Yamaguchi Sarcoma Viral Oncogene Homolog 1 NP_005424 11-542 CGGGATCCCCAGCCATTAAATACAGAC TCGTCGACAAATTTTCTCCTGGCTGGTA
1 - Выделены сайты рестрикции, используемые для переклонирования из T-easy вектора в pFastBacHT-B.
О-
Рис. 1. Анализ очищенных препаратов рекомбинантных 6хГис-ТК. Электрофореграмма разделения белков в 10 % ДСН-ПААГ с последующим окрашиванием Кумасси G-250. Слева маркер молекулярных масс (116, 97, 66, 55, 45, 36, 29, 24 кДа), далее — нанесены 10 мкл аликвоты 6хГис-ТК
на колонке PD-10 и после добавления ДТТ до 2 мМ и глицерина до 50 % помещали на -20°С.
Определение активности 6*Гис-ТК. В каждую киназную реакцию вносили АТФ до 10 мкМ концентрации, универсальный субстрат тирозиновых киназ poly(Glu4-Tyr) (Sigma, США) до 10 мкг и одну из 6*Гис-ТК в количестве 30, 60 или 90 нг в 1*киназном буфере: 50 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 5 мМ MnCl2, 5 мМ MgCl2 0.01 % Tween-20 и 2 мМ DTT. Для контроля исходного уровня АТФ реакции проводили в отсутствие киназы. Киназные реакции проводили в объеме 30 мкл в ячейках 384-луночных планшетов, при 30°С, в течение 15 мин и проявляли путем добавления 10 мкл реагента Kinase-Glo (Promega, США). Люминесценцию детектировали с помощью Fusion Universal Microplate Analyzer (PerkinElmer, США). Для определения активности 6*Гис~ТК проводили два эксперимента в трипликатах. Проведение скрининга коллекции низкомолекулярных соединений. Скрининг проводили путем определения способности химических соединений снижать активность тирозиновых киназ, измеряемую в люминесцентном ки-назном тесте. Все необходимые разведения компонентов киназных реакций готовили в 1*киназном буфере непосредственно перед началом скрининга. Реакции проводили в лунках 384-луночного планшета, в трипликатах, вручную или при помощи MultiPROBE II (Packard, США). В каждый планшет включали контрольные ячейки, содержащие АТФ с киназой без ингибиторов (0 % ингибирования) и АТФ без киназы (100 % ингибирования). Киназные реакции собирали и проводили в следующем порядке: 1) в лунки добавляли 10 мкл 30 мкМ потенциального ингибитора или 3 % ДМСО, 2) добавляли 10 мкл 1*киназного буфера с требуемым количеством киназы, 3) инкубировали 20 мин при 20°С, 4) добавляли 10 мкл 30 мкМ АТФ с 10 мкг poly(Glu4-Tyr), 5) инкубировали 90 мин при 30°С, 6) добавляли 10 мкл реагента Kinase-Glo и измеряли люминесценцию.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
С целью создания панели тирозиновых киназ для проведения скрининга химической коллекции были выбраны 16 белков, принадлежащих к пяти семействам рецепторных ТК и пяти семействам нерецепторных ТК (табл. 1). Для ре-
цепторных и некоторых цитоплазматических ТК вместо полноразмерных белков были использованы фрагменты, содержащие киназные домены, которые представляют собой функциональную модель для поиска и изучения АТФ конкурентных ингибиторов [11]. Для экспрессии рекомби-нантных белков была выбрана бакуловирусная система, считающаяся оптимальной для получения функционально-активных тирозиновых киназ [10]. В Ы-концевые области рекомбинантных белков были введены последовательности из 6 гистидиновых остатков, что позволяло выделять все шестнадцать 6*Гис-ТК в одну стадию с помощью металло-хелатной аффинной хроматографии на Ш2+-сефарозе, которую проводили, основываясь на методических рекомендациях, разработанных для данного типа хроматографии, и результатах аналитических экспериментов по оптимизации условий выделения белков. Финальный протокол выделения приведен в разделе «Материалы и методы».
Выделенные белки анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ в денатурирующих условиях с последующим окрашиванием Кумасси G-250 (рис. 1). Все 6*Гис~ТК обладали электрофоретическими подвижностя-ми, соответствующими расчетным молекулярным весам, и имели чистоту не менее 70 % (табл. 2). Все 16 продуктов экспрессии были однозначно подтверждены с помощью
Таблица 2. Характеристики 6хГис-ТК после стандартного эксперимента по наработке и выделению
бхГис-TK Мол. вес1 (кДа) Чистота2 (%) Выход3 (мг) Уд. акт.4, (нмоль/ мин ■ мг) Количество на 1 тест5, нг/тест
Abl 72.5 85 6 118 50
Alk 38.8 75 1 60 90
Blk 63.8 80 3.5 91 60
CSF1R 54.0 80 5 98 60
Csk 56.7 90 20 153 40
Eph A2 53.4 95 10 110 50
FGFR1 52.5 70 1.5 223 20
FGFR2 53.8 70 1.5 245 20
IGFR1 39.8 80 2 147 40
Insr 51.4 85 6.5 131 40
Kit 55.0 75 3 80 70
Lyn 63.4 75 1.5 332 20
PDGFR-a 67.4 70 2.5 84 70
Pyk2 52.0 80 3.5 86 70
Syk 78 70 1.9 131 50
Yes 65.7 70 1.5 273 20
1 — Расчетный молекулярный вес рекомбинантных 6хГис-ТК. 2 — Чистоту белка определяли с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ с последующим окрашиванием Кумасси G-250. 3 — Выход 6хГис-ТК из 1 литра (10 г) клеток определяли исходя из концентрации белка, определенной по методу Бредфорд. 4 — Удельные активности определяли при концентрации фермента 1.5 мкг/мл (45 нг/тест, рис. 2). 5 — Количество 6хГис-ТК, гидролизующее за 90 мин инкубации не более 80 % исходного количества АТФ, рассчитывали исходя из удельных активностей и проверяли экспериментально.
25 20 15 10
s. Д
/т ".Д
//
рф*
12
10
„ JO
.-■A
щ/s, ' * J.\
I.I' ^ - - - □
LT~ . - -
30 60 Э0
нг белка/тест
—И—Lyn —О -Yes
-A-FGFR2 -д-FGFRI
—•—Csk -0--Syk
-□-EphA2 -A-Blk
- -A
30 во 90
нг белка/тест
-IGFR1 —o-Insr
Abl -Д-CSFR
-PDGFRa -o- Kit Alk Pyk2
Рис. 2. Активность 6хГис-ТК. Активность киназ, измеренная в люминесцентном киназном тесте, выражена в пикомолях фосфата, перенесенного с молекул АТФ на субстрат poly(Gly4-Tyr) указанным количеством киназы за 1 мин. Представлены средние значения, полученные в результате двух экспериментов, проводимых в трипликатах
MALDI-TOF-масс-спектрометрии. Концентрацию очищенных 6*Гис~ТК определяли по методу Бредфорд, выходы рекомбинантных белков составляли от 1 до 20 мг белка на литр инфицированных клеток (табл. 2).
Для определения активности выделенных киназ был выбран метод, основанный на прямом одностадийном измерении количества АТФ в киназной реакции с помощью люминесцентного реагента Kinase-Glo, хорошо сочетающийся с процедурой проведения высокопроизводительного скрининга [12]. Уровень люминесценции, измеренный в киназной реакции или контроле, переводили в моляр-ность АТФ, используя стандартную кривую титрования, после чего определяли количество АТФ, гидролизованное
каждой киназой за 1 мин, и строили графики зависимости уровня киназной активности от количества фермента в реакционной смеси (рис. 2). Удельную активность определяли при концентрации фермента 1.5 мкг/мл (45 нг в реакции) и выражали в нмоль фосфата, перенесенного от молекулы АТФ на субстрат за 1 мин в пересчете на 1 мг киназы при стандартных условиях реакции. Удельная активность для 6*Гис-ТК, а также рассчитанные на ее основе количества ферментов, добавляемые в киназные реакции при проведении скрининга химической коллекции, приведены в табл 2.
Протокол проведения скрининга коллекции низкомолекулярных соединений приведен в разделе «Материалы и методы». Потенциальные ингибиторы тестировали против каждой из 16 киназ в одной рабочей концентрации (10 мкМ). При разработке протокола скрининга учитывали то, что люминесцентный реагент Kinase-Glo обеспечивает линейную зависимость между количеством АТФ в реакции и интенсивностью люминесцентного сигнала в диапазоне концентраций АТФ от 1 до 100 мкМ. Исходя из начальной концентрации АТФ 10 мкм количество добавляемой киназы подбирали так, чтобы по окончании инкубации в реакционной смеси оставалось не менее 20 % негидролизованного АТФ. Выбор проводили на основании удельной активности ТК и проверяли в аналитическом эксперименте. После проведения киназных реакций и измерения люминесценции относительные люциферазные единицы нормализовали на контрольные реакции и переводили в % ингибирования. Достоверность результатов скрининга подтверждали вычислением Z' фактора для каждого планшета, используя метод Zhang et al. [13]. Z' фактор для большинства планшетов составлял более 0.5, а среднее значение Z' фактора для всего скрининга было 0.59 ± 0.1. Соединения, в 10 мкМ концентрации ингибирующие активность хотя бы одной из 16 6*Гис~ТК на 50 % и более, отбирали для последующей проверки, проводимой в двух независимых экспериментах.
В результате проведенного скрининга были найдены шесть химических соединений, активных в отношении ТК,
Abl, Blk, FGFR1, PDGFRa, Yes он
Abl FGFR1 FGFR2 PDGFRa
Blk, Csk, EphA2, FGFR1, FGFR2, Lyn
HO
Blk
EphA2 FGFR1 FGFR2 Lyn
PDGFRa
Abl, Blk, FGFR1, FGFR2, Lyn, PDGFRa, Pyk2
Abl, Bl, Csk, EphA2, FGFR1 FGFR2, IGFR1, Lyn, PDGFRa
Рис. 3. Ингибиторы тирозиновых киназ, найденные при скрининге химической коллекции. В центре 2-гидроксифенольная группа, общая для всех 6 ингибиторов. Около каждого ингибитора указаны ТК, активность которых данное соединение в 10 мкМ концентрации подавляет на 50 % и более
содержащие в своем составе 2-гидроксифенольную группу (рис. 3). Поиск по базам данных Chemical Abstracts Service (http://www.cas.org/expertise/cascontent/registry/index. html) и PubChem BioAssay (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ sites/entrez?db=pcassay) выявил, что ни одно из найденных соединений не относится к числу известных ингибиторов тирозиновых киназ. Данные соединения одновременно ингибировали от четырех до девяти ТК. Наиболее частыми мишенями ингибирования были FGFR1, Abl, Blk, FGFR2, PDGFR-a, а также Lyn, Eph A2, Csk и в единичных случаях IGFR1, Pyk2, Yes. Так как все соединения содержали в своем составе 2-гидроксифенольную группу, мы предположили, что именно она отвечает за способности ингибиторов взаимодействовать с киназными доменами. Известно, что классические киназные ингибиторы имеют фармакофор (минимальную молекулярную основу, определяющую биологическую активность), в котором соседние ароматическая аминогруппа и ароматический азот или кислород карбонильной группы образуют пару координированных водородных связей с шарнирной областью киназного домена (АТФ-связывающий участок), имитируя водородные связи молекулы АТФ [14]. Молекулярный докинг ингибиторов I-VI, проведенный на основе известных пространственных структур киназных доменов Csk, FGFR1, FGFR2 с помощью программы Lead Finder [15], показал, что 2-гидроксифенольная группа тоже способна сформировать пару водородных связей с аминокислотами АТФ-связывающего участка и, следовательно, может быть рассмотрена в качестве нового фармакофора тирозинки-назных ингибиторов. Поиск аналогичного взаимодействия в базе данных Protein Data Bank (http://www.pdb.org/) выявил, что аналогичные водородные связи формируются в комплексах, образуемых фосфоинозитид-3-киназой (PI3-kinase) с флавоноидами кверцитином и мирицетином [16]. Следует отметить, что молекулярный вес соединений
I—VI значительно ниже, чем у всех известных ингибиторов ТК, что, вероятно, и объясняет их способность проникать в АТФ-связывающие карманы различных киназ. В то же время именно низкий молекулярный вес соединений обеспечивает возможность их дальнейшего модифицирования или комбинирования с фрагментами уже известных ингибиторов ТК с целью увеличения специфичности и эффективности в отношении выбранной мишени. В дальнейшем мы планируем подтвердить результаты моделирования в экспериментах по кристаллизации ТК с найденными ингибиторами.
ВЫВОДЫ
В результате проделанной работы была создана белковая панель функционально активных тирозиновых киназ и проведен скрининг коллекции низкомолекулярных органических соединений, в результате которого были отобраны шесть ранее неизвестных ингибиторов, содержащих в своем составе 2-гидроксифенольную группу. Молекулярный докинг активных соединений с помощью программы Lead Finder показал, что 2-гидроксифенольная группа может быть предложена в качестве основы для создания новых ингибиторов тирозиновых киназ. •
Данная работа поддержана Федеральным агентством
по науке и инновациям (ГК 02.512.12.2051) и программой Президиума Российской академии наук «Молекулярная и клеточная биология». Авторы выражают признательность ООО «Кембридж», Москва за предоставление химической коллекции, Р.Х. Зиганшину (лаборатория протеомики ИБХ РАН) за проведение MALDI-TOF-масс-спектрометрии и MolTech Ltd, Москва за проведение молекулярного моделирования.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Cohen P. // Nat. Rev. Drug Discov. 2002. V. 1. P. 309-315.
2. Gunby R.H., Sala E., Tartari C. J., Puttini M., Gambacorti-Passerini C., Mologni L. // Anti-Cancer Agents in Med. Chem. 2007. V. 7. P. 594-611.
3. Cohen M.H., Johnson J.R., Pazdur R. // Clin. Cancer Res. 2005. V. 11 (1). P. 12-9.
4. Jianming Z., Priscilla L., Gray N.S. // Nat. Rev. Cancer. 2009. V. 9. P. 28-39.
5. Hofmann W.-K., Jones L.C., Lemp N.A., de Vos S., Gschaidmeier H., Hoelzer D., Ottmann O.G., Koeffler H.P. // Blood. 2002. V. 99. P. 1860-1862.
6. Bain J., Plater L., Elliott M., Shpiro N., Hastie J., McLauchlan H., Klevernic I., Arthur S.C., Alessi D., Cohen P. // Biochem. J. 2007. V. 408. P. 297-315.
7. Faivre S., Djellou S., Raymond E. // Semin. Oncol. 2006. V. 33 (4). P. 407-420.
8. Drews J. // Science. 2000. V. 287. P. 1960-1964.
9. Anderson A. // Chem. & Biol. 2003. V. 10. P. 787-797.
10. Chambers S.P., Austen D.A., Fulghum J.R., Kim W.M. // Protein Expr. Purif. 2004. V. 36. P. 40-47.
11. Mologni L., Sala E., Riva B., Cesaro L., Cazzaniga S., Redaelli S., Marin O., Pasquato N., Donella-Deana A., Gambacorti-Passerini C. // Protein Expr. Purif. 2005. V. 41.
P. 177-185.
12. Koresawa M., Okabe T. // Assay and Drug Dev. Technol. 2004. V. 2. P. 153-160.
13. Zhang J.H., Chung T.D., Oldenburg K.R. // J. Biomol. Screen. 1999, V. 4, P. 67-73.
14. Fabbro D., Ruetz S., Buchdunger E., Cowan-Jacob S.W., Fendrich G., Liebetanz J., Mestan J., O'Reilly T., Traxler P., Chaudhuri B., Fretz H., Zimmermann J., Meyer T., Caravatti G., Furet P., Manley P.W. // Pharmacol Ther. 2002. V. 93 (2-3). P. 79-98.
15. Stroganov O.V., Novikov F.N., Stroylov V.S., Kulkov V., Chilov G.G. // J. Chem. Inf. Model. 2008. V. 48. P. 2371-2385.
16. Walker E.H., Pacold M.E., Perisic O., Stephens L., Hawkins P.T., Whymann M.P., Williams R.L. // Mol. Cell. 2000. V. 6. P. 909-919.
