CC BY
195
ИЗВЕСТИЯ
ПЕНЗЕНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ПЕДАГОГИЧЕСКОГО УНИВЕРСИТЕТА имени В. Г. БЕЛИНСКОГО ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ № 25 2011
IZVESTIA
PENZENSKOGO GOSUDARSTVENNOGO PEDAGOGICHESKOGO UNIVERSITETA imeni V. G. BELINSKOGO NATURAL SCIENCES № 25 2011
УДК 581.331.2: 582.632.1 (1-924.14) 16
ПАЛИНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ БИОИНДИКАЦИИ: ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДОЛИ АБОРТИВНЫХ ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЁРЕН И ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ПЫЛЬЦЫ
(ПО ШАРДАКОВУ)
© Л. И. ТУЖИЛОВА Пензенский институт технологий и бизнеса,
Филиал Московского государственного университета технологий и управления им. К.Г. Разумовского,
кафедра естественнонаучных дисциплин e-mail: ljudmila.tuzhilva@rambler.ru
Тужилова Л. И. - Палинологические методы биоиндикации: определение доли абортивных пыльцевых зерен и жизнеспособности пыльцы (по Шардакову) // Известия ПГПУ им. В.Г. Белинского. 2011. № 25. С. 605-609. -
На территории зоны защитных мероприятий и санитарно защитной зоны объекта по уничтожению химического оружия пос. Леонидовка проведены палинологические исследования Pinus sylvestris L. по методике В. С. Шардакова. Показано, что на территориях с высоким уровнем химического загрязнения жизнеспособность пыльцы снижается, а процент уродливой пыльцы значительно возрастает в сравнении с незагрязнённой территорией. Сделан вывод, что данную методику можно использовать для определения уровня химического загрязнения территорий. Ключевые слова: биоиндикация, пыльца, сосна обыкновенная, химическое загрязнение.
Toujilova L. I. - Bioindication methods by means of pollen: definition of abortive pollen seeds part and pollen viability (by Shardakov) // Izv. Penz. gos. pedagog. univ. im.i V.G. Belinskogo. 2011. № 25. Р. 605-609. - On the zone of protective measures and sanitary protective zone territory of object of chemical weapons destruction in settlement Leonidovka carried out the pollen research of Pinus sylvestris L. by Shardakov methodology. Pollen viability reduces, abortive pollen seeds part increases considerably on the territories with high level of chemical pollution in comparison with the territory without pollution. We concluded that this methodology can be used for level of chemical pollution definition of territories.
Keywords: bioindication, pollen, Pinus sylvestris, chemical pollution.
Биоиндикация - оценка качества среды обитания и ее отдельных характеристик по состоянию ее биоты в природных условиях. Палинологические методы биоиндикации - это оценка качества среды обитания, уровня её загрязнения, где в качестве тест-объекта используется пыльца растений.
Пыльца - микроспоры голосеменных и покры-тосеменныхрастений.Оболочкамикроспорназывает-ся спородермой. Она состоит из двух основных слоев: внешнего, более толстого - экзины и относительно тонкого внутреннего - интины. Экзина состоит из особого стойкого высокомолекулярного вещества - спо-рополленина, способного выдерживать крайние температурные и химические воздействия. Очень часто экзина несет специальные выросты и скульптурные утолщения, характерные для вида растения. Интина представляет собой тонкую пленку из целлюлозы и пектина. Под защитной оболочкой микроспоры формируется мужской гаметофит, представляющий собой двухклеточное образование. Микроспоры, содержащие мужской гаметофит, называются пыльцевыми зернами. В процессе образования пыльцы имеет место
два типа деления клеток: мейоз и митоз. Загрязнение среды вызывает нарушение в процессах мейоза и митоза, в распределении наследственного материала и синтезезапасныхвеществпыльцевогозерна.Высокую чувствительность к загрязнению показывает пыльца растений: сосны обыкновенной, лиственницы сибирской, березы повислой, валерианы лекарственной, лабазника вязолистного, иван-чая узколистного.
В ходе исследований, которые проводились на протяжении одного сезона цветения (апрель-июнь 2010 г.), были изучены популяции растений сосны обыкновенной (Ртж sylvestris Ь.). Пробы пыльцы отбирались на территории зоны защитных мероприятий (ЗЗМ) и санитарно защитной зоне (СЗЗ) объекта по хранениюиуничтожениюхимическогооружия(ОХУ-ХО ) в районе пос. Леонидовка Пензенской обл. Отбор проб производился непосредственно у фиксированных точек пробоотбора (реперов) в рамках проведения государственного экологического мониторинга. Контрольные образцы пыльцы были отобраны на территории заповедника Приволжская лесостепь. Сосна обыкновенная оказалась наиболее удобным объектом
исследования в сравнении с другими: широкое распространение, большое количество пыльцы, несложное и равномерное ее отделение из пыльников.
Ранее было установлено, что грунты на площадках прошлого уничтожения химического оружия загрязнены мышьяком до глубины 5 м, причём в верхнем слое почвы содержание этого элемента достигает десятков тысяч ПДК, на глубине 5 м оно снижается до нескольких сот ПДК [1]. Определение валового содержания мышьяка почвы и биоматериала площадок проводили методом ААС в модификации НПО «Тайфун». Содержание мышьяка в пробах почвы мест уничтожения химического оружия в десятки тысяч раз превышает ПДК этого элемента: 18467,2-57533,2 мг/ кг. Обнаруженные экстремально высокие концентрации мышьяка обусловлены органическими и неорганическими продуктами трансформации люизита.
Зафиксироваано наличие в пробах токсичных цис- и трансизомеров р-хлорвиниларсиноксида и р-люизита. Иприта и токсичных продуктов его окисления дихлордиэтилсульфоксида и дихлор-диэтилсульфона стандартными методами хромато-масспектрометрии не было обнаружено. Вместе с тем, в пробах были найдены полимерные соединения серы и целый ряд циклических соединений, содержащих серу, которые являются продуктами деструкции иприта. Следует отметить, что этим методом также не были
обнаруженыисходныеотравляющиевещества(иприт, а-люизит). Однако в пробах был выявлен непосредственный продукт окисления иприта - дихлордиэтил-сульфон и продукт последующего дегидрохлорирования - дивинилсульфон.
Перечень компонентов, выделенных из проб почвы, практически одинаков и включает в себя хлорор-ганические летучие углеводороды: 1.2-дихлорэтилен (транс), хлороформ, 1.2-дихлорпропан, трихлорэти-лен, 1.1.2-трихлорэтан, тетрахлорэтилен и серосодержащие соединения, в основном циклические: тиофен, 5,6-диметил-1.3-оксатиан,3-метил-1.4-оксатиан-2-он, 1.4-дитиан, 2.2-диалкил-1.3-дитиолан. Максимальное содержаниевпробахустановленодля 1.4-дитиана. Это соединение является одной из примесей (до 10%) технического иприта и одним из главных продуктов сжигания иприта. Почти все компоненты, обнаруженные в пробах, являются продуктами деструкции иприта и люизита.
На основании приведённых данных можно с уверенностью утверждать, что данные площадки являются местами прежнего уничтожения отравляющих веществ - иприта и люизита. Следовательно, токсичными веществами оказались загрязнены почвы, подстилающие их породы и подземные воды.
Территория, на которой в прошлом производилось уничтожение химического оружия в Пензен-
ской обл., представляет собой уникальный пример воздействия последствий уничтожения отравляющих веществ на все компоненты природной среды. Это своеобразная модель аварийной ситуации, на которой можно проводить апробацию методов мониторинга и изучать последствия возможных выбросов не на моделях, а в конкретных условиях, где они имели место. Кроме того, здесь могут апробироваться методы санации экосистем, пострадавших от уничтожения химического оружия.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Полевые опыты и лабораторные исследования проводились на базе Регионального центра государственного экологического контроля и мониторинга (РЦГЭКиМ) по Пензенской обл., в лаборатории биоиндикации.
Система пробоотбора составлена по классической методике, описанной В. Н. Чуписом [4] и включает 127 реперных точек для отбора проб (рис. 1). Реперные точки расположены равномерно по всему полигону и охватывают зоны с низким, средним и высоким уровнем химического загрязнения природных сред.
На базе названных реперных точек заложены стационарные площадки (400 м2), где проводились полевые опыты, и отбирался растительный материал для лабораторных исследований. Исследованиями
Таблица 1.
Показатели жизнеспособности пыльцы сосны обыкновенной на разных стационарных площадях в СЗЗ и ЗЗМ ОХУХО
Место пробоотбора (№ репера) Жизнеспособность пыльцы (среднее арифметическое), % Уровень химического загрязнения
Заповедник Приволжская лесостепь (контроль) 99±0,3 нет загрязнения
13 95±0.6 низкий
58 90±1.2 низкий
94 90±1.7 низкий
10 80±1.2 средний
22 70±1.2 средний
25 65±0.6 средний
52 70±2.3 средний
74 69±0.6 средний
92 69±0.3 средний
106 60±1.7 средний
26 55±1.2 высокий
43 46±0.6 высокий
56 15±2.9 высокий
62 49±0.3 высокий
97 55±0.6 высокий
было охвачено 15 пробных площадей. Количество пробных площадей ограничено распространением P. sylvestris. Для каждой точки был составлен паспорт, включающий характеристику её местоположения, описание растительного и почвенного покрова. Места отбора проб были обозначены реперами, представляющими собой отрезки металлических труб высотой 1,2 м, окрашенных в жёлтый цвет и имеющих соответствующий номер. Размеры площадей составили 20х20 м, т.е. 400 м2, что соответствует минимальным размерам площади, принятым для лесных сообществ в геоботанических исследованиях. Нумерация точек соответствует таковой в системе государственного экологического мониторинга (ГЭМ), где количество контролируемых точек значительно больше. Этим объясняется специфика нумерации, представленная на рис. 1. Точки пробоотбора расположены в соответствии с методиками пробоотбора, принятыми в системе Росгидромета для контроля всех природных сред (воздух, снежный покров, вода, донные отложе-ния,почва).Крометого,призакладкереперных точек учитывалась необходимость охвата всех типов растительных сообществ, находящихся на обследованной территории в целях совмещения мест пробоотбора для химико-аналитических исследований и работ по оценке состояния окружающей среды методами биотестирования и биоиндикации.
Таблица 2.
Показатели количества пыльцы сосны обыкновенной с резкими морфологическими отклонениями (в %) на разных стационарных площадях в СЗЗ и ЗЗМ ОХУХО
Место пробо-отбора (№/№ репера) Уродливость пыльцы, % Уровень химического загрязнения
Заповедник Приволжская лесостепь (контроль) 1±0.3 нет загрязнения
13 1±0.6 низкий
58 7±1.2 низкий
10 12±1.2 средний
22 20±1.5 средний
25 15±1.2 средний
52 10±0.6 средний
74 10±0.1 средний
26 52±1.7 высокий
43 52±0.3 высокий
56 54±1.5 высокий
62 52±0.6 высокий
Статистическуюобработкуэкспериментального материала проводили с использованием стандартных статистических методов [3, 2] и компьютерных программ Excel XP, STATISTICA 6.0. Планируемое количество измерений и анализов обеспечило 5%-ный уровень значимости при р = 95. Достоверность различий между отдельными вариантами выборки определяли по значению критерия Фишера (F).
ПРИНЦИП МЕТОДА
Для определения нормальных и абортивных пыльцевых зерен проводят окрашивание препарата слабым раствором йода. Нормальные пыльцевые зерна интенсивно окрашиваются, имеют одинаковые размеры и правильную форму (в зависимости от вида растения). Окраска нормальных пыльцевых зерен раствором йода может быть темно-синей, желтой, оранжевой и бурой. Абортивные пыльцевые зерна не окрашиваются или окрашиваются очень слабо, имеют различные размеры и неправильную форму (мятые, морщинистые). Подсчитывают количество и процент нормальных пыльцевых зерен и абортивных.
В основу работы была положена модифицированная методика определения жизнеспособности пыльцы по Шардакову [5, 6]. Поскольку ухудшение экологических условий снижает жизнеспособность пыльцы, она определяется по уровню активности фермента пероксидазы пыльцы. Для этого используется цветная реакция, в ходе которой пыльцевые зерна, характеризующиеся сравнительно высокой активностью пероксидазы окрашиваются в красноватый или малиновый цвет. Нежизнеспособная пыльца (с низкой пероксидазнойактивностьюилиееотсутствием)окра-шивается в желтый цвет или остается бесцветной.
Согласно методике, на предметное стекло кисточкой наносят нативную пыльцу, предварительно подсушенную при 26°С в течение 20 часов. Опыт же показывает, что реакция лучше протекает со свежей пыльцой. К пыльце при помощи стеклянной палочки добавляютсмесьчетырехраствороввравныхобъемах: бензидина основного, а-нафтола, карбоната натрия и
0.3% перекиси водорода. Пыльцу и раствор перемешивают препаровальной иглой и накрывают покровным
стеклом. Если под покровным стеклом накопилось много пузырьков воздуха, препарату дают постоять некоторое время. Через 3-4 мин. исследуют пыльцу при малом увеличении микроскопа. По окраске пыльцевых зерен делают вывод относительно жизнеспособности пыльцы. Для определения % жизнеспособной пыльцы проводят ее подсчет в 2-3 полях зрения микроскопа. Определение количества пыльцы в поле зрения микроскопа в нашем случае - сравнительный показатель, при котором за норму было принято количество пыльцы растений, произрастающих на контрольной территории. Для снижения вероятности артефактов добивались максимального единообразия приемов проведения анализа.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
За период исследований были изучены образцы пыльцы, отобранные из 15 точек. Получены статистически достоверные данные, отражающие зависимость качественного и количественного состояния пыльцы, взятой из разных точек пробоотбора (табл. 1).
Отправными показателями служили характеристики пыльцы растений, отобранных на территории памятника природы (в условно ненарушенных местообитаниях).
Количество пыльцы в поле зрения было минимальным в образцах, отобранных в местах прошлого уничтожения химического оружия (МПУ), в точках пробоотбора, соответствующих реперам 26, 43, 56, 62, 97. В этих же точках обнаружен значительный процент нежизнеспособных пыльцевых зерен и с резкими морфологическими отклонениями. Морфология пыльцы сосны представлена на рис. 2а-б.
Таким образом, прослеживается корреляция междуназваннымипоказателями.Наиболеезаметные совокупные отклонения от нормы в развитии пыльцевых зерен сосны обыкновенной были отмечены в точках (реперах): 26, 43, 56, 62, 97.
ВЫВОДЫ
Результаты палинологических исследований, представленные в табл. 1-2, свидетельствуют, что в целом показатели жизнеспособности пыльцевых зе-
Рис. 2. Морфология пыльцы сосны обыкновенной. Уровень загрязнения: а - высокий, б - низкий.
рен, а также доли уродливых пыльцевых зерен на территории санитарно защитной зоны и зоны защитных мероприятий объекта по уничтожению химического оружия достоверно отличаются от контрольных площадей (территория заповедника «Приволжская лесостепь»). Следовательно, данную методику можно использовать для определения уровня химического загрязнения территорий.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гончаров А.И. Опытно-экспериментальный полигон, как средство поиска типовых решений в области охраны окружающей среды, обеспечения экологической безопасности и регионального природопользования при хранении и уничтожении химического оружия // Экологические проблемы наследия «холодной
войны» и пути их преодоления. Матер. межд. научн.-практ. конф. Пенза, 2004. 90 с.
2. Никитин А.Я., Сосунова С.А. Анализ и прогноз временных рядов в экологических наблюдениях и экспериментах. Иркутск: ИГПУ, 2003. 83 с.
3. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск: Вышэйш. школа, 1973. 319 с.
4. Чупис В.П. Экологический мониторинг объектов уничтожения химического оружия - опыт создания и перспективы развития // Теоретическая и прикладная экология. 2007. № 2. С. 35-41.
5. Шардаков В.С. Реакция на пероксидазу как показатель жизнеспособности пыльцы растений // ДАН СССР. 1940. Т. 26. Вып. 3. 77 с.
6. Шардаков В.С. Новый простой метод определения жизнеспособности пыльцы хлопчатника // Зап.Тадж. с. х. инст., 1948. Т. 1. 73 с.
