CC BY
25
1 1 2 2 В.Д. Зинченко , К.Н. Головина , А.Н. Кириенко , И.И. Топчий
ОЗОН-ИНДУЦИРОВАННАЯ ГЕНЕРАЦИЯ СИНГЛЕТНОГО КИСЛОРОДА В ПЛАЗМЕ КРОВИ
1 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины,
2
Институт терапии им. Л.Т. Малой АМН Украины, Харьков, Украина
Изучалась реакция плазмы крови на действие озона методом хемилюминесценции с использованием уранина для регистрации активных форм кислорода. При введении озонированного физиологического раствора (ОФР) в систему уранин-плазма крови возникает короткая вспышка хемилюминесценции длительностью около 5 с и послесвечение, спадающее в течение 20 - 30 мин. Введение в систему перекиси водорода после запуска хемилюминесцентного ответа на озон не влияет на интенсивность послесвечения. Введение ионов двухвалентного железа приводит к снижению интенсивности послесвечения, однако при повторном введении ОФР послесвечение возобновляется. На основании полученных результатов делается вывод, что под действием озона в плазме крови запускается генерация синглетного кислорода.
Ключевые слова: хемилюминесценция, озон, флуоресцеин, уранин, плазма крови, синглетный кислород
There was studied the blood plasma reaction on ozone effect using chemiluminescence with uranine to recorder reactive oxygen species.
A short flash of chemiluminescence with a duration of about 5 s and the afterglow, decaying within 20-30 min, occur when administering the ozonized physiological saline (OPS) into the uranine-blood plasma system. The hydrogen peroxide introduction into the system after triggering a chemiluminescent response to ozone does not affect the afterglow intensity. The administration of ferrous ions reduces the afterglow intensity, but it is recovered during repeated OPS introduction. Basing on these findings we may conclude that under ozone effect the singlet oxygen generation is triggered in blood plasma.
Keywords: chemiluminescence, ozone, fluorescein, uranine, blood plasma, singlet oxygen
Известно, что озон в водных системах в присутствии органических молекул образует ряд других АФК. Целью настоящей работы явилась регистрация новых форм АФК, образующихся в плазме крови под действием озона.
Материалы и методы
Использовали донорскую кровь человека, которую предоставляла Харьковская станция переливания крови со сроком хранения не более 4 суток, в качестве антикоагулянта был использован 3,8% цитрат натрия. Плазму получали, собирая надосадок после центифугирования крови при 3000g в течение 15 мин. Озон получали путем электросинтеза, пропуская газообразный кислород через разработанный нами озонатор [Зинченко В.Д. и др. 2005]. Концентрацию растворенного в физиологическом растворе озона определяли спектрофотометрическим методом. Регистрацию хемилюминесценции производили при помощи разработанного нами хемилюминометра [Зшченко В.Д. и др. Пат. 2012]. Использовали уранин (УР) и аскорбиновую кислоту квалификации х.ч. (Sigma-Aldrich, США), перекись водорода квалификации х.ч. (Гамма Хим, Россия), сульфат железа (Sigma-Aldrich, США). Для запуска хемилюминесценции в кювету хемилюминометра, содержащую 500 мкл не забуференного раствора УР и 100 - 200 мкл плазмы крови вводили при помощи дозатора от 0, 2 до 1 мл озонированного физиологического раствора (ОФР) с концентрацией озона (1,2 -1,6)х10-4 М (6 - 8 мг/л).
Результаты и их обсуждение
На рис. 1 представлена осциллографическая запись хемилюмиесценции (ХЛ) системы УР-плазма крови при введении озона.
Хемилюминесцентный ответ системы УР-плазма крови на действие озона состоит из короткой (около 5 с) вспышки и послесвечения, время спада которого составляет от 20 до 30 мин. Короткую вспышку мы объясняем прямым окислением УР озоном [4 Nikokavouras J. Et я1. 1975]. Природа длительного послесвечения требует отдельного исследования.
Рис. 1 . Осциллографическая запись ХЛ системы УР-плазма крови под действием озона. В кювету хемилюминометра, содержащую 500 мкл раствора УР (100 мкМ) и 100 мкл плазмы крови человека, ввели 1мл ОФР с концентрацией озона 1,5-10"4М. В качестве меры интенсивности ХЛ используется напряжение на выходе хемилюминометра
На рис. 2 представлены результаты эксперимента, в котором после запуска ХЛ системы УР-плазма крови озоном регистрировали изменение интенсивности послесвечения, вводя в кювету хемилюминометра перекись водорода и сульфат железа.
Рис. 2. Влияние перекиси водорода, сульфата железа и повторного введения озона на интенсивность послесвечения системы УР-плазма крови, вызванного озоном. Условия эксперимента: в кювете хемилюминометра, содержащей 500 мкл УР (100 мкМ), вызвали послесвечение введением ОФР с концентрацией озона 1,5-10"4 М (момент начала послесвечения не показан); в ходе послесвечения в систему вводили перекись водорода (1 мл раствора Н2О2,1 мМ), сульфат железа (500 мкл, 10 мкМ) и повторно 200мкл ОФР (1,5-10"4М).
Моменты введения веществ указаны стрелками
Можно видеть, что перекись водорода не влияет на интенсивность послесвечения, откуда можно полагать, что перекись водорода не участвует в механизме развития послесвечения в исследуемой системе. Взаимодействие ионов двухвалентного железа Fe++ с перекисью
у, ++ у, +++
водорода приводит к окислению двухвалентного железа Fe до трехвалентного Fe и к образованию гидроксид-радикала (реакция Фентона). Если предположить, что исследуемое нами послесвечение связано с окислением УР, то в момент введения сульфата железа следовало бы ожидать возрастания интенсивности ХЛ, поскольку гидроксид-радикал является сильным окислителем. Однако, как видно на рис.2, этого не наблюдается, что дает основание исключить участие гидроксид-радикалов в механизме развития послесвечения. Повторное введение ОФР вызывает новую вспышку послесвечения. По нашему мнению, это является результатом того, что ионы трехвалентного железа не взаимодействуют с АФК и их присутствие в системе не препятствует запуску послесвечения под действием озона. Известен ряд хемилюминесцентных систем, в которых свет излучается флуоресцеином и его производными, что связано с переносом энергии от других химически активных частиц [ Diaz A.N. at al., 1997]. Мы полагаем, что наиболее вероятным претендентом на роль такой химически активной частицы может быть синглетный кислород, который образуется при
реакциях озона с органическими молекулами. Однако следует предположить существование и других механизмов запуска длительной продукции синглетного кислорода озоном в плазме крови, требующих дополнительного изучения.
Выводы
Хемилюминесцентная реакция системы уранин-плазма крови состоит из короткой вспышки длительностью около 5 с и послесвечения, спадающего в течение 20 - 30 мин. На основании полученных результатов делается вывод, что под действием озона в плазме крови запускается генерация синглетного кислорода, механизм которой требует дополнительных исследований.
Список литературы:
1. Зинченко В.Д., Голота В.И., Сухомлин Е.А., Таран Г.В., Белых И.А. Лабораторное оборудование для применения озоновых технологий в биологии и медицине // Проблемы криобиологии. 2005. Т. 15, №4. С. 712-718.
2. Пат. 72111. Украша, МПК G01N 21/76. Бюлюмшометр / В.Д. Зшченко, 1.П. Горяча, 1.В. Говор. Заявл. 05.01.2012; Опубл. 15.08.2012.
3. Nikokavouras J., Vassilopoulos G., Perry A. Some aspects of ozone-induced chemiluminescence of xanthene dyes. III. Stoichiometry and the chemiluminescence spectrum // Chim. Chren., New Ser. 1975. Vol. 4. P. 23-26.
4. Diaz A.N., Garcial J.A.G., Lovillo J. Enhancer Effect of Fluorescein on the Luminol-H2O2-Horseradish Peroxidase Chemiluminescence: Energy Transfer Process // J. Biolum. Chemilum. 1997. Vol. 12. P. 309-314.
