CC BY
66Фізика живого, Т. 20, No1, 2012. С. 35-39.
© Новікова І.П., Таран Н.Ю., Пацко О.В., Ситар О.В., Шторандт Р., Ольхович О.П.
УДК 574.632.017
ОЦІНКА ФІЗІОЛОГІЧНОГО СТАНУ РУХЛИВИХ ВИДІВ МІКРОВОДОРОСТЕЙ В УМОВАХ КУЛЬТИВУВАННЯ ЗА ПРИСУТНОСТІ НАДЛИШКУ ХРОМУ
1Новікова І.П., хТаран Н.Ю., хПацко О.В., хСитар О.В., 2Шторандт Р., 2Ольхович О.П.
1 Київський національний університет імені Тараса Шевченка, ННЦІнститут біології,
кафедра фізіології та екології рослин 2Інститут обробки зерна, Потсдам Німеччина
Надійшла до редакції 03.06.2012
Досліджено вплив K2Cr2O7, як модельного токсиканту, на життєдіяльність, ріст, біосинтез хлорофілу і потенційну фотосинтетичну активність клітин рухливих видів мікроводорстей (D.viridis Teod., Euglena gracilis Klebs.) з метою покращення ефективності промислового фотосинтезу у разі використання CO2 із газів промислових відходів підприємств, що містять токсичні домішки. Встановлено резистентність, а також сублетальні (1-15 мг/л) та летальні (вище 30 мг/л) концентрації хрому шестивалентного для досліджуваних видів.
Ключові слова: фотосинтетична активність, промисловий фотосинтез, рухливі мікроводорості, хром.
ВСТУП
Проблема забезпечення оптимальних умов для покращення продуктивності промислового фотосинтезу рухливих видів мікроводоростей у разі використання CO2 із газів промислових відходів підприємств, що містять токсичні домішки, є однією з актуальних проблем сучасної біотехнології. Регулювання умов вирощування рухливих водоростей за присутності токсикантів є необхідною умовою для досягнення високої продуктивності культур, що вирощуються в промислових обсягах. Встановлення порогових концентрацій токсикантів, насамперед в фотобіореакторах, у яких культивуються водорості для промислового кормового, харчового та фармакологічного використання є нагальною потребою сьогодення.
Відомо, що фоторух у водоростей є наслідком фотосинтетичних процесів - сукупності елементарних взаємодій, індукованих світловим імпульсом, а саме: фоторецепції, первинних реакцій фотосинтезу, трансформації енергії, сенсорного перетворення світлового стимулу у фізіологічний сигнал. Вивчення фотосинтетичних процесів рухливих видів водоростей, які використовуються для вирощування біомаси для промислових потреб та його залежності від токсичних домішок, що потрапляють до фотобіореакторів, має безпосереднє відношення не лише до формування загальних принципів регуляції внутрішньоклітинних процесів метаболізму, але й особливостей онтогенезу, ембріогенезу водоростей, що є дуже важливим під час промислового культивування водоростей у великих об’ємах, особливо у разі використанням відходів підприємств. Вивчення закономірностей первинних
фотосинтетичних процесів водоростей має велике практичне значення, оскільки забезпечить підвищення продуктивності цінних в господарському відношенні, не традиційних видів рухливих мікроводоростей. Використання швидкого, дешевого і, одночасно, надійного методу контролю фізіологічного стану рухливих представників мікроскопічних водоростей є необхідним для контролю їхньої продуктивності за умов промислового фотосинтезу.
Мета роботи полягала в дослідженні впливу супутніх елементів (на прикладі K2Cr2O7, як модельного токсиканту), які містяться в газах переробки промислових відходів і є присутніми в фотобіореакторах під час вирощування для промислових потреб біомаси економічно вигідних видів рухливих мікроводоростей. Основним завданням наших досліджень було вивчення змін вмісту хлорофілу а та потенціальної фотосинтетичної активності на різних стадіях розвитку рухливих видів водоростей (Euglena gracilis та Dunaliella viridis) за дії модельного токсиканту - біхромату калію, а також визначення чутливості та резистентності досліджуваних видів до присутності токсичних домішок, встановлення сублетальних та летальних концентрацій хрому шестивалентного, оцінка їхнього впливу на життєдіяльність, біосинтез хлорофілу і потенційну фотосинтетичну активність клітин рухливих водоростей.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Для дослідження використовували альгологічно чисті культури: Dunaliella viridis Teod., штам 42, яку одержано з колекції IBASU Інституту ботаніки імені
Новікова І.П., Таран Н.Ю., Папко О.В., Ситар О.В., Шторандт Р., Ольхович О.П.
Н.Г. Холодного НАН України та Euglena gracilis Klebs., яку люб’язно надано Центральною національною лабораторією Італії. Вирощування проводили на селективному поживному середовищі Артарі, рекомендованому для евгалобних видів водоростей [4]. Культивування водоростей проводили в колбах Ерленмейєра за температури 20 ± 2 оС, освітлення 4 500 - 5000 лк (тривалість світла й темряви - 12/12 годин) та періодичного
перемішування суспензії водоростей. В дослідах використовували культури, які знаходились на логарифмічній та стаціонарній фазах росту.
Як модельний токсикант використовували шестивалентний хром, який додавали в середовище у вигляді солі K2Cr2O7 за концентрацій (0,05 (ГДК), 15, 45, 75, 90, 105, 135 мг/л). Кількісний та якісний аналіз розвитку водоростей проводили через 1, 3, 7 і 14 діб контакту з токсикантом. Контролем був варіант без додавання токсиканту. Вміст хлорофілу а визначали в клітинах інтактних водоростей методом диференціальної флуорометрії з використанням Planctofluorometer FL 300 3M, розробленого
Красноярським університетом [1,2]. Одночасно вимірювали різницю інтенсивності флуоресценції до і після внесення симазину, як інгібітору електронного транспорту фотосинтезуючих клітин (AF), за яким визначали рівень життєздатності клітин, або показник їх потенціальної фотосинтетичної активності [5]. Повторність дослідів трикратна. Математичну обробку результатів здійснювали методами статистичного аналізу [3].
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Результати наших досліджень показали, що внесення K2Cr2O7 у субстрат вирощування, навіть за короткочасного контактування (впродовж 1 доби)
впливало на вміст хлорофілу а в клітинах Euglena gracilis (рис. 1).
Через 1 добу контакту клітин водорості з K2Cr2O2 за концентрацій (0,05, 1 мг/л) спостерігалося
підвищення вмісту хлорофілу а. Максимальна його концентрація дорівнювала 500,54 ± 27,15 мкг/л при концентрації 1 мг/л K2Cr2O2 в порівнянні з контролем - 436,50 ± 15,75 мкг/л.
Отримані нами дані показали, що в клітинах Euglena gracilis через 1 добу контакту, навіть за високих концентрацій K2Cr2O2, вміст хлорофілу а знизився лише на 20,4% порівняно з контролем і залишився на рівні 347,38 ± 19,46 мкг/л.
Показник потенціальної фотосинтетичної активності клітин (величина AF) також реєструвалася на досить високому рівні, що свідчить про інтенсивний ріст водорості і відповідає інтенсивності фотосинтезу в межах 70-90 % від максимально можливого (рис. 2).
Збільшення часу контакту клітин водорості з токсикантом до 4 діб в деяких випадках стимулювало дію низьких концентрацій біхромату калію. Підвищення сягало 24,1 % (Рис. 1.) для гранично допустимої концентрації токсиканту - 0,05 мг/л і 26,8 % для концентрації 1 мг/л. Однак, при подальшому збільшенні часу контакту, відмічалося зниження концентрації хлорофілу а до значно меншої величини (45 мг/л і нижче).
Показник потенціальної фотосинтетичної активності визначений через 4 доби контакту, свідчив про певну адаптацію клітин водорості до токсиканту, на нашу думку, за рахунок його відновлення. В порівнянні з контролем, рівень потенціальної фотосинтетичної активності навіть підвищувався.
700 | 600
“ 500 ч '■&
Ю 400
О
Ч
X
s 300
'се
& 200 я
о
я 100
о
0
□ Через 1 добу
□ Через 4 доби
□ Через 7 діб
Контр. 0,05 1 15 30 45 60 75 90 105 120 135
Концентрація K2Cr2O7, мг/л
Рис. 1. Оцінка впливу K2Cr2O7 на динаміку хлорофілу а в клітинах Euglena gracilis
□ Через 1 добу
□ Через 4 добу
□ Через 7 добу
0,6 і
Й 0,5
I £ 0,4
° а
© -С
-Є Й 0,3 -н
- S
3s % 0,2-И
ч
•а 0,1 -н
■І!
II
ш
Контр. 0,04 1
14
30
44
60
74
90
104
120
134
Концентрація K2Cr2O7, мг/л Рис. 2. Зміни потенціальної фотосинтетичної активності Euglena gracilis за дії K2Cr2O7
І 200 п
.5 140
□ Через 1 добу
□ Через 4 доби
□ Через 7 діб
Ч 100
S 40 —
1 h г
І1 h I 111 h h fl.ntrl.nim. 1
Контр. 0,04
14
30
44
60
74
90
104
120
134
Концентрація K2Cr2O7, мг/л
0
0
Рис. 3. Вплив K2Cr2O7 на концентрацію хлорофілу а у клітинах Dunaliella viridis.
□ Через 1 добу
□ Через 4 доби
□ Через 7 діб
Контр. 0,04 1 14 30 44 60 74 90 104 120 134
Концентрація K2Cr2O7, мг/л
Рис. 4. Зміни потенціальної фотосинтетичної активності Dunaliella viridis за дії K2Cr2O7
При збільшенні часу контакту клітин з біхроматом gracilis. За низьких концентрацій K2Cr2O2
калію до 7 діб спостерігалось значне підвищення спостерігалось незначне підвищення концентрації
токсичної дії токсиканту для тест-об’єкту Euglena хлорофілу а (на 3,4 - 9,6 %) порівняно з контролем.
Новікова І.П., Таран Н.Ю., Папко О.В., Ситар О.В., Шторандт Р., Ольхович О.П.
Для найбільших досліджуваних концентрацій біхромату калію (120 и 135 мг/л) рівень потенціальної фотосинтетичної активності водорості різко знизився (до 0,1 %), що свідчить про значне пригнічення клітин водорості та їх відмирання. В цих умовах здатність до фотосинтезу зберігали лише окремі клітини, які вижили.
Підвищення біосинтезу хлорофілу в клітинах Dunaliella viridis (на 45 % порівняно з контролем) спостерігалося за 4 доби контакту клітин водорості з біхроматом калію (за концентрації 0,05 мг/л). Це свідчить про те, що за низьких концентрацій хром використовується клітиною досліджуваної водорості як мікроелемент (рис. 3).
Однак, вже за 7 діб контакту стимулюючий ефект знизився до 5 %, а концентрація хлорофілу а знизилась на 75 % порівняно з контролем.
Отримані дані за показником фотосинтетичної активності клітин водорості Dunaliella viridis підтверджують той факт, що токсичність біхромату калію підвищується у разі збільшення періоду контактування з ним клітин. Про це свідчить і те, що вже за 7 діб контактування з токсикантом відбувалося необоротне пригнічення життєдіяльності клітин навіть за найменшої досліджуваної концентрації K2Cr2O7 - 0,05 мг/л.
Потенціальна фотосинтетична активність клітин водорості Dunaliella viridis змінювалась не так суттєво (рис. 4). За сім діб експозиції вона знизилась на 5 - 22 % для концентрацій біхромату калію від 0,05 ГДК до 15 мг/л і на 40-55 % для концентрацій 60 мг/л і вище.
Порушення механізмів основних процесів метаболізму клітин (утворення і використання продуктів фотосинтезу, зміни потенціальної фотосинтетичної активності клітин, порушення процесів росту і поділу) може призвести до загибелі не лише окремого організму, але й популяції в цілому. Тривалість адаптації досліджуваних водоростей до впливу пошкоджуючи концентрацій біхромату калію може бути різною - від декількох хвилин до днів, або навіть місяців. Ймовірно, адаптація забезпечує не лише певний рівень толерантності клітин рухливих видів мікроводоростей, а й стійкість їхніх клітин до токсичного впливу. За цей час активуються ферментні процеси, що беруть участь в стабілізації метаболізму не лише окремої клітини, але й популяції в цілому.
Визначений інтервал порогових концентрацій біхроматау калію до двох досліджуваних видів може слугувати критерієм адаптаційного потенціалу клітин за хронічного впливу цього токсиканту у разі використання як джерела вуглецю газів промислових відходів підприємств, що містять токсичні домішки. Проведена в експерименті оцінка порогу чутливості, на прикладі модельного токсиканту (K2Cr2O7), для двох досліджуваних видів рухливих мікроводоростей дозволить розрахувати екологічно допустиму концентрацію інших токсикантів і зберегти чисельність клітин і їхню життєздатність на
контрольному рівні, що особливо важливо під час промислового вирощування цих видів.
ВИСНОВКИ
1. Зміни у вмісті хлорофілу а та потенціальній фотосинтетичній активності рухливих видів водоростей (Euglena gracilis та Dunaliella viridis) за дії модельного токсиканту - біхромату калію дозволили визначити чутливість та резистентність досліджуваних видів, встановити сублетальні (1-14 мг/л) та летальні (30 мг/л і вище) концентрації хрому шестивалентного.
2. Отримані значення показників потенціальної фотосинтетичної активності клітин Euglena gracilis та Dunaliella viridis підтверджують той факт, що токсичність біхромату калію підвищується не тільки при підвищенні його концентрації, а й у разі збільшення часу контакту з ним клітин, особливо негативний ефект проявився вже на 7 добу. Варто також відмітити, що зміна рухливості клітин Dunaliella viridis може спричинювати суттєву гетерогенність їхнього розподілу в суспензії, що слід враховувати під час промислового вирощування цього виду.
3. Реакції відгуку водоростей двох досліджуваних видів на вплив біхромату калію були аналогічними, однак потенціальна фотосинтетична активність клітин водорості Dunaliella viridis змінювалась менше, ніж у Euglena gracilis, що свідчить про вищу резистентність даного виду.
4. Стійкість до біхромату калію Dunaliella viridis була тимчасовою, лише впродовж перших днів, а за 7 діб контактування з токсикантом спостерігалося необоротне пригнічення життєдіяльності клітин, навіть за найменшої досліджуваної концентрації K2Cr2O7 - 0,05 мг/л, що переконливо свідчить про те, що, у разі потрапляння до фотобіореакторів токсичних домішок, зберегти продуктивність цих водоростей на рівні контролю буде надто складно, а у разі постійного надходження токсиканта майже неможливо.
Література
1. Гольд В.М., Гаевский Н.А., Григорьев Ю.С. и др. Теоретические основы и методы изучения флуоресценции хлорофилла. -Красноярск: КГУ, 1984. -84 с.
2. Гольд В.М., Попельницкий В.А. Определение фотосинтеза водорослей флуоресцентным методом /Методические вопросы изучения первичной продукции планктона внутренних водоемов. -М.: Гидрометеоиздат, 1993. -С. 2529.
3. Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиям использованием Excel. - К.: Морион, 2000. -320 с.
4. Масюк Н.П., Терещук О.А. Коллекция культур водорослей Института ботаники имени Н.Г.Холодного АН УССР /Громов Б.В. Культивирование коллекционных штаммов водорослей. -Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1983. -С.403-413.
З9
5. Паршикова Т.В., Сиренко Л.А., Щеголева Т.Ю., Колесников В.Г. Экспресс-контроль роста и физиологического состояния микроводорослей // Альгология. -2001. -11, №3.
-С.403-413.
ОЦЕНКА ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ПОДВИЖНЫХ ВИДОВ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ В УСЛОВИЯХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ В ПРИСУТСТВИИ ИЗБЫТКА ХРОМА
Новикова И.П., Таран Н.Ю., Пацко.Е.В., Ситар О.В., Шторандт Р., Ольхович О.П.
Исследовано влияние K2Cr2O7, как модельного токсиканта, на жизнедеятельность, рост, биосинтез хлорофилла и потенциальную фотосинтетическую активность клеток подвижных видов микроводорслей (D.viridis Teod., Euglena gracilis Klebs.) с целью улучшения эффективности промышленного фотосинтеза при использовании CO2 из газов промышленных отходов предприятий. Установлены резистентность, а также сублетальные (1-15 мг / л) и летальные (свыше 30 мг / л) концентрации хрома (VI) для исследуемых видов.
Ключевые слова: потенциальная фотосинтетическая активность, промышленный фотосинтез, подвижные микроводоросли, хром.
PHYSIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF MICROALGAES (D.viridis Teod., Euglena gracilis Klebs.) UNDER EFFECT OF CULTIVATION WITH CHROMIUM
Novikova I.P., Taran N.Yu., Patsko O.V., Sytar O.V., Storandt R., Olhovych O.P.
The effect of K2Cr2O7, as a model toxicant, on the growth process, chlorophyll biosynthesis and potential photosynthetic activity of the cells of mobile microalgae (D.viridis Teod., Euglena gracilis Klebs.) with aim to improve the efficiency of industrial photosynthesis under the use CO2 from industrial waste gases companies. Resistant and sublethal (1-15 mg/L) and mortality (more than 30 mg / L) concentrations of chromium (VI) for the investigated species were studied.
Keywords: potential photosynthetic activity, industrial photosynthesis, mobile microalgae, chrome.
