CC BY
23
УДК 58.071
Ивлиева В.Н., Шагаев А. А., Горюнова О.Б., Марквичёв Н.С.
ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ ВЫСУШИВАНИЯ КЛЕТОК БАКТЕРИЙ РОДА ЯННОБИШБЕЗ ПОТЕРИ ИМИ СВОИХ СВОЙСТВ
Ивлиева Василиса Николаевна, магистрант 1-го курса факультета биотехнологии и промышленной экологии, email: asilisav.d@yandex.ru;
Шагаев Антон Александрович, аспирант кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева; Горюнова Ольга Борисовна, к.т.н., генеральный директор ООО «БИОМ-ПРО»; Марквичёв Николай Семёнович, к.т.н., доцент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева; Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20.
Изучена возможность получения сухой формы клеток бактерий рода Rhizobium без потери свойств и с сохранением высокой концентрации клеток. Так же исследована способность к образованию клубеньков на корнях растений сои после обработки высушенными клетками Bradyrhizobium japonicum. Ключевые слова: ризобии; лиофильная сушка; вирулентность; симбиотическая азотфиксация
STUDY OF THE POSSIBILITY OF DRYING CELLS BACTERIA OF THE GENUS RHIZOBIUM WITHOUT LOSS OF THEIR PROPERTIES
Ivlieva V.N.*, Shagaev A.A., Goryunova О.Б., Markvichev N.S.
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. *email: asilisav.d@yandex.ru
The possibility of obtaining a dry form of cells of bacteria of the genus Rhizobium without loss ofproperties and while maintaining a high concentration of cells was studied. The ability to form nodules on the roots of soybean plants after treatment with dried Bradyrhizobium japonicum cells was also investigated. Key words: rhizobia; freeze drying; virulence; symbiotic nitrogen fixation
Фиксация азота из атмосферы является одним из важнейших процессов в естественных биоценозах поскольку обеспечивает растения доступной формой азота. Проблема биологической азотфиксации относится к числу основных проблем сельскохозяйственной и биологической науки [1,2]. Процесс связывания и усваивания азота микроорганизмами имеет большое значение и находит широко практическое применение в производстве биоудобрений, в то время как производство химических азотных удобрений требует больших затрат энергии, ресурсов, и они могут быть вредны с экологической точки зрения. Интерес к азотфиксирующим бактериям также объясняется возможностью повышения урожайности растений. Наиболее эффективными азотфиксаторами являются роды бактерий Rhizobium, Bradyrhizobium, Mezorhizobium, Sinorhizobium, Azorhizobium (обобщенно эти бактерии принято называть ризобиями), вступающие в симбиоз с высшими растениями. Особенность симбиоза заключается в том, что на корнях бобовых растений образуются клубеньки, посредством которых происходит фиксация атмосферного азота в наиболее усваиваемую для растения форму [2].
Всестороннее изучение проблемы азотфиксации привело к необходимости разработки новых эффективных биологических препаратов. Создание и применение биопрепаратов на основе азотфиксирующих микроорганизмов — наиболее эффективный способ повышения продуктивности растений и качества урожая, который позволяет сохранять естественное плодородие почв и экологическое равновесие окружающей среды. Их использование дает возможность регулировать
численность и активность полезной микрофлоры в ризосфере возделываемых культур, а также обеспечивать растения азотом, фиксированным из атмосферы [3,4].
В настоящее время биопрепараты на основе ризобий представлены в жидкой форме и это ограничивает их широкое применение, поскольку имеет ряд недостатков. Во-первых, предпосевная обработка семян производится заранее, а это в свою очередь увеличивает вероятность развития посторонней микрофлоры. Во-вторых, жидкая форма препаратов имеет маленький срок хранения. Помимо этого, существует проблема транспортировки таких биопрепаратов, в то время как сухая форма является более выгодной и удобной.
Данная работа посвящена изучению возможности получения сухой формы клеток бактерий рода Rhizobium и сохранения способности образовывать клубеньки на корнях растений (вирулентность).
В качестве объектов исследования были использованы штаммы Rhizobium lupini В1069, Rhizobium leguminosarum B1111, Mesorhizobium cicero B1112, Bradyrhizobium japonicum B1118, предоставленные коллекцией кафедры
биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева.
Первым этапом работы было изучение возможности получения сухой формы клеток. Для этого микроорганизмы выращивали глубинным способом в аэробных условиях при температуре 28 °С и 160 об/мин на маннитно-дрожжевой среде следующего состава (г/л): маннит - 10; дрожжевой экстракт - 1; MgSO/V^O - 0,2; NaCl - 0,15; K2HPO4 - 0,5. Продолжительность культивирования для штаммов штаммы Rhizobium lupini В1069,
Rhizobium leguminosarum B1111, Mesorhizobium cicero B1112 - 48 часов, для Bradyrhizobium japonicum B1118 - 120 часов. По окончанию культивирования биомассу отделяли от культуральной жидкости путем центрифугирования при 7200 об/мин в течение 15 минут. После центрифугирования фугат имел прозрачный цвет и при помощи метода Коха было установлено отсутствие в нем жизнеспособных клеток. Полученный осадок (паста) был высушен на
лиофильной сушке без использования протектора, так как предполагалось, что продуцируемый бактериями полисахариды могут выступать в качестве защитного агента. На данном этапе определялись следующие характеристики: кол-во жизнеспособных клеток (КОЕ) после завершения культивирования, в пасте и в сухой форме; массы осадков до и после лиофильной сушки. Полученные результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1. Основные характеристики культивирования и получения сухой формы клеток
Характеристика Rhizobium lupini В1069 Rhizobium leguminosarum B1111 Mesorhizobium cicero B1112 Bradyrhizobium japonicum B1118
Кол-во жизнеспособных клеток, КОЕ/мл На конец культивирования 1,5*109 2*109 1,1*109 2,8*108
После центрифугирования в осадке (пасте) 4*1010 7*1010 5,8*1010 1,3*109
В сухой форме 1,4*10" 2,45*10" 1,9*10" 1*1010
Результаты описанного выше эксперимента показали, что для получение сухой формы клеток возможно использовать лиофильную сушку, так как сохраняется концентрация жизнеспособных клеток. Следующим этапом исследования было определение способности образовывать клубеньки на корнях растения, которые предварительно были обработаны сухой формой клеток.
Для проведения эксперимента были выбраны семена сои, поскольку с каждым годом спрос на эту культуру увеличивается, следовательно, возрастает посевная площадь и усиливается интерес к эффективным и экологически безопасным препаратам.
Эффективность сухой формы клеток штамма ВгайугЫгоЪшт ]аротсит Б1118 по способности образовывать клубеньки определялась в соответствии с методикой, описанной в патенте № 4205849/30-13 [5]. В качестве контроля использовались семена, обработанные стерильной водой. По истечению 30 суток производился подсчет клубеньков на корнях растений: на корнях контрольных растениях клубеньков не было обнаружено, на обработанных растениях кол-во клубеньков в среднем составило 6 клубеньков/семя (рис. 1).
Рисунок 1. Корневая система сои на 30 сутки выращивания: контроль(а) и обработка сухими клетками
(б)
На основе результатов, описанных выше, можно сделать следующие выводы. Для получения сухой формы клеток клубеньковых бактерий рода ЯЫгоЪшт возможно использование лиофильной сушки, при этом микроорганизмы не теряют свою жизнеспособностью. Помимо этого сохраняется важное свойство микроорганизмов - фиксация атмосферного азота из атмосферы, что подтверждает
образование клубеньков на корневой системе обработанных растений. Таким образом, получение сухой формы препарата с заданными свойствами является возможной и необходимо проводить дальнейшие исследования по оптимизации условий сушки и изучению свойств микробного полисахарида, который теоретически выступает в роли протектора.
Список литературы
1. Сытников ДМ. Биотехнология микроорганизмов-азотфиксаторов и перспективы применения препаратов на их основе // бютехнолопя. - 2012. Т.5. - №4. - С. 34-45.
2. Уранян Г.Р. Биопрепараты на основе Bradyrhizobium japonicum и проблемы их применения // Метеорологический вестник. -2018. - Т.10. - №5. - С.41-49.
3. Тильба В.А. Вирулентность клубеньковых бактерий сои и масштабы усвоения симбиотического азота в почвах Приамурья //
Масличные культуры. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-
исследовательского института масличных культур. - 2016. - Вып. 4 (168). - С. 61-66.
4. Сидорова О.И., Герасимюк Е.Ю., Дмитриева Е.Н., Марквичёв Н.С. Исследование стабильности и активности образования клубеньков бактериями Bradyrhizobium japonicum в свободном и иммобилизованном состоянии при хранении на семенах сои //Успехи в химии и химической технологии. - 2012. - Т. 26. - №. 10. - С. 109-111.
5. Способ первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои / В.А.Тильба, С.А.Бегун, Е.В.Садовская; Всероссийский научно-исследовательский институт сои. - № 4205849/30-13; заявл. 04.03.87; опубл. 30.05.89, Бюл. № 20.
