ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ОБРАЩЕННО- ФАЗНОЙ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ В ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ РЯДА ГРУПП ЛЕКАРСТВЕННЫХ И ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

март -

ап рел ь 2012

УДК 615.9:543.544.943.3

Оценка возможности использования обращенно фазной тонкослойной хроматографии в химико-токсикологических исследованиях ряда групп лекарственных и химических соединений

Поспелова А.А., Карпова Л.Н., Малкова Т.Л.

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

При установлении причины отравления химико-токсикологический анализ является наиболее важным видом исследования. В качестве одного из аналитических методов большой популярностью пользуется ТСХ благодаря доступности, простоте выполнения, экспрессности. Для повышения достоверности проводимых исследований продемонстрирована возможность применения в скрининге ряда лекарственных и химических соединений наряду с традиционным вариантом ТСХ обращенно-фазного варианта.

Ключевые слова: отравления, химико-токсикологический анализ, обращенно-фазная тонкослойная хроматография (ОФ ТСХ).

Введение. Основываясь на данных ГУЗ «Пермское областное бюро судебно-медицинской экспертизы», ГУЗ «Самарское областное бюро судебно-медицинской экспертизы», МУЗ МСЧ №9 им. М.А. Тверье г. Перми о структуре лекарственных средств, наиболее часто обнаруживаемых при химико-токсикологических исследованиях, были определены группы соединений, которые наиболее часто являются причинами отравлений. К их числу относятся производные 1,4-бензодиазепина (хлоридиазепоксид, диазепам, феназепам), фенотиазина (хлорпромазин, прометазин, трифлуопера-зин, этаперазин), соединения группы опиатов, опиоидов (морфин, этилморфин, кодеин, тримепе-ридин, трамадол), фенилалкиламинов (эфедрин, эфедрон), а также следующие фармакологические группы: ряд представителей местных анестетиков (прокаин, оксибупрокаин, кокаин, лидокаин, ропивакаин, анилокаин, тримекаин, пиромекаин, бупивакаин, мепивакаин, артикаин), антидепрессантов (амитриптилин, тианептин, имипрамин, флуоксетин), спазмолитических средств (папаверин, дротаверин), антигистаминных средств (клемастин, хлоропирамин, дифенгидрамин, мебгидролин, доксиламин), лекарственных средств, действующих на центральную нервную систему посредством различных механизмов (азалептин, галоперидол, рисперидон, тригексифенидил, карбамазепин, то-физопам).

После бурного развития в середине XX века ТСХ, потесненная в 90-х годах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, в последние годы получила новый импульс для развития, что привело к возрастанию роли этого метода в аналитических исследованиях [3, 5]. Благодаря доступности, простоте выполнения, экспрессности метод ТСХ широко применяется в работе специалистов в области химико-токсикологического анализа, однако наименее исследованным является обращено-фазный вариант ТСХ.

ТСХ является реализацией жидкостной хроматографии (ЖХ) на плоскости. Триада элюент / сорбент / сорбат определяет успех разделения в ЖХ. Удерживание анализируемых соединений в хроматографическом процессе происходит, главным образом, за счет электростатических сил между молекулами сорбата и молекулами каждой из фаз. Среди электростатических взаимодействий наиболее универсальными являются дисперсионные, так как они могут осуществляться даже по отношению к атомам и молекулам, не обладающим постоянным дипольным моментом [2, 4, 6, 8].

В случае ОФ ТСХ сольвофобное вытеснение менее полярных молекул аналитов из полярной среды элюента к неполярной поверхности сорбента происходит за счет диполь-дипольных взаимодействий полярных молекул подвижной фазы, их сильного притяжения одна к другой. Роль поверхности неподвижной фазы в ОФ варианте хроматографии - выступать акцептором молекул сорбата ориентированных к ней гидрофобным фрагментом, и удерживать его слабыми дисперсионными силами [5, 7]. При совместном действии сольвофобных и силанофильных эффектов связь с поверхностью сорбента, а, следовательно, и удерживание, зависят от пространственного расположения полярных и гидрофобных центров на поверхности сорбента и в молекуле вещества, а также размеры молекул сорбатов, их дипольный момент и поляризуемость [1, 5].

В наиболее распространенном нормально-фазном (НФ) варианте ТСХ полярность подвижной фазы ниже, чем неподвижной, что отличает его от ОФ варианта ТСХ. Для решения аналитических задач в сфере химико-токсикологического исследования необходима возможность изучения хрома-тографического поведения ряда токсикологически важных веществ в разных условиях для повышения достоверности идентификации.

Методика исследования. В качестве стандартных растворов были использованы хлороформные извлечения изучаемых веществ, концентрация которых составляла 1 мг/мл. Исследования проводились на пластинах с привитой фазой С18 производства фирмы «Merck», имеющих подложку из алюминиевой фольги с люминофором, позволяющим просматривать пластины в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм. На расстоянии 1,5 см от нижнего края пластины размером 9х12 см были нанесены в виде точек диаметром 3 мм исследуемые вещества с помощью микрошприца «Hamilton». Объем наносимого раствора составлял 2 мкл; длина пробега растворителя - 10 см. В качестве детектора был использован УФ-свет, в результате чего аналиты проявлялись в виде фиолетовых пятен на светлом фоне. Значения величин Rf явились средним результатом не менее трех параллельных измерений.

Результаты и обсуждение. При условии постоянства сорбата и сорбента удерживание будет зависеть только от параметров подвижной фазы, поэтому в данном случае поиск оптимальной хроматографической системы был сведен к поиску рациональной комбинации растворителей (табл. 1, 2).

Ввиду незначительной разделяющей способности однокомпонентных подвижных фаз, а также неудовлетворительной сходимости параметров удерживания таких систем, что было подтверждено экспериментально на примере ацетонитрила и этанола, исследования продолжились в бинарных системах. С целью увеличения селективности и эффективности подвижной фазы был введен второй компонент - 25% раствор гидроксида аммония. Этот выбор был сделан по причине его способности придавать элюирующей системе основные свойства, увеличивать ее полярность, вследствие чего уменьшается ионизация изучаемых соединений, что способствует образованию более компактных пятен на хроматограмме. Соответственно, введение 0,01 М раствора дигидрофосфата калия, обладающего кислой реакцией среды, не позволило добиться оптимальных результатов, напротив, в результате детектирования обнаружились «хвосты» позади основных пятен, что затруднило идентификацию анализируемых соединений. Тем не менее, система растворителей, содержащая в своем составе вышеназванный буферный раствор, оказалась оптимальной при частном скрининге ряда антидепрессантов (0,01 М раствор калия дигидрофосфата-ацетонитрил-диэтиламин10:90:0,2 (А), что, возможно, объясняется введением основного компонента диэтиламина, который препятствует размыванию хроматографических зон на пластине.

Рассматривая подвижные фазы состава этанол - 25% раствор аммиака в соотношениях 1:1 (Б)

и 2:3 (В), можно отметить их пригодность для определения папаверина и дротаверина при частном скрининге. Хроматографическое поведение ряда рассматриваемых веществ (производных фенотиазина, некоторых представителей антигистаминных средств, азалептина, галоперидола, рисперидона, тригексифенидила, карбамазепина и тофизопама) позволяет использовать систему, состоящую из этанола 25% раствора аммиака в соотношении 7:3 (Г) при частном скрининге. Однако, в этих условиях местные анестетики, опиаты, опиоиды, фенилалкиламины имеют большее сродство к подвижной фазе, чем к неподвижной, и поднимаются с фронтом растворителя. Увеличив содержание этанола и уменьшив содержание гидроксида аммония в системе, были получены элюенты в соотношениях 100:1,5 (Д) и 8:2 (Е), которые оказались оптимальными при общем скрининге опиатов, опиоидов, фенилалкиламинов и при частном скрининге производных фенотиазина соответственно.

Для оптимизации условий хроматографирования было решено рассмотреть третий компонент - дистиллированную воду, элюирующая способность которой является наименьшей, что позволит предотвратить поднятие веществ в верхнюю часть пластины. В системе этанол - вода

- 25% раствор аммиака 8:1:1 (Ж) значения Rf производных 1,4-бензодиазепина, фенотиазина попадают в интервал оптимальных параметров, что позволяет рекомендовать ее при общем скрининге. Для некоторых представителей антигистаминных средств, азалептина, галоперидола, рисперидона, тригексифенидила, карбамазепина и тофизопама этот элюент может быть использован при частном скрининге. Изменив пропорции содержания компонентов в представленной выше комбинации растворителей, была получена подвижная фаза состава этанол - вода - 25% раствор аммиака 6:2:4 (З), которая может быть использована при направленном обнаружении ряда местных анестетиков, фенилалкиламинов, а также дротаверина и папаверина. При соотношении составляющих системы 6:2:2 (И), 6:3:4 (К) отмечена их приемлемость при частном скрининге исследуемых спазмолитических средств и фенилалкиламинов.

Следующим этапом исследования была оценка элюирующей способности растворителей, в состав которых входит метанол. Сочетание метанола и 25 % раствора гидроксида аммония в соотношении 7:3 (Л) было оптимальным при частном скрининге некоторых представителей анти-гистаминных средств, азалептина, галоперидола, рисперидона, тригексифенидила, карбамазепина и тофизопама. Трехкомпонентная подвижная фаза - метанол-вода-25 % раствор аммиака 6:4:6 (М)

- позволила добиться разделения опиатов и опиоидов.

Важнейшим растворителем в ЖХ является также ацетонитрил. Система ацетонитрил-вода 7:3 (Н) проявила селективность в отношении ряда производных 1,4-бензодиазепина. Введение изопро-панола в систему растворителей (ацетонитрил-изопропанол-вода 5:3:2 (О) позволило использовать данный элюент при общем скрининге производных 1,4-бензодиазепина, фенотиазина. Для ряда анализируемых антигистаминных средств, а также лекарственных средств, действующих на центральную нервную систему, посредством различных механизмов комбинация растворителей (О) может быть применена при направленном исследовании. Сочетание ацетонитрила и диэтиламина 85:15 (П) также является подходящим для общего скрининга некоторых представителей антигистаминных средств и для частного обнаружения азалептина, галоперидола, рисперидона, тригексифенидила, карбамазепина и тофизопама. В отношении опиатов, опиоидов ацетонитрил в сочетании с водой и 25 % раствором аммиака 6:4:6 (Р) является оптимальной подвижной фазой при проведении направленного исследования.

Выводы

1. Показана возможность использования ОФ варианта ТСХ в химико-токсикологических исследованиях ряда групп лекарственных и химических соединений, которые наиболее часто являются причинами отравлений. Применение рекомендуемого варианта хроматографии в сочетании с НФ ТСХ позволяет повысить качество и достоверность обнаружения при решении широкого спектра задач химико-токсикологического анализа.

2. Изучено хроматографическое поведение ряда токсикологически важных веществ в условиях ОФ ТСХ-скрининга, установлены значения Rf лекарственных и химических соединений в 4 общих и 12 частных системах растворителей.

3. Определены оптимальные хроматографические условия отдельных групп веществ при общем и частном скрининге.

20

Токсикологический вестник № 2 (11 з)

Таблица 1

Группы соединении Величины ^ в различных системах растворителей

Б В Г Д Е Ж З И К М Н О Р

Производные 1,4-бензо- диазепина: хлордиазепоксид диазепам феназепам 0,59 -0,69 0,60 0,67 0,75 0,69 - 0,77

Производные феноти-азина: хлорпромазин прометазин трифлуоперазин этаперазин 0,57 0,63 0,66 0,68 0,30 0,31 0,55 0,49 0,22 -0,46 0,14 - 0,21

Опиаты, опиоиды: морфин этилморфин кодеин тримеперидин трамадол 0,52 -0,65 0,82 0,34 0,42 0,24 0,28 0,83 0,48 0,54 0,38 0,43

Фенилалкиламины: эфедрин эфедрон 0,37 0,81 0,66 0,75 0,64 0,81 0,63 0,75 0,45 0,60 0,55 0,62

Спазмолитические средства: папаверин дротаверин 0,84 0,69 0,75 0,51 0,80 0,63 0,87 0,76 0,77 0,58 0,25 0,11 0,51 0,35

21

март -

ап рел ь 2012

Таблица 2

■-»дммпш^^

Группы соединений Величины Rf в различных системах растворителей

А Г Ж З Л О П

Местные анестетики: прокаин оксибупрокаин кокаин лидокаин ропивакаин анилокаин тримекаин пиромекаин бупивакаин мепивакаин артикаин 0,84 0,60 0,79 0,77 0,69 0,66 0,72 0,57 0,53 0,84 0,87

Антидепрессанты: амитриптилин тианептин имипрамин флуоксетин 0,20 0,60 0,22 0,30

Антигистаминные средства: клемастин хлоропирамин дифенгидрамин мебгидролин доксиламин 0,24 0,48 0,50 0,45 0,58 0,16 0,45 0,48 0,45 0,55 0,41 0,62 0,65 0,59 0,72 0,25 0,54 0,67 0,65 0,66 0,50 - 0,59

Лекарственые средства, действующие на центральную нервную систему, посредством различных механизмов: азалептин галоперидол рисперидон тригексифенидил карбамазепин тофизопам 0,59 0,61 0,66 0,26 0,74 0,75 0,54 0,63 0,62 0,26 0,73 0,80 0,63 0,70 0,69 0,44 0,81 0,83 0,60 0,70 0,77 0,26 0,80 0,85 0,45 0,58 0,45 0,67 0,62 0,72

22

Токсикологический вестник № 2 (11 з)

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гейсс, Ф. Основы тонкослойной хроматографии (планарная хроматография) / Ф. Гейсс; Пер. с англ. М.А. Кошевника, Б.П. Лапина; Под ред. В.Г. Березкина: В 2 т. -М.: Мир, 1988. - 1 т. - С. 387-391.

2. Микеш, О. Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам / О. Микеш, И. Новак, З. Прохазка; Пер. с англ. А.Ю. Кошевника, Е.Л. Стыски-на; Под ред. В.Г. Березкина: В 2 ч. - М.: Мир, 1982. - 1 ч. - 400 с.

3. ОФТСХ, ВЭЖХ и спектроскопия ЯМР в скрининге наркотических веществ: Руководство по анализу наркотических и одурманивающих веществ методами ОФТСХ, ВЭЖХ и спектроскопии ЯМР / Е.В. Метелева, Л.О. Коньшина, М.С. Гайсинович и др.- Пермь, 1999. - С. 5-16.

4. Разделение и идентификация соединений ряда фенотиазина методом тонкослойной хроматографии / З.А. Темердашев, Н.В. Киселева, Р.А. Клищенко и др. // Журнал аналитической химии. - 2006. - Т. 61, № 1. - С. 6-9.

5. Спутник хроматографиста. Методы жидкостной хроматографии / Рудаков И.Б., Востров И.А., Федоров С.В. и др. - Воронеж: Изд-во «Водолей», 2004. - С. 47-53.

6. Kiridena, W. Structure-driven retention model for optimization of ternary solvent

systems in reversed-phased liquid chromatography / W. Kiridena, C.F. Poole // Chromatographia. - 1998. - Vol. 48, №9/10. - P. 607-614.

7. Kiridena, W. Structure-driven retention optimization model for reversed phase thin-layer chromatography / W. Kiridena, C.F. Poole // Analytical communications. - 1997.

- Vol. 34. - P. 195-198.

8. Lamparczyk, H. Study of dispersive and inductive electrostatic interactionsin reversed-phase thin-layer chromatography / H. Lamparczyk, R.J. Ochocka // Chromatographia.

- 1988. - Vol. 25, № 7. - P. 643-646.

Pospelovа A.A., Karpova L.N., Malkova T.L. The estimation of a possible use of reversed-phase thin-layer chromatography in chemo-toxicological studies of certain groups of pharmaceutical and chemical compounds

Perm State Pharmaceutical Academy

A chemo-toxicological analysis is the most important to identify causes of poisoning. Thin-layer chromatograpy is very usable as analytical method because of its affordability, simplicity and expressivity. To increase authenticity of investigations carried out, it was shown that along with a thin-layer chromatography, a reversed-phase version could be used in screening certain pharmaceutical and chemical compounds,

Материал поступил в редакцию 28.02. 2011 г.

23