CC BY
31
ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ ФЛЮОРЕСЦЕНТНОГО КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОЛОНГИРОВАННЫХ ФОРМ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ПРЕПАРАТА "ФТОРУРАЦИЛ-ЛЭНС" В КРОВИ
Ш.Х. Ганцев, В.П. Казаков, С.С. Остахов, Ф.А. Халиуллин, М.В. Султанбаев, Р.Ш. Ишмуратова, Г.В. Хамитова
ГОУ ВПО Башкирский государственный медицинский университет УРАН Институт органической химии Уфимского научного центра РАН
Ганцев Шамиль Ханяфиевич, д-р мед. наук, профессор, член-корреспондент АН РБ, зав. кафедрой хирургии и онкологии с курсами онкологии и патологической анатомии БГМУ, 450054, Республика Башкортостан, г. Уфа, пр. Октября, 73/1, тел. 8 (347) 237-43-58, e-mail: prfg@mail.ru
В работе с целью исследования возможности флюоресцентного количественного определения пролонгированных, форм противоопухолевого препарата "Фторура-цил-ЛЭНС" изучено тушение 5-фторурацилом люминесценции триптофана и крови. Полученные результаты открывают перспективу флюоресцентного титрования многокомпонентных растворов биологических, жидкостей. Проведено спектрально-люминесцентное исследование кето-енольной таутомерии 5-фторурацила, в результате которого впервые удалось наблюдать флюоресценцию минорного диенольного тау-томера, ответственного за спонтанные мутации при репликации ДНК.
Ключевые слова: 5-фторурацил, флюоресценция, кето-енольная таутомерия, триптофан, кровь.
THE OPPORTUNITY ESTIMATION OF THE FLUORESCENCE QUANTITATION OF THE ANTICANCER LONG ACTING DRUG "FLUOROURACIL-LENGTH" IN THE BLOOD
Sh.H. Gantsev, V.P. Kazakov, S.S. Ostakhov, F.A. Khaliullin, M.V. Sultanbaev, R.Sh. Ishmuratova, G.V. Khamitova
State-run Educational Institution Bashkir State University of Medicine by Institution of Organic Chemistry of Ufa scientific center of Russian Academy of Science
The work studies the tryptophan quenching in the blood with the help of 5-FU to examine the opportunities of the quantitation of the anticancer long acting drug "Fluorouracil-Length". The results got from the research open a prospect to the fluorescent measurement of the biologic fluids solutions. The spectral luminescent research of the 5-FU keto-enol tautomerism has been made. The minor dienol tautomer fluorescence has been watched for the first time during the research, the minor dienol tautomer being responsible for natural mutations during the DNA replication.
The key words: 5-FU, fluorescence, keto-enol tautomerism, tryptophan, blood.
Введение
5-Фторурацил ^и) широко применяется в онкологии при раке желудка, опухолях толстой кишки, поджелудочной железы, лёгких и метастазах в эти органы [5]. Механизм его действия обусловлен превращением FU в тканях в активный метаболит фторуридинмонофосфат, который является конкурентным ингибитором фермента тимидилатсин-
тетазы, принимающего участие в синтезе нуклеиновых кислот. 5-фторурацил нарушает синтез ДНК и вызывает образование структурно несовершенной РНК, угнетая деление опухолевых клеток.
При исследовании пролонгированных лекарственных форм FU возникает необходимость в его количественном определении в биологических жидкостях. Известно, кровь и 5-фторурацил обладают
флюоресценцией (ФЛ) [1,11], что дает основания для исследования возможности его количественного экспресс-анализа спектрально-люминесцентным методом.
Теоретически возможно существование 6 тау-томеров производных урацила [9,11,18]. В работе [11] на основании квантово-химических расчетов в гидратных кластерах 5-фторурацила было показано, что наиболее вероятно существование его 4-х таутомерных форм: дикето- А, кето-енольных В и С, а также диенольного таутомера D, которые по стабильности располагаются в следующем порядке - А > В > С > D.
0 0 он он
А В С D
Редкие формы В, С и D присутствуют в минорных количествах [11], но именно ими обусловливают спонтанные мутации при репликации ДНК [10,16,17], что определяет повышенный интерес к изучению таутомерии нуклеиновых оснований. Подавляющее большинство работ по изучению таутомерии производных урацила выполнено с использованием квантово-химических расчетов, поскольку экспериментальное наблюдение кето-енольных форм затруднительно, ввиду чего интерпретация результатов далека от однозначности и постулируют существование в нейтральных водных растворах только А и В таутомеров [11,13,15].
Мы полагали, что использование спектрально-люминесцентного метода наряду с флюоресцентным количественным определением 5-фторураци-ла в биологических жидкостях позволит прояснить противоречивую картину кето-енольного равновесия таутомеров 5-фторурацила.
Материалы и методы
Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре "Бресо^ М-40", скорректированные спектры возбуждения и излучения ФЛ - на спект-рофлюориметре "СМ-2203". 5-Фторурацил квалификации "хч" использовали без предварительной очистки. Триптофан очищали двойной перекристаллизацией из бидистиллята и сушили под вакуумом. Кровь белой лабораторной крысы линии Вистар разбавляли в 25 раз бидистиллированной водой. Поскольку [11] было зарегистрировано изменение спектров ФЛ 5-фторурацила со временем, которое, по мнению авторов, обусловлено образованием гироксо-таутомеров FU, все нижеприведенные результаты получены в свежеприготовленных растворах 5-фторурацила.
Результаты и обсуждение
5-фторурацил обладает очень коротким периодом полувыведения, который составляет от 8 до 12 минут. Пролонгированные формы FU помогают ре-
шить эту проблему, однако, для подтверждения их эффективности необходим количественный анализ препарата в крови. Использование спектрофотомет-рического метода предполагает трудоемкую стадию подготовки проб [2]. В то же время общеизвестно, что кровь флюоресцирует, и изменение квантового выхода излучения от концентрации 5-фторураци-ла может быть использовано в экспресс-анализе его количественного определения. Флюоресценция крови в ультрафиолетовой области (250 - 400 нм) обусловлена излучением ароматических аминокислот - тирозина, фенилаланина и, в первую очередь, триптофана, а в сине-зеленой (450 - 550нм) - пи-ридиннуклеотидов (рис. 1).
Щ .и, ^-ц .и Ц|ТТ
II
ÄJU А*.| 4b IV МО IV
■Л IPf
Рис. 1. Спектры ФЛ водных растворов крови: 1- c(FU) = 0; 2 - c(FU) = 3.8x10-5 моль/л; 3 - c(FU) = 3.8x10-4 моль/л; 4 - c(FU) = 3.8x10-3 моль/л. Тушение ФЛ водного раствора крови 5-фторураци-лом - (5) (кровь:Н20 = 1:25, рН = 7,298 К)
Добавление 5-фторурацила к водному раствору крови (кровь:Н20 = 1:25) приводит к тушению ее флюоресценции (рис. 1, спектры 1-4), которое наблюдается в области концентраций FU от 10-6 до 103 моль/л (рис. 1, зависимость 5). Таким образом, из данных по тушению ФЛ крови можно количественно определять концентрацию 5-фторурацила от мили- до микромолей. Полученные результаты открывают перспективу флюоресцентного титрования многокомпонентных растворов биологических жидкостей.
Выяснение механизма тушения флюоресценции крови 5-фторурацилом было проведено в модельной системе в водных растворах триптофана (Trp), аминокислотного остатка белков, ответственного за их люминесценцию [1]. 5-Фторурацил тушит ФЛ триптофана (рис. 2) в соответствии с уравнением Штерна-Фольмера (рис. 2, зависимость 2): I0/I - 1 = K [Q] (где I0 и I - интенсивности ФЛ Trp в отсутствии и присутствии тушителя, [Q] -концентрация тушителя) с константой К = 15x103 моль/л.
Триптофан в электронно-возбужденном состоянии является эффективным донором электрона (E(Trp / Trp) = 1.13 В [12], AE00 = 3.9. В [8] и тушение его ФЛ, как, например, было показано авторами для ионов уранила [3] и европия (III) [4], может осуществляться
Рис. 2. Спектр ФЛ триптофана - (1). Тушение ФЛ триптофана 5-фторурацилом в координатах уравнения Штерна-Фольмера - (2) (с(Тгр) = 10-5 моль/л, Н20, рН = 7,298 К)
по статическому механизму обратимого внутриком-плексного фотоиндуцированного переноса электрона. Действительно, при тушении ФЛ триптофана сенсибилизированное свечение 5-фторурацила не регистрируется, несмотря на перекрывание спектров испускания аминокислоты и поглощения FU, что свидетельствует о статическом механизме тушения и согласуется с выводами, сделанными в работе [14] по тушению бычьего сывороточного альбумина 5-фторурацилом с константой Штерна Фольмера К = 2.08x103 л/моль. Расхождение в константах, вероятно, обусловлено труднодоступностью Тгр для тушителя - 5-фторурацила в белке.
В то же время известно, что 5-фторурацил также обладает флюоресценцией [11]. В этой связи была предпринята попытка спектрально-люминесцентного исследования его кето-енольной таутомерии с целью экспериментального обнаружения теоретически предсказанного существования кето-еноль-ной С и диенольной D форм.
На рис. 3 приведены спектры поглощения, скорректированные спектры возбуждения и излучения ФЛ 5-фторурацила в воде (рН = 7). Спектр Фл получен при возбуждении в максимуме поглощения 5-фторурацила при 265 нм и соответствует излучению наиболее устойчивой дикето-таутомерной формы А (1 макс. = 350 нм), что согласуется с данными спектроскопических исследований водных растворов 5-хлорурацила [15], тимина [13] и 5-фторурацила [11].
Обращает на себя внимание несоответствие спектров поглощения (спектр 1) и возбуждения (спектр 2) ФЛ 5-фторурацила. Ранее подобные отклонения наблюдались в водных растворах тимина [7] и объяснялись наличием ФЛ минорного (6 %) кето-енольного таутомера В. Авторы работ [11,13,15] проводили возбуждение галогенпроизводных ура-цила и тимина в полосах поглощения таутомер-ных форм А (260-270 нм) и В (285-310 нм) [11,15], регистрируя соответствующую им ФЛ (рН = 4^7) в спектральных областях 310-325 нм и 400-410 нм соответственно. При этих условиях возбуждения ФЛ
Рис. 3. Спектры 5-фторурацила в Н20: поглощения - (1); возбуждения ФЛ - (2);
ФЛ - (3) (с^и) = 3.8x10-4 моль/л, I возб. = 265 нм, рН = 7,298 К)
пиримидиновых оснований, которую можно было бы соотнести с их кето-енольными С и диенольны-ми D таутомерами, не обнаруживается.
Нами была изучена ФЛ 5-фторурацила при возбуждении непосредственно в полосы, регистрируемые в спектре возбуждения его флюоресценции (рис. 3, спектр 2). Мы предположили, что коротковолновая полоса с максимумом 235 нм соответствует дикето-таутомеру А, максимум при 310 нм вероятнее всего соотносится с двумя кето-енольными таутомерами В и С, а перегиб в области 340-370 нм с диенольной формой D 5-фтору-рацила. Отнесение максимума 310 нм в спектре возбуждения ФЛ 5-фторурацила к кето-енольным формам В и С основывается на данных работы [11], в которой квантово-химическим методом CNDo/ Б-С1 были рассчитаны максимумы поглощения та-утомеров А, В и С. Рассчитанные для таутомера А максимумы поглощения 275 и 277 нм удовлетворительно согласуются с экспериментальными данными (спектр 1, рис. 3). Энергии синглетных п-п* электронных переходов таутомеров В и С близки ввиду схожести их молекулярных структур, и теоретически предсказанные максимумы их поглощения 318 и 312 нм [11], соответственно, коррелируют с максимумом при 310 нм в спектре возбуждения 5-фторурацила (рис. 3, спектр 2).
При возбуждении в полосы 235, 310 и 340 нм регистрируется ФЛ 5-фторурацила в различных спектральных областях (рис. 4 а). Спектр 1 при возбуждении 1возб = 235 нм (1 макс. = 350 нм) идентичен спектру ФЛ, полученному при возбуждении в максимуме поглощения (1. = 265 нм) 5-фторурацила (рис. 3) и соответствует излучению дикето-таутомера А.
Синглетные п-п* электроные переходы таутомеров FU энергетически близки, невозможно строго селективно осуществить их возбуждение, поэтому спектр 2 (рис. 4 а), полученный при 1возб = 310 нм ФЛ 5-фторурацила многокомпонетный. Коротковолновый максимум при 350 нм совпадает с ФЛ дикето-таутомера А при 1 возб = 235 нм (спектр 1,
Рис. 4. Спектры. (а) - ФЛ 5-фторурацила в воде: 1 - X возб. = 235 нм; 2 - X возб. = 310 нм;
3 - X возб. = 340 нм. (б) - Результаты покомпонентного разложения спектра 2 а -. (c(FU) = 3.8x10-4 моль/л, рН = 7,298 К)
рис. 4 а). Полоса ФЛ 5-фторурацила в области 370380 нм (спектр 2, рис. 4 а), в соответствии с данными [11] можно соотнести с таутомером В, а перегиб в области 410-420 нм - с кето-енольной формой С. Результаты покомпонентного разложения спектра 2 (рис. 4 а) с помощью программы анализа нелинейных графиков методом Гаусса (Origin -8) ФЛ 5-фторурацила (рис. 4 б) с большей наглядностью демонстрируют отмеченные выше переходы.
При возбуждении светом 340 нм наблюдается ФЛ с максимумом 440 нм (рис. 4 а, спектр 3), которая была отнесена к диенольной D форме 5-фторураци-ла. Ранее возможность спектрально-люминесцентной регистрации кето-енольной формы С и наименее устойчивого в нейтральной среде диенольного таутомера D не принималась во внимание.
Выше было показано, что тушение ФЛ триптофана и крови осуществляется по статическому механизму вследствие фотопереноса электрона в комплексах с 5-фторурацилом. Мы предположили, что лабильное кето-енольное равновесие различных форм FU может быть дифференцированно селективностью комплексообразования его таутомеров. Действительно, при полном тушении ФЛ триптофана регистрируется спектр возбуждения ФЛ 5-фторурацила (рис. 5, спектр 1) в котором наблюдается уменьшение интенсивности переходов в таутомерах А, В, С, а перегиб в области 340 - 370 нм, отнесенный к диенольной форме FU, становится более отчетливым.
При возбуждении FU в длинноволновом максимуме (1 возб. = 340 нм) в присутствии триптофана ФЛ диенольного таутомера D регистрируется в виде ярко выраженного максимума при 440 нм (рис. 5, спектр 3).
Рис. 5. Спектры возбуждения и ФЛ 5-фторурацила в
присутствии Trp - (1,3) и крови - (2,4) (с(FU^) = 10-3 моль/л, с(Тгр) = 10-5 моль/л, кровь: H20 = 1:25, X возб. = 340 нм, рН = 7,298 К)
Еще более значительные изменения в спектрах возбуждения и излучения ФЛ 5-фторурацила наблюдаются в водных растворах крови. При концентрации FU = 10-3 моль/л в водном растворе крови, когда ее флюоресценция полностью потушена (рис. 1, зависимость 5), был зарегистрирован спектр возбуждения ФЛ 5-фторурацила (рис. 5, спектр 2), разительным образом отличающийся от рассмотренных выше. А именно: не регистрируются максимумы при 235 и 310 нм, соответствующие A, В и С таутомерам, а наблюдается только интенсивная структурированная полоса с 1 макс. = 335 нм и 368 нм в области переходов диенольного таутомера D 5-фторурацила. Вне зависимости от того, в какой максимум производится фотовозбуждение, спектры ФЛ идентичны (рис. 5, спектр 4) с 1 макс. = 480 нм, отвечающие, вероятнее всего, излучению D формы 5-фторураци-ла. Существенный длинноволновый сдвиг ФЛ (~ 40 нм), по сравнению с чистыми водными растворами, может быть вызван образованием флюоресцирующих ассоциатов D таутомера FU с компонентами крови, а также эффектом «внутреннего фильтра» [6]. Таким образом, как и предполагалось выше, тауто-меры FU обладают различной способностью к взаимодействию с компонентами крови, а именно, в реакцию комплексообразования преимущественно вступают формы А, В, и С 5-фторурацила. Последнее обстоятельство позволяет предположить, что именно эти таутомерные формы обладают наибольшей противоопухолевой активностью. В то же время сильное токсическое действие 5-фторурацила, проявляющееся при превышении терапевтической концентрации, вероятно, обусловлено, как это следует из полученных результатов, наличием диенольного таутомера D, который может вызывать спонтанные мутации при репликации ДНК, приводящие к серьезным нарушениям при передаче наследственной информации [10,16,17].
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке ОХНМ РАН (№ 1-ОХ).
Список литературы
1. Демченко А.П. Люминесценция и динамика структуры белков. - Киев: Наукова думка, 1988. - 280 с.
2. Зайнуллин Ф.Ш., Наумова Н.В., Сафиуллин Т.Г. Разработка состава и технологии пролонгированной лекарственной формы для проведения местной химиотерапии местнораспространенных и генерализованных форм рака // Материалы двенадцатой научной сессии Ассоциации онкологов Башкортостана. - Уфа, 2008. - С. 49-54.
3. Казаков В.П., Остахов С.С., Осина И.О. и др. Фотоника комплексов UO22+ с триптофаном. Сообщение 1. Влияние анионов и температуры на внутрикомплексную дезактивацию возбужденнох состояний UO22+ и триптофана // Радиохимия. -2006. - T. 48. - №5. - С. 399-402.
4. Казаков В.П., Остахов С.С., Фаррахова Г.Г. Фотоиндуцированный перенос электрона из высоковозбужденных синглетных состояний триптофана. Сообщение 1. Влияние длины волны возбуждения, pH и температуры на тушение флюоресценции триптофана ионом Eu(III) // Химия высоких энергий. - 2008. - Т. 42. - №4. - С. 325-328.
5. Машковский М.Д. Лекарственные средства. -М.: Новая волна, 2002. - Т. 2. - 608 с.
6. Паркер С. Фотолюминесценция растворов. -М.: Мир, 1979. - 510 с.
7. Hauswirth W., Daniels M. Fluorescence of thymine in aqueous solution at 300° K // Photochemistry and Photobiology. - 2008. - Vol. 13. - №2. - P. 157-163.
8. Horrocks W. D., Bolender Jr., J. P., Smith W.D. Photosensitized near infrared luminescence of ytterbium(III) in proteins and complexes occurs via an internal redox process // J. Am. Chem. Soc. - 1997. - Vol. 119. - №25. - P. 5972-5973.
9. Kryachko E.S., Nguyen M.T., Zeegers-Huyskens T. Theoretical study of tautomeric forms of uracil. 1. Relative order of stabilities and their relation to proton affinities and deprotonation enthalpies // J. Phys. Chem. A. - 2001. - Vol. 105. - №8. - P. 1288-1295.
10. Lowdin P.-O. Proton Tunneling in DNA and its Biological Implications // Rev. Mod. Phys. - 1963. -Vol. 35. - P. 724-732.
11. Markova N., Enchev V., Timtcheva I. Oxo-hydroxy tautomerism of 5-fluorouracil: water-assisted proton transfer // J. Phys. Chem. A. - 2005. - Vol. 109. - №9. - P. 1981.
12. Meers P. Location of tryptophans in membrane-bound annexins // Biochemisrty - 1990. - Vol. 29. -№13. - P. 3325-3330.
13. Morsy M.A., Al-Somali A.M., Suwaiyan A. Fluorescence of thymine tautomers at room temperature in aqueous solutions // J. Phys. Chem. B. - 1999. - Vol. 103. - №50. - P. 11205-11210.
14. Shuyun Bi, Yantao Sun, Chunyu Qiao et al. Binding of several anti-tumor drugs to bovine serum albumin: Fluorescence study // J. Lumin. - 2009. - Vol. 129. - №5. - P. 541-547.
15. Suwaiyan A., Morsy M. A., Odah K. A. Room temperature fluorescence of 5-chlorouracil tautomers // Chem. Phys. Lett. - 1995. - Vol. 237. - №3-4. - P. 349-355.
16. Topal M.D., Fresco J.R. Complementary base pairing and the origin of substitution mutations // Nature. - 1976. - Vol. 263. - P. 285-289.
17. Watson J.D., Crick F.H.C. Molecular structure of nucleic acids. A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid // Nature. - 1953. - Vol. 171. - №43(56). - P. 737-738.
18. Yekeler H., Ozbakir D. Concerning the solvent effect in the tautomerism of uracil, 5-fluorouracil, and thymine by density-functional theory and AB initio calculations // J. MolecularModeling. - 2001. - Vol. 7. - №4. - P. 103-111.
