CC BY
28
УДК 611.133-001.35:611.813:611.08:599.237.1
ОЦЕНКА ВОЗДЕЙСТВИЯ ПЕРМАНЕНТНОЙ ЭКСТРАВАЗАЛЬНОЙ ОККЛЮЗИИ ЛЕВОЙ ОБЩЕЙ СОННОЙ АРТЕРИИ НА НЕЙРОНЫ ПЕРЕДНЕГО МОЗГА БЕЛЫХ КРЫС
Г.В.Шумихина, Т.Г.Данилова
ASSESSMENT OF THE EFFECT OF PERMANENT EXTRAVASAL OCCLUSION OF THE LEFT COMMON CAROTID ARTERY ON FOREBRAIN NEURONS IN WHITE RATS
G.V.Shumikhina, T.G.Danilova
Ижевская государственная медицинская академия, Shum 18 @ rambler.ru
После пережатия левой общей сонной артерии на третьи, четырнадцатые, тридцатые сутки иммуногистохимическим методом изучены изменения нейронов в пирамидном и ганглионарном слоях коры лобной области, в хвостатом ядре головного мозга белых крыс. Экспрессия каспазы-3 максимальна во всех исследованных зонах на четырнадцатые сутки эксперимента. Выработка белка р53 у белых крыс экспериментальной группы по сравнению с контролем существенно не меняется, хотя при сравнении с контрольной группой уровень экспрессии р53 в коре лобной области максимален к тридцатым суткам, а в хвостатом ядре — на третьи сутки после наложения лигатуры на левую общую сонную артерию.
Ключевые слова: кора лобной области, хвостатое ядро, пережатие левой общей сонной артерии, иммуногистохимия, каспаза-3, белок р53, апоптоз
After clamping the left common carotid artery on the third, fourteenth, and thirtieth day the changes in the neurons of pyramidal and ganglionic layers of the frontal cortex and in the caudate nucleus of the brain of white rats were studied by immunohistochemistry. The expression of caspase-3 is maximal in all investigated areas on the fourteenth day of the experiment. Production of the p53 protein in the experimental group of albino rats as compared with the control one does not change significantly, although, when compared with the control group, the level of p53 expression in the frontal cortex is maximal by the thirtieth day, and in the caudate nucleus it is maximal on the third day after the left common carotid artery ligation.
Keywords: frontal cortex, caudate nucleus, left common carotid artery ligation, immunohistochemistry, сaspase-3, protein p53, apoptosis
Структурные изменения в коре больших полушарий крыс при нарушении кровотока в головном мозге описаны в большом количестве литературных источников. Чаще всего исследуются реакции нейронов на уровне теменной области [1-5]. Изменения в коре лобной области изучены недостаточно. Задняя лобная область, в числе прочего, является зоной двигательного анализатора у крыс [6] и изменения, происходящие в ней при нарушениях кровотока, представляют клинический интерес. В доступной литературе не проведено сравнительного анализа изменений в коре лобной области и подкорковых центрах, в то время как эти зоны являются функционально взаимосвязанными. А между тем, основным патогенетическим механизмом дисциркуляторной энцефалопатии, по крайней мере, на начальной ее стадии, является нарушение связей между лобной корой и подкорковыми базальными ганглиями. Данное состояние ведет к вторичной дисфункции лобной коры головного мозга [7].
Целью исследования явилось сравнительное изучение реакций хвостатого ядра и коры лобной области белых крыс на экстравазальную перманентную окклюзию левой общей сонной артерии.
Материалы и методы
В качестве объекта исследования взяты 36 белых крыс-самцов 8-9 месяцев средней массой 250-300 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария.
Локализацию исследуемых областей мозга у крыс определяли согласно рекомендациям [6]. В качестве исследуемой структуры для количественного анализа были взяты фронтальные срезы лобного отдела коры больших полушарий на уровне ЕРр и хвостатого ядра крыс. Данные объекты исследования кровоснабжаются ветвями одной артерии, в связи с чем находятся в близких условиях гемодинамики. Это позволяет сравнить степень поражения вышеупомянутых структур в условиях нарушенного кровотока. Выбранные зоны являются функционально взаимосвязанными, поэтому их сравнительная характеристика в пределах одного исследования представляет определенный интерес.
Экспериментальное исследование проводили с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.77); в соответствии с правилами Европейской конвенции по защите лабораторных животных, 1991; с «Правилами проведения качественных клинических испытаний в РФ» (утверждены Минздравом РФ и введены в действие с 01.01.1999г.), согласно национальному стандарту Российской Федерации ГОСТ Р 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики». Животные содержались в хорошо отапливаемом, освещенном, вентилируемом помещении, с регулярной уборкой, имели свободный доступ к пище и воде.
Белым крысам II группы под тиопенталовым наркозом накладывали лигатуру на левую общую
сонную артерию (на уровне щитовидного хряща гортани, ниже ее разделения на наружную и внутреннюю сонные артерии) с выведением животных из эксперимента на третьи, четырнадцатые, тридцатые сутки. Данная методика неполной ишемии головного мозга умеренной тяжести применялась в ряде работ для создания ишемии фронтальных отделов головного мозга [1,8]. Контролем служили ложнооперирован-ные белые крысы I группы (подвергшиеся аналогичному оперативному вмешательству, но без перевязки сосуда).
Нами использовались иммуногистохимические методы: исследование экспрессии клетками нервной ткани протеазы каспазы-3 и белка р53, играющих важную роль в процессах запуска апоптоза. Был использован непрямой пероксидазный метод на парафиновых срезах. Исследование проводилось по стандартному протоколу, в соответствии с инструкцией к каждому из антител. Весь морфометрический анализ проводили на препаратах левого полушария выживших животных. Определялось относительное содержание (%) пирамидных нейронов пирамидного и ганглионарного слоев и нейронов хвостатого ядра, экспрессируюших каспазу-3 и белок р53 после пережатия левой общей сонной артерии.
Статистическую обработку полученных количественных данных проводили в соответствии с общепринятыми методами [9-11]. Они включали расчет среднего значения, ошибки средней и средне-квадратического отклонения. Поскольку распределение числовых значений в однородных группах носило нормальный характер, для сравнения средних значений был использован параметрический метод статистики — /-критерий Стьюдента. Во всех процедурах статистического анализа принимался уровень значимости р < 0,05. Расчет проводили с привлечением программы «Microsoft Office Excel 2007». Все результаты представлены М ± m, где М — среднее значение, m — ошибка среднего.
Результаты исследования и их обсуждение
В контроле летальности не наблюдалось. Общая летальность во II группе составила 28,6%, причем чаще всего гибель животных происходила в первые трое суток после проведенной операции. Гибель животных вероятно была обусловлена слабым уровнем коллатерального кровообращения у крыс и наступившим вследствие этого острым нарушением мозгового кровообращения тяжелой степени.
На всех сроках исследования у животных контрольной группы наблюдалась умеренная или слабая экспрессия каспазы-3 в единичных нейронах. Как в лобном отделе коры, так и в хвостатом ядре данные нейроны были распределены равномерно. Относительное содержание нейронов, экспрессирующих каспазу-3 в пирамидном слое составляло от 5,10±0,47% до 6,00±0,49%; в ганглионарном слое от 5,80±0,43% до 6,70±0,56%; в хвостатом ядре от 3,50±0,32% до 4,10±0,32%. При визуальном сравнении микропрепаратов контрольных групп животных, выведенных из эксперимента на третьи, четырнадцатые, тридцатые сутки, достоверного отличия в интен-
сивности и количестве окрашенных нейронов не обнаружено.
На третьи сутки после пережатия левой общей сонной артерии в экспериментальной группе было заметно увеличение количества нейронов с повышенной активностью каспазы-3 по сравнению с контрольной группой данного срока. Изменения в коре лобной области изменения были более выраженными, чем хвостатом ядре: относительное содержание нейронов, экспрессирующих каспазу-3, по сравнению с контрольной группой увеличивалось в пирамидном слое до 17,60±0,71% (в контроле 5,70±0,54%, р < 0,001), в ганглионарном слое до 21,90±0,52% (в контроле 6,40±0,47%, р < 0,001), в хвостатом ядре до 12,30±0,53% (в контроле 3,70±0,30%, р < 0,001). Большое количество нейронов, экспрессирующих каспазу-3, локализовалось в наружном зернистом слое. Они были равномерно распределены в пределах слоя, но менее интенсивны по окраске в сравнении с нейронами пирамидного и ганглионарного слоев, где экспрессия белка в телах нейронов была более выражена, но расположение клеток носило неравномерный характер. Указанные клетки располагались как группами, так и поодиночке.
На четырнадцатые сутки в лобной коре и хвостатом ядре крыс экспериментальной группы наблюдалось максимальное количество нейронов с высоким уровнем каспазы-3 по сравнению как с группой контроля, так и с экспериментальными группами третьих и тридцатых суток. В коре лобной области относительное содержание нейронов, экспрессирующих каспазу-3, было выше, чем в хвостатом ядре. Расположение клеток с признаками экспрессии каспазы-3 было как одиночным, так и групповым во всех слоях коры, за исключением наружного зернистого слоя, где прореагировавших нейронов — единицы. Фермент-позитивные нейроны наблюдались в пирамидном и ганглионарном слоях (относительное содержание пирамидных нейронов, экспресси-рующих каспазу-3, в пирамидном слое составило 30,50±2,24% (в контроле 6,00±0,49%, р < 0,001); в ганглионарном слое — 28,50±2,03% (в контроле 6,70±0,56%, р < 0,001). В этих же слоях были заметны участки «выпадений» нейронов. По сравнению с предыдущим сроком, наблюдалось достоверное увеличение относительного содержания пирамидных нейронов, экспрессирующих каспазу-3 в пирамидном (р < 0,01) и ганглионарном (р < 0,001) слоях. Относительное содержание нейронов, экспрессирующих каспазу-3, в хвостатом ядре составляло 15,3±1,33% (в контроле 4,10±0,32%, р < 0,001). По сравнению с предыдущим сроком отмечался рост относительного содержания нейронов, экспрессирующих каспазу-3 (р < 0,05).
Через тридцать суток после проведения эксперимента количество нейронов с повышенным уровнем активности каспазы-3 в коре лобной области белых крыс экспериментальной группы по сравнению с экспериментальными группами 3 и 14 суток было минимальным, но в сравнении с группой контроля все-таки выше, причем во внутренних слоях коры реакция была более выраженной. В пирамидном слое относительное содержание пирамидных нейронов, экспрессирующих каспазу-3, составило 10,00±0,44% (в контроле
5,10±0,47%, p < 0,001); в ганглионарном — 6,80±0,50% (в контроле 5,80±0,43%). По сравнению с предыдущим сроком наблюдалось достоверное снижение относительного содержания пирамидных нейронов, экспрес-сирующих каспазу-3, в пирамидном < 0,001) и ганглионарном < 0,001) слоях. В нейронах хвостатого ядра к тридцатым суткам не было явных проявлений апоптоза. Реакция в телах нейронов была самой низкой за весь исследуемый временной промежуток. Хотя при сравнении с группой контроля относительное содержание нейронов с повышенным уровнем активности каспазы-3 было все-таки выше и составляло 11,10±0,78% (в контроле 3,50±0,32%, p < 0,001). По сравнению с предыдущим сроком отмечалось снижение относительного содержания нейронов, экспресси-рующих каспазу-3 < 0,01).
Белок р53 локализовался преимущественно в телах нейронов. У крыс контрольной группы на всех сроках выявлены единичные р53-положительные нейроны, равномерно расположенные в пределах всех цитоархитектонических слоев. При визуальном сравнении микропрепаратов коры лобной области контрольных групп животных, выведенных из эксперимента в разные сроки, отличия в интенсивности и количестве окрашенных нейронов не обнаружено. Относительное содержание пирамидных нейронов, экс-прессирующих белок р53, в пирамидном слое составляло от 2,10±0,23% до 2,40±0,24%, в ганглионарном слое — от 2,00±0,22% до 2,20±0,17%. В хвостатом ядре процент нейронов, экспрессирующих белок р53, составлял от 2,00±0,20% до 2,30±0,22%.
У крыс экспериментальной группы на третьи сутки после пережатия левой сонной артерии реакция нейронов слабо выражена. Хотя по сравнению с контрольной группой заметно увеличение относительного содержания нейронов с повышенной активностью р53 в пирамидном слое до 4,50±0,48% (в контроле 2,40±0,24%, p < 0,001); в ганглионарном слое — до 5,20±0,56% (в контроле 2,20±0,17%, p < 0,001). В коре наблюдались единичные белок-позитивные нейроны, располагавшиеся диффузно, преимущественно в пирамидном и ганглионарном слоях. В молекулярном слое экспрессии белка р53 не обнаруживалось. В наружном зернистом слое отмечено групповое расположение нейронов с минимальной экспрессией р53. По сравнению с контрольной группой данного срока было заметно увеличение количества нейронов с повышенной активностью белка р53 в хвостатом ядре. Относительное содержание нейронов, экспресси-рующих белок р53, увеличивалось, составляя 6,40±0,59% (в контроле 2,30±0,22%, p < 0,001).
На четырнадцатые сутки в лобной области коры белых крыс экспериментальной группы наблюдались очаговые белок-положительные зоны в пирамидном и ганглионарном слоях. В наружном зернистом слое реакция была минимальна, в полиморфном слое реакция отсутствовала. Относительное содержание пирамидных нейронов, экспресси-рующих белок р53, в пирамидном слое составляло 3,40±0,32% (в контроле 2,10±0,23%, p < 0,001); в ганглионарном слое — до 3,50±0,34% (в контроле 2,00±0,22%, p < 0,001). По сравнению с предыдущим
сроком снижалось относительное содержание нейронов в ганглионарном слое ф < 0,01). В нейронах хвостатого ядра крыс экспериментальной группы реакции практически не наблюдалось. Относительное содержание нейронов, экспрессирующих белок р53, составляло 3,20±0,28% (в контроле 2,00±0,20%, p < 0,001, а по сравнению с предыдущим сроком относительное содержание таких нейронов снижалось ф < 0,001).
Через тридцать суток в пирамидном слое встречались отдельные измененные клетки. В ганг-лионарном слое реакция была несколько выше, встречались отдельные участки из нескольких р53-положительных клеток. Относительное содержание пирамидных нейронов, экспрессирующих белок р53, в пирамидном слое составляло 5,30±0,44% (в контроле 2,60±0,29%, p < 0,001); в ганглионарном слое — 7,63±0,44% (в контроле 2,40±0,24%, p < 0,001). По сравнению с предыдущим сроком повышалось относительное содержание измененных нейронов в пирамидном и ганглионарном слоях (р<0,001). В наружном зернистом слое реакция была минимальной. В нейронах хвостатого ядра реакция была слабая, но по сравнению с группой контроля количество нейронов с повышенным уровнем активности р53 было выше и составляло 5,00±0,39% (в контроле 2,20±0,21%, p < 0,001).
Таким образом, в хвостатом ядре и коре лобной области наложение лигатуры на левую общую сонную артерию у белых крыс характеризуется увеличением относительного содержания нейронов с высокой активностью фермента каспазы-3. До четырнадцатых суток наблюдается нарастание реакции, после чего к тридцатым суткам интенсивность процесса снижается. При сравнении с контрольной группой уровень экспрессии р53 в коре лобной области максимален к тридцатым суткам, а в хвостатом ядре — на третьи сутки после наложения лигатуры на левую общую сонную артерию. Но в целом выработка белка р53 у белых крыс существенно не меняется. Это можно объяснить тем, что р53 индуцирует только апоптоз, вызванный сильными повреждениями ДНК или нарушением регуляции клеточного цикла [12]. В нашей работе интенсивность воздействия была относительно невелика. Отличие в уровне их экспрессии может также объясняться различным временем вовлечения в процесс апоптоза. Активация р53 происходит на более раннем этапе, поэтому, к моменту активации кас-пазы-3 уровень экспрессии р53 мог быть уже снижен. Повышение активности р53 характерно для клеток, имеющих серьезные повреждения, что создает угрозу возникновения и закрепления мутаций. Целью р53 становится их уничтожение, что достигается либо путем активации апоптоза, либо за счет терминального выхода клеток из процесса деления, что является формой генетической смерти. Поэтому повышение р53 может быть не только маркером апоптоза, но и показателем увеличения генетически опасных дефектных клеток вследствие их повреждения [12]. Повышение р53 в экспериментальной группе возможно и было обусловлено данным фактором, а не являлось маркером апоптоза, что подтверждается разной ди-
намикой экспрессии каспазы-3 и р53. С другой стороны, отличие в уровне их экспрессии может объясняться и разницей во времени включения в процесс апоптоза. Активация р53 происходит на более раннем этапе, поэтому к моменту активации каспазы-3 уровень экспрессии р53 может быть уже снижен.
1.
2.
Боголепов Н.Н. Ультраструктура мозга при гипоксии. М., 1979. 168 с.
Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. М.: Медицина, 2001. 328 с.
3. Поташев Д.Д. Влияние шунтирования общих сонных артерий при их острой окклюзии на цитоархитектонику не-окортекса белых крыс // Мат. докл. 8 конгр. Междунар. ассоц. морфологов. Морфология, 2006. №4. С. 102.
4. Зинькова Н.Н. Терапия ишемического инсульта головного мозга у крыс с помощью стволовых клеток // Цитология. 2007. Т.49. №7. С.566-575.
5. Коржевский Д.Э. и др. Моделирование одностороннего ишемического повреждения нейронов стриатума с помощью непродолжительной окклюзии средней мозговой артерии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2009. Т.147. №2. С.217-219.
6. Светухина В.М. Цитоархитектоника новой коры мозга в отряде грызунов (белая крыса) // Архив анатомии, гистологии эмбриологии. 1962. T.XLII. №2. С.31-44.
7. Захаров В.В. Лечение хронической сосудистой мозговой недостаточности // Спецвыпуск журнала Consilium-medicum. 2008. С.3-7.
8. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов. М.: Медицина, 1989. 359 с.
9. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия: Руководство. М.: Медицина, 1990. 384 с.
10. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1998. 459 с.
11. Молчанова Л.Ф., Кудрина Е.А., Муравьева М.М., Жарина М.В. Статистическая оценка достоверности результатов научных исследований: учебное пособие. Ижевск, 2004. 96 с.
12. Чумаков П.М. Белок р53 и его универсальные свойства в многоклеточном организме. // Успехи биологической химии. 2007. Т.47. С.3-52.
References
1. Bogolepov N.N. Ul'trastruktura mozga pri gipoksii [Brain metastructure in hypoxia]. Moscow, "Meditsina" Publ., 1979. 168 p
2. Gusev E.I., Skvortsova V.I. Ishemiia golovnogo mozga [Cerebral ischemia]. Moscow, "Meditsina" Publ., 2001. 328 p.
3. Potashev D.D. Vliianie shuntirovaniia obshchikh sonnykh ar-terii pri ikh ostroi okkliuzii na tsitoarkhitektoniku neokor-teksa belykh krys [The influence of shunting the common carotid arteries at acute occlusion on architectonics of the neo-cortex of white rats]. Materialy dokl. 8 kongr. Mezhdunar. assots. morfologov [Proc. of the 8th Congr. of the International Morphological Association]. Morfologiia - Morphology, 2006, vol. 129, no. 4, p. 102.
4. Zin'kova N.N. et al. Terapiia ishemicheskogo insul'ta golov-nogo mozga u krys s pomoshch'iu stvolovykh kletok [Mesen-chymal stem cells-based therapy of brain ischemic stroke in rat]. Tsitologiya - Cell and Tissue Biology, 2007, vol. 49, no. 7, pp. 566-575.
5. Korzhevskii D.E. et al. Modelirovanie odnostoronnego ishemicheskogo povrezhdeniia neironov striatuma s pomosh-ch'iu neprodolzhitel'noi okkliuzii srednei mozgovoi arterii [Simulation of unilateral ischemic injury to the striatal neurons inflicted by short-term occlusion of the middle cerebral artery]. Biulleten' eksperimental'noi biologii i meditsiny -Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2009, vol. 147, no. 2, pp. 255-256.
6. Svetukhina V.M. Tsitoarkhitektonika novoi kory mozga v otriade gryzunov (belaia krysa) [Neocortex cytoarchitectonics of rodents (white rats)]. Arkhiv anatomii, gistologii em-briologii - Neuroscience and Behavioral Physiology, 1962, vol. 42, no. 2, pp. 31-44.
7. Zakharov V.V. Lechenie khronicheskoi sosudistoi mozgovoi nedostatochnosti [Treatment of chronic cerebral vascular insufficiency]. Consilium-medicum, 2008, Special Issue, pp. 37.
8. Bilenko M.V. Ishemicheskie i reperfuzionnye povrezhdeniia organov [Ischemic and reperfusion injuries of organs]. Moscow, "Meditsina" Publ., 1989. 359 p.
9. Avtandilov G.G. Meditsinskaia morfometriia: Rukovodstvo [Morphometry in medicine. Guidance]. Moscow, "Meditsina" Publ., 1990. 384 p.
10. Glantz S. Primer of biostatistics. 4th ed., McGraw-Hill, New York, 1994. (Russ. ed.: Glants S. Mediko-biologicheskaia statistika. Moscow, "Praktika" Publ., 1998. 459 p.).
11. Molchanova L.F., Kudrina E.A., Murav'eva M.M., Zharina M.V. Statisticheskaia otsenka dostovernosti rezul'tatov nauchnykh issledovanii: uchebnoe posobie [Statistical analysis of reliability of scientific findings. Learning guide]. Izhevsk, 2004. 96 p.
12. Chumakov P.M. Belok p53 i ego universal'nye svoistva v mnogokletochnom organizme [Versatile functions of p53 protein in multicellular organisms]. Uspekhi Biologicheskoi Khimii - Biochemistry (Moscow), 2007, vol. 72(13), pp. 1399-1421.
