CC BY
22
4.1.2. - Селекция, семеноводство и биотехнология растений (сельскохозяйственные науки)
УДК: 606:581.48 DOI: 10.34736/FNC.2023.120.1.002.10-15
Оценка влияния осмотического стресса на прорастание семян кустарниковых растений в культуре in vitro
Софья Васильевна Мельник м, е-mail: melnik-s@vfanc.ru , ORCID 0000-0001-5802-1339, Ольга Олеговна Жолобова, к.б.н., ORCID 0000-0002-1594-4181 -
«Федеральный научный центр агроэкологии, комплексных мелиораций и защитного лесоразведения Российской академии наук» (ФНЦ агроэкологии РАН), info@vfanc.ru, 400062, г. Волгоград, пр. Университетский, 97, Россия
Аннотация. В связи с глобальными изменениями климата одной из основных экологических проблем на территориях южных регионов России является засуха. Эффективным способом предотвращения процессов деградации земель и опустынивания является селекция и отбор древесных и кустарниковых растений, устойчивых к данному стресс-фактору, для их последующего использования в лесоразведении. В статье представлены результаты влияния осмотического стресса на прорастание семян и биометрические показатели проростков модельных объектов Robinia pseudoacacia L. и Caragana pygmaea L. в культуре in vitro. Для моделирования дефицита доступной воды в питательную среду по прописи Мура-сиге-Скуга добавляли осмотик полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой 6000, в концентрациях до 10 г/л. Семенной материал прошел предстерилизационную обработку и двухэтапную стерилизацию для получения асептической культуры. В результате влияния ПЭГ в питательной среде выявлено ингибирование энергии прорастания семян C. pygmaea с 80% в контрольной группе до 15,6-26,6% в опытных. У проростков контрольной группы отсутствовало статистически достоверное различие между длиной корня и побега, при этом в опытных группах длина корня достоверно меньше длины побега. Наблюдалось угнетение формирования корней второго порядка по сравнению с контролем. Данные ответные реакции связаны с уменьшением скорости набухания семян вследствие уменьшения количества доступной воды, что оказало влияние на развитие проростков. У семян R. pseudoacacia отмечалось увеличение всхожести семян с 90% в контроле до 100% на среде ПЭГ 10. У проростков опытной группы наблюдалась более развитая листовая пластина по сравнению с контролем. Статистически достоверных различий между группами в длине гипокотиля и стебля не обнаружено. Таким образом, адаптационные механизмы R. pseudoacacia в ответ на данный осмотический стресс оказали небольшое стимулирующее действие в развитии растения.
Ключевые слова: семена, Robinia pseudoacacia, Caragana pygmaea, полиэтиленгликоль 6000, засуха, in vitro.
Финансирование. Работа выполнена в рамках исполнения плана научно-исследовательской работы ФНЦ агроэкологии РАН № 122020100427-1 «Разработать научные основы сохранения и воспроизводства ценных генотипов древесных и кустарниковых растений в культуре in vitro».
Цитирование. Мельник С.В., Жолобова О.О. Оценка влияния осмотического стресса на прорастание семян кустарниковых растений в культуре in vitro // Научно-агрономический журнал. 2023. № 1 (120). С. 10-15. DOI: 10.34736/FNC.2023.120.1.002.10-15
Поступила в редакцию: 16.01.2023 Принята к печати: 27.02.2023
Введение. Засуха является одним из наиболее распространенных абиотических стрессовых факторов, влияющих на растения [1]. К причинам возникновения засухи относят изменение клио мата и неустойчивость выпадения осадков [8]. д- Длительные и частые засухи могут быть причи-^ ной лесных пожаров, усыхания лесов и защитных лесных насаждений, что приводит к уменьшению ™ видового разнообразия и развитию процессов опустынивания [3]. В настоящее время актуаль->1 ным направлением в биотехнологии древесных
0 растений является селекция и отбор засухоустой-
1 чивых генотипов и их последующее использова-° ние в защитном лесоразведении. Это позволит & уменьшить эрозию почв и создать благоприятные £ условия для культивирования сельскохозяйствен-^ ных культур [2].
I Наиболее чувствительными к дефициту доступ-is - Для контактов / Corresponding author
ной воды являются растения в период прорастания семян и развития проростков. На данных этапах онтогенеза достаточное количество свободной воды является необходимым условием для выхода семян из состояния покоя и дальнейшего развития растения. При этом для прорастания необходимо набухание семян до определенного уровня влажности, а выше - для запуска и функционирования метаболизма [4].
Способность прорастания семян в условиях почвенной засухи является важной биологической характеристикой, которая позволяет оценить степень восприимчивости вида к данному абиотическому стрессу. Высокие показатели всхожести семян и развитие нормальных проростков являются признаками устойчивости растений к неблагоприятным условиям. Ряд исследований показывают, что семена, способные адаптироваться и прора-
стать в засушливых условиях, имеют специфические механизмы устойчивости [10].
Прорастание семян в культуре in vitro дает возможность моделировать осмотический потенциал различного уровня. Это позволяет провести первичный скрининг и отбор генотипов устойчивых к стрессовому фактору.
В качестве модельных объектов были исследованы семенные материалы Караганы карликовой (Caragana pygmaea L.) и Робинии псевдоакации (Robinia pseudoacacia L.) из семейства Fabaceae (рисунок 5). C. pygmaea - ксерофитный, листопадный кустарник высотой до 1,5-2 м. Произрастает в засушливых районах умеренного климата, от Северной Европы и Центральной Азии, до Сибири, Кореи и Японии [9]. R. pseudoacacia применяется в агролесомелиорации, поскольку характеризуется высоким уровнем засухоустойчивости и обладает сильно развитой корневой системой. Используется для закрепления песков и относится к почвоу-лучшающим породам [6].
Целью исследования являлась оценка влияния моделируемой почвенной засухи на прорастание семян и биометрические показатели проростков C. pygmaea и R. pseudoacacia в культуре in vitro.
Материалы и методы. Проращивание семян проводили на питательной среде по прописи Murashige-Skoog (MS). Для имитации почвенной засухи добавляли осмотик полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой 6000. Это неионный водорастворимый природный полимер, который снижает водный потенциал растений [7]. Концентрации осмотика в питательной среде для обоих видов составляли 2 г/л (ПЭГ 2); 4 г/л (ПЭГ 4); 6 г/л (ПЭГ 6); 8 г/л (ПЭГ 8); а для семян R. Pseudoacacia дополнительно готовилась среда с содержанием ПЭГ 10 г/л (ПЭГ 10). В качестве контрольной среды для обоих видов использовали среду MS без добавления осмотика.
Для предстерилизационной обработки семена замачивали в мыльном растворе на 15 минут, после чего промывали под проточной водой в течение 1 часа. Стерилизацию материала проводили в условиях ламинарного бокса (БМБ-П-«Ламинар-С»-1,2 (NEOTERIC), Россия). На первом этапе семена выдерживали в 70%-ном растворе этанола в течение 1 минуты, затем промывали стерильной дистиллированной водой. На втором этапе об-
рабатывали 7%-ным раствором препарата «Ли-зоформин 3000» (ООО «Гигиена плюс», Россия) с экспозицией 10 минут и промывали в стерильной дистиллированной воде четырехкратно.
Биометрические показатели проростков были получены на 19-й день после посадки семян. Статистическая обработка данных проводилась с помощью и-критерия Манна-Уитни. Измерение параметров проводили с помощью программы 1т^е1 (США).
Результаты и обсуждение. Наличие осмотика в питательной среде оказывало ингибирующие действие на энергию прорастания семян С. рудтаеа. В контрольной группе этот показатель составлял 80%, а на средах с ПЭГ он снижался до 15,6-26,6%. Процент проросших семян в контрольной группе на средах ПЭГ 2 и ПЭГ 4 составлял 100%, на среде ПЭГ 6 - 96,67%, а на ПЭГ 8 - 92,5%. Скорость прорастания составила 9-11 дней. Среда ПЭГ 6 является пороговой для всхожести, так как с данной концентрации наблюдалось снижение процента проросших семян (таблица 1).
Осмотик в данных концентрациях вызывал анатомо-морфологические изменения проростков. В контрольной группе у 90% растений были сформированы корни 2 порядка, а на среде ПЭГ 8 этот показатель снизился до 45,94% (рисунок 1). Снижение энергии прорастания, вероятно, связано с уменьшением количества доступной воды, что привело к уменьшению скорости набухания семян.
Средняя высота стебля снизилась с 3,65 см на контроле до 2,98 см на среде ПЭГ 8. Средний размер корней на контрольной среде составлял 3,95 см, а на средах с осмотиком снизился до 2,252,87 см. Средняя длина гипокотиля в контрольной группе составила 1,24 см, под действием осмотика наблюдали снижение до 0,95 см.
В ходе эксперимента были замечены изменения в соотношении размеров корня и стебля. У проростков контрольной группы нет статистически достоверных различий между длиной корня и длиной побега, а в опытных группах длина корня достоверно меньше длины стебля. Статистически достоверные различия в длине корня зафиксированы между проростками, сформированными на среде без добавления осмотика и на средах ПЭГ 6 и ПЭГ 8 (рисунок 2).
Таблица 1. Показатели всхожести семян C pygmaea
Наименование показателя Концентрация ПЭГ в среде IVIS, г/л
0 г/л 2 г/л 4 г/л 6 г/л 8 г/л
Энергия прорастания, % 80 (±6,8%) 26,6 (±5,7%) 18,75 (±8,6%) 23,3 (±5,7%) 15,6 (±1,1%)
Всхожесть, % 100 (±0,0%) 100 (±0,0%) 100 (±0,0%) 96,67 (±3,3%) 92,50 (±4,7%)
Скорость прорастания, сутки 10 11 9 9 9
N у
тз
M
о
M со
Рисунок 1. Проростки С. рудтаеа на среде : А) МS; Б) ПЭГ 8
4,5
3,5
2,5
1,5
0,5
Р
М.С
ПЭГ 2
ПЭГ 4
ПЭГб ПЭГ8
Длинна корня
Высота стебля
Длина гиппокатиля
Рисунок 2. Показатели проростков С. рудтаеа
со гм о гм
о
гм
и
Таким образом, у проростков опытных групп под действием данного стресс-фактора отмечалось ингибирование развития корневой системы.
Влияние осмотика в небольших количествах оказало стимулирующее действие на всхожесть семян Я. pseudoacacia. Энергия прорастания на контрольной группе составляла 80%, а на опытных - от 86,66% до 90%. Всхожесть семян в контрольной группе составляла 90%, а на среде ПЭГ 10 - 100%. Скорость прорастания наблюдалась от 6 до 10 дней. Стимулирующие действие небольшого осмотического стресса на проростание семян Я. pseudoacacia может быть связано с более активным образованием свободных аминокислот, кото-
рые включаются в синтез полипептидов, необходимых для прорастания [5] (таблица 2).
Осмотический потенциал, оказываемый данными концентрациями ПЭГ в среде, оказал небольшое стимулирующее влияние на развитие листьев Я. pseudoacacia (рисунок 3). Наибольшая средняя длина стебля на среде ПЭГ 10 - 5,24 см, наименьшая - на среде ПЭГ 8 и составляла 4,35 см. Длина гипокотиля варьировалась от 1,93 см на среде ПЭГ 8 до 2,36 на среде ПЭГ 10. Статистически достоверных различий между показателями не обнаружено. Таким образом, данное содержание осмотика в питательной среде не вызвало изменений в ростовых процессах проростков (рисунок 4).
Таблица 2. Показатели всхожести семян Я. pseudoacacia
Наименование показателя Концентрация ПЭГ в среде г/л
0 г/л 2 г/л 4 г/л 6 г/л 8 г/л 10 г/л
Энергия прорастания, % 83,3 (±3,3%) 90 (±3,3%) 87,5 (±2,5%) 90 (±16,6%) 86,66 (±6,6%) 86,66 (±7,5%)
Всхожесть, % 90 (±5,7%) 93,33 (±3,3%) 87,5 (±2,5%) 95 (±5,0%) 96,67 (±3,3%) 100 (±0,0%)
Скорость прорастания, сутки 7 6 6 7 7 10
га 1
I г 3 4 5 6 7 В 9 10 11 12 13 14 15 Ï6 17 1 г 3 4 5 6 7 В 6 10 11 13 13 14 15 16 17
Рисунок 3. Проростки R. pseudoacacia на средах: А) MS; Б) ПЭГ 10
Длина
Длина гиппокагиля
M С ПЭГ 2 ПЭГ 4 ПЭГ 6 ПЭГ 8 ПЭГ 10
Рисунок 4. Показатели проростков R. pseudoacacia
ду.*. i *
шШк
■■Ж- 4
' ' ' .% - ч
яш&ЯЪ&ъ h Ь>
Ш
... s— * "'-k 'Ж
Ж
WËÙ Ш '
ш
ilé
oliet
1 CM
%flli f if M lllll
1 CM
m
Рисунок 5. А - Взрослое дерево Robinia pseudoacacia. Б - Семенной материал Caragana pygmaea. В - Семенной материал Robinia pseudoacacia
м о
M со
Выводы. Под действием осмотического стресса уменьшается поступление воды в семена, что влияет на процесс прорастания и отражается на развитии проростков. Наличие ПЭГ 6000 в питательной среде в концентрациях до 10 г/л, оказало стимулирующие действие на всхожесть семян Я. pseudoacacia с 90% в контроле до 100% на среде ПЭГ 10. У проростков отмечалось лучшее развитие листовой пластины, однако длина побега и гипо-котиля между контрольной и опытными группами - без статистически достоверных изменений. Согласно полученным данным, компенсаторные механизмы Я. pseudoacacia к действию данного осмотического стресса обеспечивают нормальное развитие проростков, что является признаком удовлетворительной адаптации к стрессовому фактору.
Используемые концентрации осмотика привели к ингибированию энергии всхожести семян С pygmaea с 80% в контрольной группе до 15,6-26,6% в опытных. Морфологические отличия проростков под влиянием осмотика заключались в статистически достоверном уменьшении длины корня по отношению к длине стебля в опытных группах, при этом в контрольной группе данное различие отсутствовало. Под влиянием осмотика отмечено ингибирование формирования корней второго порядка. Таким образом, изменения, обусловленные наличием ПЭГ 6000 в питательной среде, свидетельствуют о восприимчивости С pygmaea к осмотическому стрессу.
Литература:
1. Гродецкая Т. А., Евлаков П. М., Исаков И. Ю. Анализ экспрессии генов стрессоустойчивости в условиях воздействия засухи на растения березы в Центральночерноземном регионе // Лесотехнический журнал. 2020. Т. 10. №. 2 (38). С. 23-34. DOI: 10.34220Zissn.2222-7962/2020.2/3
2. Лёвин А. Е., Колесниченко Е. Ю. Использование плодовых древесных пород в формировании защитных лесных полос // «Горинские чтения. Инновационные реше-
ния для АПК» 18-19 мар. 2020. С. 135.
3. Макаров В. П. Древесные растения перспективные для лесомелиорации в Забайкальском крае / Материалы Всероссийской конференции с международным участием» Эволюция биосферы и техногенез», VI Всероссийского симпозиума с международным участием» Минералогия и геохимия ландшафта горно-рудных территорий» и XIII Всероссийских чтений памяти академика АЕ Ферсмана» Рациональное природопользование»,» Современное минералообразование», посвященных 35-летию ИПРЭК СО РАН. 2016. С. 205-207.
4. Обручева Н. В. Переход от гормональной к негормональной регуляции на примере выхода семян из покоя и запуска прорастания // Физиология растений. 2012. Т. 59. №. 4. С. 591-600.
5. Пляскина И. Н., Бондаревич Е. А. Влияние осмотического стресса на динамику аминокислот Stipa krylovii Roshev // Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии. 2018. №. 17. С. 377-381.
6. Терещенко Т. В., Жолобова О. О. Эффективные способы стерилизации семян Rоbiniа рsеиdоасасiа L. для введения в культуру in vitro // Научно-агрономический журнал. 2022. №. 2 (117). C. 62-67. DOI: 10.34736/ FNC.2022.117.2.008.62-67
7. Ahmad M. A., Javed R., Adeel M., Rizwan M., Yang Y. PEG 6000-stimulated drought stress improves the attributes of in vitro growth, steviol glycosides production, and antioxidant activities in Stevia rebaudiana Bertoni. Plants. 2020. V. 9. №. 11. P. 1552. Doi.org/10.3390/plants9111552
8. Hidangmayum A., Dwivedi P. Effect of chitosan seed priming on mungbean seedlings subjected to different levels of water potential. Acta Physiologiae Plantarum. 2023. V. 45. №. 1. P. 1-13. DOI: 10.1007/s11738-022-03483-7
9. Meng Q. Niu Y., Niu Xiwu Niu., Roubin R. H. Ethnobotany, phytochemistry and pharmacology of the genus Caragana used in traditional Chinese medicine. Journal of ethnopharmacology. 2009. V. 124. №. 3. P. 350-368. DOI: 10.1016/j.jep.2009.04.048
10. Yuyan An, Zongsuo L. Drought tolerance of Periploca sepium during seed germination: antioxidant defense and compatible solutes accumulation. Acta physiologiae plantarum. 2013. V. 35. №. 3. P. 959-967. DOI: 10.1007/ s11738-012-1139-z
CO IN О CM
c?
CN
И
DOI: 10.34736/FNC.2023.120.1.002.10-15
Assessment of the Osmotic Stress Effect on the Shrub Seeds Germination in "In Vitro" Culture
Sofya V. Mel'nik™, e-mail: melnik-s@vfanc.ru , ORCID 0000-0001-5802-1339, Ol'ga O. Zholobova, Cand. Sci. (Biol.), ORCID 0000-0002-1594-4181, "Federal Scientific Centre of Agroecology, Complex Melioration and Protective Afforestation of the Russian Academy of Sciences" (FSC of agroecology RAS), info@vfanc.ru, 400062, Volgograd, pr-t Universitetskij, 97, Russia
ra X
Abstract. Due to global climate changes, one of the main environmental problems in the territories of the southern regions of Russia is drought. An effective way to prevent the land degradation and desertification processes is the breeding and choise of woody and shrubby plants resistant to this stress factor for their subsequent use in afforestation. The article
presents the results of the osmotic stress influence on seed germination and biometric parameters of model objects Robinia pseudoacacia L. and Caragana pygmaea L. seedlings in "in vitro" culture. To simulate the shortage of available water, osmotic polyethylene glycol (PEG) with a molecular weight of 6000, in concentrations up to 10 g/l, was added to the nutrient
environment according to the Murashige-Skuga recipe. The seed material underwent pre-sterilization treatment and two-stage sterilization to obtain an aseptic culture. As a result of the PEG influence in the nutrient environment, C. pygmaea seeds germination energy inhibition was revealed from 80% in the control group to 15.6-26.6% in the experimental ones. The seedlings in the control group had no statistically significant difference between the root and the shoot length, while in the experimental groups the root length was significantly less than the shoot length. There was an inhibition of the roots of the second order formation compared to the control. These responses are associated with a decrease in the rate of seeds swelling due to a decrease in the amount of available water, which had an impact on the seedlings development. The seeds of R. pseudoacacia showed an increase in seed germination from 90% in the control to 100% on PEG 10 environment. The seedlings of the experimental group had a more developed leaf plate compared to the control. There were no statistically significant differences between the groups in the length of the hypocotyl and stem. Thus, the adaptive mechanisms of R. pseudoacacia in response to this osmotic stress had a slight stimulating effect in the development of the plant.
Keywords: seeds, Robinia pseudoacacia, Caragana pygmaea, polyethylene glycol 6000, drought, in vitro
Funds. The work was carried out as part of the implementation of the research work plan of the Federal Scientific Centre of Agroecology, Complex Melioration and Protective Afforestation of the Russian Academy of Sciences No. 122020100427-1 "Develop scientific foundations for the conservation and reproduction of valuable genotypes of woody and shrubby plants in "in vitro" culture".
Citation. Mel'nik S.V. , Zholobova O.O. Assessment of the Osmotic Stress Effect on the Shrub Seeds Germination in "In Vitro" Culture. Scientific Agronomy Journal. 2023. 1(120). pp. 10-15. DOI: 10.34736/FNC.2023.120.1.002.10-15
Received: 16.01.2023
Accepted: 27.02.2023
References:
1. Grodetskaya T. A., Evlakov P. M., Isakov I. Yu. Analiz ekspressiigenovstressoustojchivosti v usloviyakh vozdejstviya zasukhi na rasteniya berezy v TSentral'no-Chernozemnom regione [Analysis of the stress resistance genes expression under the drought effects on birch plants conditions in the Central Chernozem region]. Lesotekhnicheskij zhurnal [Forest-technical Journal]. 2020. V. 10. No. 2 (38). pp. 23-34. DOI: 10.34220/issn.2222-7962/2020.2/3
2. Lyovin A. E., Kolesnichenko E. Yu. Ispol'zovanie plodovykh drevesnykh porod v formirovanii zashchitnykh lesnykh polos [The use of fruit tree species in the protective forest strips formation]. "Gorinskie chteniya. Innovatsionnye resheniya dlyaAPR" [Gorin readings. Innovative solutions for the agro-industrial complex] 18-19 March. 2020. p. 135.
3. Makarov V. P. Drevesnye rasteniya perspektivnye dlya lesomelioratsii v zabajkal'skom krae [Promising woody plants for forest reclamation in the Trans-Baikal Regions] / Makarov V. P. Promising woody plants for forest reclamation in the Trans-Baikal Territory / Materials of the All-Russian Conference with international participation "Evolution of the biosphere and technogenesis", the VI All-Russian Symposium with international participation "Mineralogy and geochemistry of the mining landscape" and the XIII All-Russian readings in memory of Academician A. E. Fersman "Rational nature management", "Modern mineral formation", 2016. pp. 205-207.
4. Obrucheva N.V. Perekhod ot gormonal'noj k negormonal'noj regulyatsii na primere vykhoda semyan iz pokoya i zapuska prorastaniya [The transition from hormonal to non-hormonal regulation by the example of the seeds coming out of dormancy and starting germination]. Fiziologiya rastenij [Plant Physiology]. 2012. V. 59. No. 4. pp. 591-600.
5. Plyaskina I.N., Bondarevich E.A. Vliyanie osmoti-cheskogo stressa na dinamiku aminokislot Stipa krylovii Roshev [Influence of osmotic stress on the amino acids Stipa krylovii Roshev dynamics]. Problemy botaniki Yuzhnoj Sibiri i Mongolii [Problems of botany of Southern Siberia and Mongolia]. 2018. No. 17. pp. 377-381.
6. Tereshchenko T. V., Zholobova O. O. Effektivnye sposoby sterilizatsii semyan Robinia rseidoasasia L. dlya vvedeniya v kul'turu in vitro [Effective methods of Robinia pseudoacasia L. seeds sterilization for introduction to "in vitro" culture]. Scientific Agronomy Journal. 2022. No. 2 (117). pp. 62-67. DOI: 10.34736/FNC.2022.117.2.008.62-67
7. Ahmad M. A., Javed R., Adeel M., Rizwan M., Yang Y. PEG 6000-stimulated drought stress improves the attributes of in vitro growth, steviol glycosides production, and antioxidant activities in Stevia rebaudiana Bertoni. Plants. 2020. V. 9. No. 11. P. 1552. Doi.org/10.3390/plants9111552
8. Hidangmayum A., Dwivedi P. Effect of chitosan seed priming on mungbean seedlings subjected to different levels of water potential. Acta Physiologiae Plantarum. 2023. V. 45. No. 1. P. 1-13. DOI: 10.1007/s11738-022-03483-7
9. Meng Q. Niu Y., Niu Xiwu Niu., Roubin R. H. Ethnobotany, phytochemistry and pharmacology of the genus Caragana used in traditional Chinese medicine. Journal of ethnopharmacology. 2009. V. 124. No. 3. P. 350-368. DOI: 10.1016/j.jep.2009.04.048
10. Yuyan An, Zongsuo L. Drought tolerance of Periploca sepium during seed germination: antioxidant defense and compatible solutes accumulation. Acta physiologiae plantarum. 2013. V. 35. No. 3. P. 959-967. DOI: 10.1007/ s11738-012-1139-z
Авторский вклад. Авторы настоящего исследования принимали непосредственное участие в планировании, выполнении и анализе данного исследования, ознакомились и одобрили представленный окончательный вариант. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Author's contribution. Authors of this research paper have directly participated in the planning, execution, or analysis of this study. Authors of this paper have read and approved the final version submitted. Conflict of interest. Authors declare no conflict of interest.
M
о
M со
