CC BY
136
УДК 57.013
ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ НАНОЧАСТИЦ МАГГЕМИТА (У-Ю И ЛЕПИДОКРОКИТА (у-ГвООН НА КЛЕТКИ КРОВИ КРЫС ПОСЛЕ ОДНОКРАТНОГО ИНТРАГАСТРАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ
В последние годы отмечается быстрый рост научного, промышленного и коммерческого интереса к наноматериалам. Они производятся в различных формах: нанопорошки, нановолокна, нанотрубки и т.д. [2]. Свойства наночастиц уникальны - высокая поверхностная энергия, устойчивая сорбция биомолекул, изменение физикохимических свойств наночастиц под действием физических полей, наличие магнитных свойств [5]. Благодаря своим размерам (менее 100 нм), сопоставимым с размерами клеток (10-100 мкм), вирусов (20-450 нм), белков (5-50 нм), ДНК (2 нм шириной, 10-100 нм длиной), наночастицы могут приближаться к биообъекту, взаимодействовать и связываться с ним [10]. Наночастицы, обладающие магнитными свойствами, представляют значительный интерес для медицины, что связано с возможностью дистантного управления ими и конструкциями на их основе при наложении внешнего магнитного поля [8]. В настоящее время наиболее широкое применение в биомедицине получили частицы наноразмерного оксида железа [6,9]. Магнитные наночастицы используются в новых методах диагностики, адресного терапевтического воздействия и разработки биологических тканей [4]. Это открывает широкие перспективы для использования наноразмерных оксидов железа в медицине, но также влечет за собой серьезные риски для здоровья человека. Очень слабая растворимость наночастиц в биологических жидкостях является основной причиной биорисков. Из-за крошечного размера, некоторые из них могут проходить через различные биологические барьеры, и транспортироваться по организму в нерастворимой форме. Таким образом, наночастицы могут оказаться в кровотоке после прохождения через дыхательную систему или желудочно-кишечный тракт [7]. Оказавшись в кровяном русле, наночастицы агрегируют к наружной поверхности эритроцитов, искажая саму поверхность мембраны [1]. Исследование различных аспектов влияния наноматериалов на живой организм является актуальной проблемой сегодняшнего дня [3].
Целью данной работы явилась оценка влияния наночастиц у^в20з и у^вООН на клетки крови крыс после однократного интрагастрального введения.
Оценены морфологические и функциональные показатели клеток крови крыс после однократного интрагастрального введения суспензии наночастиц маггемита и лепидокрокита. Показаны изменения упругости и проницаемости плазмалеммы лейкоцитов крови животных опытных групп.
Ключевые слова: наночастицы, маггемит, лепидокрокит, эритроциты, лимфоциты, морфометрические параметры, проницаемость плазма-леммы.
E-mail: fedorova@bsu.edu.ru
Введение
Материалы и методы
Лепидокрокит (у^вООН) в нанодисперсной форме был синтезирован осаждением щелочью из раствора соли двухвалентного железа. Наночастицы маггемита (у-Ре20з) получены путем пиролиза порошка лепидокрокита.
Частицы у^вООН представляют собой наностержни цилиндрической формы, имеющие длину 100-150 нм и диаметр порядка 5-8 нм. Они объединены в параллельноволокнистые агрегаты (рис 1).
Рис. 1. Нанотубулярные частицы у^вООН (а) и у^в20з (б)
Микрофотографии получены с помощью трансмиссионного электронного микроскопа JEM-2l00 в Центре коллективного пользования БелГУ
Нанодисперсный y-FeO?, представляет собой трубки с длиной, сравнимой с длиной стережней y-FeOOH (100 нм), но имеющие больший диаметр - 10 нм. Ширина канала внутри трубок 2-3 нм (рис. 1).
Для проверки биологического действия наночастиц маггемита и липидокроки-та и оценки их возможного влияния на эритроциты и лейкоциты были проведены эксперименты на самцах лабораторных белых крыс. Животные были разделены на три группы. Первая группа являлась контрольной, крысам второй и третей групп однократно интрагастрально вводили суспензию наночастиц y-Fe2O3 и y-FeOOH. Объем вводимой суспензии составлял 1 мл, при концентрации наночастиц маггемита и лепи-докрокита 100мг/мл. Перед введением суспензию обрабатывали в ультразвуковой ванне Сапфир УЗВ - 1,3 ТТЦ (Россия) в течение 10 минут, чтобы разрушить агломераты наночастиц. Забор крови осуществляли путем декапитации, наркотизированных животных через 24 часа после введения суспензии.
Т~| <-> <->
В цельной крови подсчитывали количество эритроцитов и лейкоцитов по стандартным методикам. Для получения концентрированной суспензии лейкоцитов кровь центрифугировали 10 мин. при 1500 об./мин., затем собирали лейкоцитарное кольцо. Примесь эритроцитов разрушали 0.83% раствором хлорида аммония. Из цельной крови и полученной лейкоцитарной суспензии делали мазки для атомно-силового микроскопа (АСМ) NTEGRA vita (NT-MDT Зеленоград, Россия). Сканирование проводили во влажной камере в полуконтактном режиме с использованием кантилевера NSG 11. Морфометрические параметры и упругость плазмалеммы эритроцитов и лимфоцитов оценивали с помощью программного обеспечения Nova 1.0.26 build 1508 (NT-MDT Зеленоград, Россия).
Для оценки проницаемости клеточных мембран лейкоцитов использовали методику флуоресцентного зонда - ацетооксиметилового эфира кальцеина. После 30минутной инкубации в одной из сред лимфоциты помещали в ячейки (Secure-Seal spacer, Cat. - S24737, Molecular Probes, Inc. USA) с питательной средой RPMI (НПП «ПанЭко», Москва) и добавляли 0,5 ц1 1mM кальцеина (Calcein AM, Cat. C3100MP, Molecular Probes, Inc. USA). Сканирование образцов проводили на КЛСМ Nikon DIGITAL ECLIPSE C1 plus с использованием лазера 488 нм в течение 1200 секунд и программного обеспечения EZ-Q ver. 3.80. Осуществляли регистрацию интенсивности флуоресцентного излучения кальцеина в заданный промежуток времени с последующим расчетом коэффициента проникновения - Кп (у.е.) по следующей формуле: Кп = Intmax/t, где Intmax - значение максимальной интенсивности (у.е.); t - время максимального пика интенсивности излучения флуоресцентного зонда (с).
Полученные данные обработаны с помощью программного комплекса Statistica 6. Достоверность различий между группами оценивали по ^критерию Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Общее количество эритроцитов в крови крыс опытных групп уменьшилось: у контрольных животных это показатель составил 7.5 ± 0,2 • 1012/ л, в опытных группах получавшиху-^в20з и у^вООН - 6,8 ± 0,1 • 1012/л, и 6,3 ± 0,1 10 • 1012/л соответственно. Статистически значимы изменения и морфометрических параметров эритроцитов крови крыс опытных групп: высота и объем клеток в группе животных получавших у-Fв20з, достоверно снижались по сравнению с контролем, на 11% и 23.3 % (табл. 1).
Таблица 1
Морфометрические параметры и упругость клеточной мембраны
эритроцитов
Варианты Диаметр (мкм) Высота (мкм) Площадь (мкм2) Объем (мкм3) Упругость плазмалеммы (Па (Па)
Контроль 5.80±0.07 0.47±0.01 28.26±0.53 30.55±1.41 1б.20±0.49
у^в2Оз 5.б7±0.04 0.42±0.01* 28.88±о.48 23.4б±1.09* 22.42±0.95*
у^вООН 5.б1±0.07* 0.46±0.01А 25.7^0.41* 30.58±1.49л 18.54±о.89*
* - достоверность различий между контрольной и опытными группами по критерию Стьюдента (р < 0.05). А - достоверность различий между опытными группами по критерию Стьюдента (р < 0.01).
Площадь поверхности, а следовательно и кислородная ёмкость эритроцитов крыс, которым вводили у^вООН, сократилась на 9.1 % по сравнению с контрольной группой. у^в20з не вызывал таких изменений морфофункциональных параметров эритроцитов. У животных, получавших суспензию наночастиц лепидокрокита и маг-гемита, достоверно возрастала упругость клеточной мембраны эритроцитов (табл. 1).
Общее количество лейкоцитов в крови животных, получавших суспензию наночастиц лепидокрокита, достоверно снижалось по сравнению с контрольной группой и составляло 2.8±0,2 • 109/л - в опыте и 3.6±10 • 109/л - в контроле. Достоверных изменений этого параметра у крыс, получавших суспензию нанодисперсного маггемита, не выявлено, но была отмечена тенденция к снижению общего количества лейкоцитов в крови животных данной группы (з±0.4 • 109/л).
Объем лимфоцитов в опытах с наночастицами у^в20з достоверно уменьшился, разница с контролем составляла 8%, статистически значимых различий по высоте, диаметру и площади не зарегистрировано, но выявлена тенденция к уменьшению всех перечисленных морфометрических параметров клеток (табл. 2).
Таблица 2
Морфометрические параметры и упругость клеточной мембраны лимфоцитов, полученные с помощью АСМ
Варианты Диаметр (мкм) Высота (мкм) Площадь (мкм2) Объем (мкм3) Упругость плазмалеммы (Па)
Контроль 7.47±о.1 1.41±0.04 44.3б±1 6о.49±1.5 16.88 ±0.7
у^в2О3 7.2б±0.1 1.3б±0.03 41.88±о.9 55.б5±1.1* 14.82±о.6*
у^вООН 6.93±0.07а 1.56±0.02*А 38.20±0.8*а 58.77±1.2 14.25±0.50*а
* - достоверность различий между контрольной и опытными группами по критерию Стьюдента (р < 0.05). А - достоверность различий между опытными группами по критерию Стьюдента (р < 0.01).
Проницаемость клеточной мембраны лейкоцитов животных, получавших суспензию маггемита, достоверно снизилась по сравнению с контролем. Время максимального пика интенсивности излучения флуоресцентного зонда составило 1186.9±44.5 с, что на 31% больше, чем в контроле, а значение максимальной интенсивности сократилось на 18% (1785^44.5 у.е.) (табл. 3). Упругость плазмалеммы лейкоцитов в группе крыс, которым вводили у^Є20з уменьшилась на 13% по сравнению с
контролем. «Съеживание» лимфоцитов, изменение пропускной способности и упругости их клеточной мембраны может свидетельствовать о прямом воздействии наночастиц у^е203 на клетки крови, циркулирующие в кровеносной системе.
Таблица 3
Проницаемость клеточных мембран лейкоцитов, по данным конфокальной микроскопии
Варианты Значение максимальной интенсивности (у.е.) Время максимального пика интенсивности излучения флуоресцентного зонда (с) Коэффициент проникновения (у.е./с.)
Контроль 2110.1±75.4 903.7±20.5 2.4±0.1
у^Є20з 1785^44.5* 1186.9±з8.9* 1.6±0.1*
у^еООН 2116.5±30.2а 8з1.1±17.8*а 2.6±0.1а
* - достоверность различий между контрольной и опытными группами по критерию Стьюдента (р < 0.05). А - достоверность различий между опытными группами по критерию Стьюдента (р < 0.01).
В группе животных получавших лепидокрокит высота лимфоцитов возросла при уменьшении их площади, различия достоверны в сравнении с контролем (рис. 2, 3).
Рис.2. Скан АСМ лимфоцита крысы, получавшей лепидокрокит
Рис.3. Скан АСМ лимфоцита крысы контрольной группы
Изменения в проницаемости клеточной мембраны лимфоцитов выражены слабее, чем у животных в опытах с у^е20з, но время максимального пика интенсивности излучения флуоресцентного зонда меньше, чем в контрольной группе (8з1.1±17.8), что говорит о повышении проницаемости мембраны. Упругость плазмалеммы лимфоцитов крыс, которым вводилась суспензия у^еООН была ниже на 13%.
Заключение
Однократное интрагастральное введение суспензий нанодисперсного лепидок-рокита и маггемита в концентрации 100 мг/мл вызывает уменьшение количества эритроцитов и лейкоцитов в крови опытных животных. Изменение морфометрических параметров, упругости и проницаемости плазмалеммы клеток служит доказательством проникновения в кровь из желудочно-кишечного тракта наностержней оксидов железа и их контакта с поверхностью клеток.
1. Ингель Ф.И., Стехин А.А., Яковлева Г.В., Кочеткова М.Г. Влияние наночастиц на каталитическую активность эритроцитов крови. // Электронная публикация http://popnano.ru/science/index.php?task=view&id=236. - 2010. - С. 1-3.
2. Мильто И.В., Михайлов Г.А., Ратькин А.В., Магаева А.А. Влияние наноразмерных частиц на морфологию внутренних органов мыши при внутривенном введении раствора нанопорошка Fe3O4. // Бюллетень сибирской медицины. - 2008. - Вып. 1 - С. 32-36.
3. Мильто И.В., Михайлов Г.А. Морфологический контроль состояния внутренних органов крысы при внутрибрюшинном введении нанопорошка Fe3O4 // Материалы Всероссийской 66-ой итоговой студенческой научной конференции им. Н.И. Пирогова. -Томск: СибГМУ, 2007. - С. 336
4. Першина А.Г., Сазонов А.Э., Мильто И.В. Использование магнитных наночастиц в биомедицине // Бюллетень сибирской медицины. - 2008. - Вып. 2 - С. 72
5. Суздалев И.П. Нанотехнология: физико-химия нанокластеров, наноструктур и наноматериалов. - М.: КомКнига, 2006. - 592 с.
6. Berry C., Curtis A. Functionalisation of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine // J. Phys. D. Appl. Phys. - 2003. - Vol. 36. - P. 198-206.
7. Claude Ostiguy, Brigitte Soucy. et al Studies and Research Projects , report R-589, Health Effects of Nanoparticles, second edition. - Montreal, 2008. - 106 p.
8. Gu H., Xu K., Xu C. et al. Biofunctional magnetic nanoparticles for protein separation and pathogen detection // J. of the American Chemical Society Chem. Commun. - 2006. - Vol. 9. -
P. 941-949.
9. Lu A.-H., Salabas E.L., Schuth F. Magnetic nanoparticles: synthesis, protection, functionalization, and application // Angew. Chem. Int. Ed. - 2007. - Vol. 46. - P. 1222—1244.
10. Salata O.V. Applications of nanoparticles in biology and medicine. Электронная публикация http://www.jnanobiotechnology.com/content/2/1/3
ESTIMATION OF INFLUENCE OF NANOPARTICLES OF MAGHEMITE (V-FeO) AND LEPIDOCROCITE (V-FsOOH ON BLOOD CELLS OF RATS AFTER SINGLE INTRAGASTRIAL INSTILLATION
Список литературы
Morfometrical indicators of blood cells of rats after single intragastrial instillation of suspension of nanoparticles Y-FezO3 and Y-FeOOH are estimated. Elasticity and permeability changes of plasmolemma of leukocytes of blood of animals in experimental groups are shown.
Key words: nanoparticles, maghemite, lepidocrocite, red blood cells, lymphocytes, morfometrical parametres, permeability of plasmolemma.
