CC BY
30
УДК 615.017:612.084:612.222
ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ АПРОТИНИНА НА СТЕПЕНЬ ГИПОКСЕМИИ У КРЫС ПРИ ОСТРОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ЛЁГКИХ
Куликов О.А.
ФГБОУ ВО «Национальный исследовательский Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва», г. Саранск, Российская Федерация.
Аннотация: Проведено исследование эффективности внутривенного применения липосом, содержащих апротинин (препарат «гордокс») в условиях экспериментальной модели острого повреждения лёгких. Для эксперимента липосомы с апротини-ном получали методом обращения фаз из холестерина и лецитина. Эффективность включения препарата в липосомы составила 31,85%. В эксперименте показано, что после введения липосом летальность подопытных животных достоверно не изменяется. По сравнению с внутривенным введением дексаметазона липосомальный апротинин лучше препятствовал развитию гипоксемии через час после введения. Липосмальный апротинин оказывал свой эффект в дозе 12000 КИЕ/кг. Ключевые слова: липосомы, апротинин («гордокс»), острое повреждение лёгких, дексаметазон.
Исследования последних лет показывают, что ингибиторы протеолитических и липолитических ферментов ингибируют воспалительный процесс и защищают лёгочную ткань от повреждения [1, с. 1451]. Особый интерес представляет собой эффект апротинина в предотвращении острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) при гриппе ШШ. В исследованиях было показано, что апротинин заметно снижает патологию в легких и спасает от гибели мышей, инфицированных вирусом гриппа А или В. Эффективным оказалось как парентеральное, так и ингаляционное введение препарата [2, с. 53]. Лечебный эффект явился следствием ингибирования протеиназ, которые активируют развитие гриппозной инфекции [3, с. 182]. К ОРДС может приводить и аспирация желудочного содержимого. Такую форму повреждения лёгких можно смоделировать экспериментально [4, с. 585]. В патогенезе аспирационного синдрома участвует протеолити-ческий фермент пепсин, что может служить обоснованием для применения апротинина. Использование ли-посом в качестве системы доставки апротинина в органы обладает рядом преимуществ перед использованием растворов и не снижает антиферментной активности препарата [5, с. 561]. Настоящая работа ставила цель оценить в эксперименте эффективность липосо-мальной формы апротинина, как средства снижающего гипоксемию при остром повреждении лёгких.
Материалы и методы: Для получения липосом использовался препарат «гордокс» (действующее вещество апротинин) 10000 КИЕ/мл раствор для инъекций ОАО «Гедеон Рихтер» (Венгрия). Липосомы получали
методом обращения фаз из лецитина и холестерина. Апротинин инкапсулировался путём пассивной загрузки. Для количественного анализа, полученных ли-посом использовали раствор цианинового красителя Суатпе-7 (Су-7) с концентрацией 27 мкг/мл. К 12 мл исходного препарата «гордокс» добавляли 20 мл раствора Су-7 и перемешивали на магнитной мешалке. Очистку от свободного и не связавшегося с апротини-ном красителя осуществляли методом диализа в камере для ультрафильтрации с диаметром пор 12-14 кДа. Диализ проводили под давлением азота 0,3 МПа и при частоте оборотов магнитной мешалки - 60-80 об/мин. Диализ длился в течение 24 часов до остаточного объёма - 12 мл. По результатам спектрофотомет-рии (Х=760 нм) 252,156 мкг красителя Су-7 связалось со 120000 КИЕ препарата «гордокс», эффективность связывания - 77,8%. Очистка липосом от свободного комплекса апротинин-Су-7 осуществлялась гель-фильтрацией с использованием геля «Сефадекс G-75». Размер липосом определяли с помощью анализатора на-ночастиц - NANO-flex. В результате были изготовлены липосомы содержащие апротинин с размерами порядка 212,3±12,5нм. По результатам анализа, полученных липосом содержание апротинина в липосомах составило 3184,75 КИЕ/мл, эффективность включения препарата в липосомы - 31,85%.
Эксперимент проводили на белых беспородных крысах обоего пола массой 220-300 г. Животных разделили на группы по 15 в каждой. Животным 1-ой группы (контроль 1) под наркозом (рометар 10 мг/мл и золетил 10 мг/мл) производили моделирование
—--—
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
острого повреждения легких путем интратрахеального (и/т) введения 0,03 мл предварительно приготовленного раствора ацидин-пепсина [4] (1 таблетка на 0,5 мл физ. раствора). Для эксперимента использовался препарат ацидин-пепсин таблетки, содержащие бетаина гидрохлорид 200 мг и пепсин 50 мг (Белмедпрепараты, Республика Беларусь). Животным 2-ой группы (контроль 2) ч/з 20 мин после аспирации раствора ацидин-пепсина однократно в хвостовую вену вводили декса-метазон (раствор для инъекций 0,4%, КРКА, д.д., Ново место, Словения) в дозе 6 мг/кг. 3-я экспериментальная группа состояла из животных, которым вводили липо-сомальный апротинин из расчёта 12000 КИЕ/кг в объёме 0,9 - 1,25 мл внутривенно (в/в) однократно. Во всех экспериментальных группах с целью профилактики инфекционных осложнений животным внутримышечно (в/м) вводили цефтриаксон в дозе 200 мг/кг/сутки в течение 6 дней. Отдельную группу составили интактные крысы. Оценку эффектов в/в введения лекарственных средств проводили через 1 час после инъекции, через 24 часа и 6 суток. Для этого у живот-
ных измеряли сатурацию гемоглобина (Sp02) при помощи пульсоксиметра (аппарат BIOPAC MP-150, США) и парциальное давление кислорода крови (рО2) (аппарат EasyBloodGas, Medica, США). Для определения рО2 осуществляли забор капиллярной крови из задней лапы животного. За животными вели ежедневное наблюдение и фиксировали летальность. Значимость различий сравниваемых величин определяли на основании t-критерия Стъюдента и х - квадрат. Значимыми считали различия при р <0,05.
Результаты и обсуждение. Спустя 1 сутки после моделирования острого повреждения лёгких, на фоне терапии, состоящей лишь из в/м введения цефтриак-сона выжило 50% животных из группы (Рис. 1). Животные, получившие дексаметазон имели выживаемость 60%. После введения липосомального апроти-нина на 1-е сутки процент выживших животных составил 73,4%. В дальнейшем до 6-х суток наблюдения животные в группах не погибали. Достоверных различий в выживаемости животных на фоне различных схем терапии не отмечалось.
сутки
0
1
2
3
6
—♦— ацидин-пепсин и/т; цефтриаксон
—■— ацидин-пепсин и/т; дексаметазон+цефтриаксон
-А- ацидин-пепсин и/т; липосомальный апротинин+цефтриаксон
Рис. 1. Влияние липосомального апротинина на выживаемость экспериментальных животных при остром повреждении
лёгких.
Через 1 час после аспирации ацидин-пепсина, при отсутствии лечения сатурация гемоглобина составила 80,9±2,2%, а парциальное давление кислорода крови -48,7±2,8 мм рт. ст. Оба показателя показывают состояние гипоксемии в результате аспирационного сидрома. В группе с введением дексаметазона через 1 час сатурация гемоглобина составила 78,8±1,45%, что достоверно ниже, чем у интактных животных. При этом рО2 составило 46,3±2,0 мм рт. ст. После введения липосомального апротинина SрО2 была на уровне 84,5±0,5%, а рО2 - 53,6±2,9 мм рт. ст., что ниже, чем у интактных животных, но значимо выше, чем соответствующие значения в группе, где производили введение дексаме-тазона.
Через 24 часа в группе с введением одного антибиотика SрО2 была 82,4±2,3% при рО2 50,6±1,2 мм рт. ст., в группе с введением дексаметазона SрО2 была 78,8±1,45%, рО2 - 51,7±1,2 мм рт. ст., что достоверно меньше, чем у здоровых животных для первой и второй контрольной группы. В группе с липосомальным апротинином SрО2 составила 83,5±2,1%, а рО2 -52,1±2,3 мм рт. ст., что меньше, чем у интактных животных.
Спустя 6 суток SрО2 всех экспериментальных групп, где использовалась терапия, была достоверно ниже, чем у интактных животных. В группе, где животные в течение 6 суток получали лишь антибиотик, SрО2 составила 86,7±2,2%, в группе с дексаметазоном
- 82,6±2,1%. В этих же группах парциальное давление кислорода составило 57,0±1,2 мм рт. ст. и 50,9±2,3 мм рт. ст. соответственно. В группе через 6-суток после применения липосом с апротинином SрО2 составила 85,0±1,15% и рО2 - 55,3±2,8 мм рт. ст. Как и в предыдущих группах, значения оксигенации были достоверно ниже, таковых у здоровых крыс.
Вывод. Липосомальная форма апротинина оказывает корригирующее влияние на уровень сатурации гемоглобина и парциального давления кислорода крови при остром повреждении лёгких без значимого влияния на выживаемость подопытных животных.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
[1] Торкунов П.А. Исследование роли протеаз нейтрофи-лов в развитии токсического отёка лёгких // Психофармакология и биологическая наркология. 2007. Т.7, №1. С. 1448 - 1452.
[2] Апротинин, ингибитор протеаз, - новая альтернатива в лечении гриппа / Дивоча В. А. [и др.] // Российский медицинский журнал. 2012. №2. С. 52-56.
[3] Современные подходы в профилактике и лечении гриппа: перспективы применения ингибиторов протео-лиза / Лагода О. В. [и др.] // Вестник Санкт-Петербургского университета. 2013. Т. 11. №. 2. С. 170 -184.
[4] Куликов О.А. Эффективность внутривенного введения гиперосмолярных растворов при экспериментальной аспирационной пневмонии у крыс // Журнал научных статей «Здоровье и образование в XXI веке». 2016. Т. 18. № 2. С. 585-589.
[5] Балкина А.С., Селищева А.А., Ларионова Н.И. Липосо-мальные формы белковых ингибиторов протеиназ: получение и специфическая активность // Биомедицинская химия. 2008. Т.54. №5. С. 561-569.
EVALUATION OF THE EFFECT OF LIPOSOMAL APROTININ ON THE DEGREE OF HYPOXEMIA IN THE RATS WITH ACUTE LUNG INJURY
Kulikov O.A.
Ogarev Mordovia State University, Saransk, Russian Federation.
Annotation: The efficacy of intravenous application of liposomes containing aprotinin ("gordox" preparation) under the experimental model of acute lung injury was studied. For the experiment, liposomes with aprotinin were obtained by reversing the phases from cholesterol and lecithin. The effectiveness of the inclusion of the drug in liposomes was 31.85%. In the experiment it was shown that after the administration of liposomes the lethality of the experimental animals does not change significantly. Compared to the intravenous administration of dexamethasone, liposomal aprotinin better inhibited the development of hypoxemia an hour after administration. Liposmal aprotinin had its effect in a dose of 12,000 KIU/kg. Key words: liposomes, aprotinin ("gordox"), acute lung injury, dexamethasone.
REFERENCES
[1] Torkunov P.A. Study of the role of neutrophyle proteases in development of toxic lung oedema // Psychopharmacol. Biol. Narcol., 2007, vol. 7, no. 1, pp. 1448-1452.
[2] Aprotinin, a protease inhibitor, is a new alternative in the treatment of influenza / Divocha V. A. // Rossiyskiy med-itsinskiy zhurnal, 2012., no. 2. pp. 52-56.
[3] Modern approaches to the prevention and treatment of influenza: the prospects for the use of proteolysis inhibitors /
Lagoda O. V. // Vestnik Sankt-Peterburgskogo universi-teta, 2013, vol. 11, no. 2, pp. 170 -184.
[4] Kulikov O.A. Efficiency intravenous administration of hyperosmolar solutions in experimental aspiration pneumonia in rats // Zhurnal nauchnykh statei «Zdorov'e i obrazovanie v XXI veke», 2016. vol. 18. no. 2, pp. 585-589.
[5] Balkina A.S., Selishcheva A.A., Larionova N.I. Liposomal formulations of protein proteinase inhibitors: preparation and specific activity // Biomedical Chemistry, 2008, vol. 54, no. 5, pp. 561-569.
