CC BY
26
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Тодоров И.Н., Тодоров Г.И.. Стресс, старение и их биохимическае коррекцие.- М.: Наука - 2003. - 479 с.
2 Fabris N. Neuroendocrine-immune interactions: a theoretical approachto ageing. //Arch GerontolGeriatr. (1991), 12:219-230.
3 Пальцев М.А., Кветной И.М. Руководство нейроиммуноэндокринологие. М. ОАО Изд. «Медицина» 2006, 384 с.
4 Анисимов В.Н. Молекулерные и физиологические механизмы старение. - Санкт-Петербург: «Наука». - 2008.
5 De La Fuente M. Effects of antioxidants on immune system ageing. EurJClinNutr. (2002), 56:S5-S8.
6 Rozemuller AJ, van Gool WA, Eikelenboom P. The neuroinflammatory response in plaques and amyloid angiopathy in Alzheimer's disease: therapeutic implications. Curr Drug Targets CNS NeurolDisord. (2005), 4:223-233. [PubMed].
7 Choi Y, Chen HV, Lipton SA. Three pairs of cysteine residues mediate both redox and Zn2+ modulation of the NMDA receptor. J Neurosci (2001), 21: 392-400,. [PubMed].
8 Yun-Beom Choi, Huei-Sheng Vincent Chen, and Stuart A. Lipton, Choi Y, Chen HV, Lipton SA. Three pairs of cysteine residues mediate both redox and Zn2+ modulation of the NMDA receptor. J Neurosci (2001), 21: 392-400, Abstract/FREE Full Text.
М.К- БАЛАБЕКОВА, Э.Е. НЦ) РАШЕВА, 9.4. НЦ РМЦ ХАМБЕТОВ, К-Ж. ПРАЛИЕВ, В.К. Ю, А.А. АМАНОВ
КАРТАЙГАН ЕГЕУКЦ ЙРЫКТАРДЫН КОГНИТИВТ1 ДИСФУНКЦИЯСЫН МХФ-15 АРКЫЛЫ ТИ ЗЕТУ
Тн йiн: Бщ л жщ мыста стреске щ шыратылган K8pi егеуад йры^тардьщ тэртт серпiлiстерiне синтезделген иммуномодулетор МХФ-15 acepi зерттелген. МХФ-15 эсерЫен ^озгалыс жэне су лабиринтiнде ориентациельщ белсендiлiгi жа^сарды. Тн йiндi сЗ здер: МХФ-15, синтезделген иммуномодулетор, тэртт серпiлiстерi
M.K. BALABEKOVA, E.E. NURASHEVA, A.N. NURMUKHAMBETOV, K.D. PRALIEV, V.K. YU, A.A. AKANOV
CORRECTION COGNITIVE DYSFUNCTION OLD RATS WITH MXF -15
Resume: In this paper we studied the effect of synthetic immunomodulator MXF -15 on the behavioral responses of old rats exposed to emotional stress. Under the influence of the MXF -15 significantly improved horizontal and vertical motor activity, as well as spatially orienting activity in the water maze . Keywords: MXF -15 , a synthetic immunomodulator, behavioral responses
УДК 616.24-002:616-08:615:599.323.4:616-092.4
А.А .БИРКУН , А В. КУБЫШКИН
ГУ "Крымский государственный медицинский университет имени С. И. Георгиевского",
г. Симферополь, Украина
ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ КОМБИНИРОВАННОЙ СУРФАКТАНТ-АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТЕРАПИИ НА ПАТОГЕНЕЗ ПНЕВМОНИИ, ВЫЗВАННОЙ PSEUDOMONAS AERUGINOSA
Патогенетические особенности бактериальной пневмонии определяют необходимость формирования высокой концентрации антибиотика в очаге инфекции. Для улучшения доставки противомикробных средств в периферические отделы легких было предложено использовать экзогенный сурфактант.
Антибактериальные и поверхностно-активные свойства амикацина (Амицил, Киевмедпрепарат, Украина), экзогенного сурфактанта (Сузакрин, Докфарм, Украина), а также их смеси были изучены с помощью стандартных микробиологических методов и модифицированного метода Pattle in vitro и у 119 крыс линии Wistar, включая инфицированных (интратрахеальное введение Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853) и неинфицированных животных. Также оценивались гистопатологические данные, лейкоцитарный состав крови и бронхоальвеолярного смыва (БАС), показатели парциального давления кислорода в артериальной крови.
Тогда как при смешивании в одном объеме in vitro поверхностная активность и антибактериальные свойства сурфактанта и амикацина не изменялись, у животных с пневмонией комбинация сурфактант-амикацин характеризовалась более высокой антисинегнойной и противовоспалительной активностью по сравнению с терапией только амикацином. Кроме того, комбинированная терапия сдерживала уменьшение поверхностной активности БАС. Результаты свидетельствуют о положительном влиянии комбинированной терапии на патогенез острой пневмонии и могут составить основу для дальнейших клинических исследований. Ключевые слова: пневмония, антибиотики, сурфактант, лечение.
Введение. Патогенез острой бактериальной пневмонии предполагает инвазия и пролиферация возбудителё в респираторной ткани с развитием местного и системного воспалительного ответа и вторичными нарушениёми вентилёции *8+. Соответственно, успешность лечениё пневмонии в значительной мере определёетсё эффективностья антибактериальной терапии, котораё, в своя очередь, зависит от формированиё достаточной концентрации антибиотика в очаге инфекции *1+. Благодарё способности снижать поверхностное натёжение бронхоальвеолёрной жидкости и расправлёть ателектазированные участки легких *5,9+ экзогенный сурфактант может быть использован в качестве фармакологического проводника, улучшаящего распределение противомикробных средств
в
дыхательных путёх, а также их доставку в инфицированные отделы *2,7+. Ранее сообщалось о некоторых эффектах комбинаций экзогенного сурфактанта и антибиотиков in vitro и у лабораторных животных *3,4,6+. Тем не менее, комплекснаё оценка комбинированной сурфактант-антибактериальной
терапии in vivo до сих пор не выполнёлась. Задачи исследованиё состоёли в изучении взаимного влиёниё экзогенного сурфактанта и антибиотика амикацина на антибактериальные и поверхностно-активные свойства при смешивании in vitro в одном объеме, а также в патогенетической оценке эффектов их совместного интратрахеального введениё крысам с экспериментальной острой пневмонией, вызванной Pseudomonas aeruginosa.
Материалы и методы. In vitro. Антибактериальные свойства антибиотика амикацина из группы аминогликозидов (Амицил, Киевмедпрепарат, Украина), стерильного натурального свиного легочного сурфактанта (Сузакрин, Докфарм, Украина), а также их
смеси были изучены in vitro методом серийного разведение в бульоне Хоттингера с определением минимальных подавлеящих концентраций (МПК) через 24 часа после внесение суспензии P. aeruginosa (штамм ATCC 27853) и последуящим измерением минимальных бактерицидных концентраций (МБК) через 24 часа после переноса материала на месопептонный агар. Максимальные изученные концентрации достигали 1000 мкг/мл дле амикацина, 5000 мкг/мл дле чистого экзогенного сурфактанта и 700 мкг/мл дле экзогенного сурфактанта в смеси с антибиотиком. Поверхностно-активные свойства сурфактанта, разведенного физраствором (контрольнае смесь), и сурфактанта, разведенного раствором амикацина (экспериментальнае смесь), были изучены с помощья модифицированного метода Pattle [10], который позволеет оценить динамику силы поверхностного натёжение в соответствии с изменениеми диаметра пузырьков воздуха. Исследуемые вещества подвергали вспенивания в пробирках, а полученнуя пену исследовали при помощи микроскопа Olympus CX41, оснащенного фотокамерой Olympus C5050Z. Фотографирование одного поле зрение (увеличение 200х) осуществлелось в течение 20 минут с интервалом 30 секунд. Все полученные снимки (n = 1230) анализировали при помощи программного продукта Olympus DP-Soft 3.11. На всех снимках каждой повторности отслеживали изменение 20 произвольно выбранных пузырьков. Диаметр пузырьков (мкм) измерели только дле первого и последнего (полученного через 20 минут) снимка. В целом выполнено 1200 измерений пузырьков. Дле каждой повторности вычислели индекс стабильности (ИС) по следуящей формуле:
ИС _
а
где dx - результат последнего измерениё в серии (41 и снимок), dy - результат первого измерениё в серии (1 и снимок). Дополнительно, в качестве показателё, отражаящего динамику поверхностной активности, рассчитывали средняя разницу диаметра пузырьков. Концентрации сурфактанта (20,6 мг/мл) и антибиотика (29,4 мг/мл) в контрольной и экспериментальной смесёх соответствовали средним суточным дозам, рекомендованным длё взрослого мужчины массой 70 кг (700 мг/сутки длё сурфактанта, 1000 мг/сутки длё амикацина), и допустимому длё интратрахеального введениё суточному объему жидкости. In vivo. Дозы сурфактанта и амикацина рассчитывали исходё из максимальных суточных доз,
рекомендованных дле взрослых пациентов, а именно 10 мг/кг и 15 мг/кг соответственно. Приготовление раствора антибиотика, эмульсии сурфактанта и
экспериментальной смеси антибиотика с сурфактантом выполнели с использованием стерильного 0,9% NaCl непосредственно перед интратрахеальным введением. Взрослые самцы крыс линии Wistar (п = 119) весом 180220 г были распределены в 10 групп (таблица 1) в зависимости от характера субстанции, введенной в трахея на этапе индукции пневмонии (бактериальнае суспензие или физраствор), и вида терапевтического воздействие через 6 часов после индукции пневмонии.
Таблица 1 - Характеристика групп животных
Введение P.
aeruginosa
Название группы
здоровые
неинфицированные/физраствор
неинфицированные/сурфактант
неинфицированные/амикацин
неинфицированные/сурфактант-амикацин
инфицированные/без терапии
инфицированные/физраствор
инфицированные/сурфактант
инфицированные/амикацин
инфицированные/сурфактант-амикацин
Лечение
нет
нет
нет нет
да да
да да
да
Бактериальнае взвесь была приготовлена из суточной культуры P. aeruginosa (штамм ATCC 27853). Оптическае плотность бактериальной суспензии соответствовала 10 единицам мутности по стандарту McFarland (3,0x10 9 КОЕ/мл).
Пробы бронхоальвеолерного смыва (БАС) и крови засевали на твердые питательные среды. Дле проб крови выполнели предварительнуя инкубация в сахарном бульоне в течение 24 часов при температуре 37 °C. Идентификация бактерий проводили с применением традиционных микробиологических методов. Поверхностнуя активность проб БАС оценивали при помощи модифицированного метода Pattle, как описано выше (4797 снимков; 4680 измерений). Дополнительно оценивались гистопатологические данные, показатели парциального давление кислорода в артериальной крови (PaO2), качественный и количественный лейкоцитарный состав БАС и крови.
Дле сравнение всех числовых данных использовалсе t-тест Стьядента. Уровень вероетности различий p<0,05 рассматривалсе как статистически значимый.
нет физраствор
сурфактант амикацин
сурфактант-амикацин
нет физраствор
сурфактант амикацин сурфактант-амикацин
Срок Срок лечениё забоё (ч) (ч)
6
0 24
24 24
24
6
24
6
24 24 24
6 18 12 16 11 11 12 11 11 11
Результаты. In vitro. Как можно было ожидать, амикацин сам по себе характеризовалсе высокой бактериостатической и бактерицидной активностья в отношении P. aeruginosa (МПК и МБК = 3,9 мкг/мл), тогда как экзогенный сурфактант не обладал каким-либо антибактериальным действием в изученном диапазоне концентраций (МПК и МБК > 5000 мкг/мл). После смешивание с сурфактантом в одном объеме антисинегнойные свойства амикацина не изменелись (МПК и МБК = 3,9 мкг/мл).
Экспериментальной смеси сурфактанта с амикацином был свойственен меньший диаметр пузырьков по сравнения с сочетанием сурфактанта и физраствора как в начале, так и в конце эксперимента (p<0,001), а также значительно меньшае разница диаметра пузырьков (p<0,001) (таблица 2). Тем не менее, обе смеси характеризовались высокими значениеми ИС при отсутствии существенной разницы между ними (p>0,05).
2
2
n
6
6
6
6
Таблица 2 - Показатели поверхностной активности экспериментальной и контрольной смесей
Показатели поверхностной активности Сурфактант + физраствор (контроль) Сурфактант + амикацин
Диаметр пузырьков, М ± т (п), мкм:
(а) начало эксперимента 77,98 ± 2,03 (100) 56,04 ± 2,01 (100)
(б) конец эксперимента (спусте 20 мин) 67,35 ± 1,56 (100) 51,45 ± 2,12 (100)
разница между (а) и (б) 10,62 ± 1,18 (100) 4,59 ± 0,62 (100)
Индекс стабильности (ИС) 0,76 ± 0,04 (5) 0,85 ± 0,05 (5)
Примечание: M ± m - среднее ± стандартнае ошибка среднего.
In vivo. Развитие острой пневмонии подтвердилось при гистопатологическом исследовании во всех группах инфицированных животных. У здоровых крыс и неинфицированных животных, получавших физраствор, сурфактант, амикацин и комбинация сурфактант-амикацин, отсутствовали как морфологические признаки пневмонии, так и рост P. aeruginosa по данным микробиологической оценки. Распространенность (пробы БАС и крови) и интенсивность (пробы БАС) роста
P. aeruginosa были более выражены у инфицированных крыс, которым интратрахеально вводили физраствор и сурфактант, но значительно менее заметны у инфицированных животных, получавших комбинация сурфактант-амикацин (таблица 3; рисунки 1 и 2). Амикацин без сурфактанта также демонстрировал антисинегнойнуя активность, которае, тем не менее, была не столь выраженной.
Таблица 3 - Результаты оценки здоровых и инфицированных животных
Исследованные показатели здоровые крысы (0 ч) инфицированные крысы
без лечение (6 ч) физраствор (24 ч) сурфактант (24 ч) амикацин (24 ч) сурфактант-амикацин (24 ч)
Ра-позитивные крысы, кровь, %±т 0±40 (6) 36±15 (11) 58±15 (12) 36±15 (11) 36±15 (11) 27±14 (11)
Ра-позитивные крысы, БАС, %±т 0±40 (6) 91±9 (11) 100±25(12) 100±27 (11) 82±12 (11) 55±16 (11)
Среднее обсемененность Ра, БАС, ^1о±т не применимо 3,47±0,38 (10) },52±0,34 (12) 4,2 !0±0,38 (11) 2,74±0,41 (9) 2,33±0,33 (6)
Пределы концентраций Ра, БАС, КОЕ/мл не применимо 0500000 100 - 1000000 ] 00 - 1000000 0100000 010000
Индекс набильнони, М±т 0,97±0,04 (6) ( 1,85±0,04 (11) 0, 71±0,07 (12) 0,88 ±0,05 (11) 0,61: 0,10 (11) 0,88±0 05 (11)
Разница диамефа пузырьков, мкм, М±т 0,69±0,30 (120) 2,62±0,25 (220) 5,56±0,39 (240) 2,33±0,32 (220) 7,09±0,52 (220) 2,52±0,33 (220)
ра02, мм рт. ст., м±т 135,50±8,49 (6) 174,20±5,77 (10) 122,45±10,46 (11) 127,91±6,31 (11) 123,64±10,42 (11) 146,27±6,90 (11)
Соотношение Г/А, БАС, М±т 0,29±0,03 (6) ( 1,32±0,03 (11) 0, 56±0,03 (12) 0,53 ±0,04 (11) 0,31± 0,04 (11) 0,26±0 03 (11)
Соотношение Г/А, кровь, М±т шмечание большинав 0,23±0,02 (6) ( о данных пред 1,29±0,02 (11) 0, ставлено проце 58±0,01 (12) 0,64 нюм (%) или сре ±0,05 (11) 0,30± щним (M) с ука 0,04 (11) 0,20±0 ¿анием стандар 01 (11) ной ошибки (±m
); в
скобках указано число наблядений; пределы представлены минимальными-максимальными показателеми; Pa - P. aeruginosa; Г/А - гранулоциты/агранулоциты; КОЕ/мл колониеобразуящие единицы в миллилитре.
Рисунок 1 - Процентное распределение P. aeruginosa-позитивных крыс
5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0
здоровые крысы инфицированные/инфицированные/инфицированные/инфицированные/инфицированные/ без_лечения физраствор сурфактант амикацин сурфактант-
амикацин
Рисунок 2 - Численность колоний
Развитие внутрилегочного и системного воспалениё отчетливо проёвилось у инфицированных животных, получавших физраствор и сурфактант, существенно повышенным соотношением гранулоциты/агранулоциты в пробах БАС и крови по сравнения с таковым у здоровых крыс (p<0,001). В то же времё, у животных, которые получали только амикацин или комбинация сурфактант-амикацин, значительных изменений клеточного воспалительного ответа не наблядалось (p>0,05) (таблица 3). Наименьшие показатели соотношениё гранулоциты/агранулоциты были зарегистрированы в группе комбинированной терапии.
P. aeruginosa в пробах БАС (logio)
Интратрахеальное введение P. aeruginosa приводило к снижения поверхностной активности БАС, что проёвилось ёвным снижением ИС и ростом разницы диаметра пузырьков (таблица 3; рисунок 3). Эти изменениё были более свойственны крысам, которые получали физраствор и, в наибольшей мере, раствор амикацина. У животных из групп терапии сурфактантом и смесья сурфактанта амикацином угнетение
поверхностной активности БАС было менее выраженным.
3 Средняя разница диаметра пузырьков, мкм
—О_Средний индекс стабильности
1,2
здоровые крысыинфицированные/ инфицированные/ инфицированные/ без_лечения физраствор
0,8
0,6
0,4
0,2
инфицированные/инфицированные/ сурфактант-амикацин сурфактант амикацин
Рисунок 3—Поверхностно-активные свойства проб БАС
Показатель PaO2, зарегистрированный через 6 часов после инфицированиё, значительно превышал таковые у здоровых животных (0 ч) и всех остальных групп инфицированных крыс (24 ч) (таблица 3). Применение сурфактанта, амикацина или комбинации сурфактанта с амикацином не оказывало существенного влиёниё на
Обсуждение и выводы. В популёции крыс с острой пневмонией, вызванной P. aeruginosa, интратрахеальнаё инстиллёциё смеси сурфактант-амикацин приводила к (а) ёвному снижения бактериальной контаминации дыхательных путей, (б) ограничения бактериемии и (в) подавления гранулоцитарного ответа. Комбинациё сурфактант-амикацин характеризовалась большей выраженностья этих эффектов по сравнения с чистым амикацином. Кроме того, комбинированнаё терапиё сдерживала снижение поверхностной активности проб
БАСтываё, что in vitro при смешивании в одном объеме поверхностнаё активность и антибактериальные свойства
сурфактанта и амикацина оставались без изменений, создаетсё впечатление, что вышеописанные положительные эффекты комбинированной терапии у крыс с пневмонией вероётнее обусловлены более эффективной доставкой антибиотика в респираторный отдел легких и заместительными поверхностно-активными свойствами свиного сурфактанта, чем прёмым взаимным влиёнием ингредиентов экспериментальной комбинации. Таким образом, исследование показало отсутствие взаимного неблагоприётного влиёниё между свиным сурфактантом и амикацином, а также преимущества комбинированной сурфактант-антибактериальной
терапии по сравнения с использованием только амикацина и только сурфактанта при воздействии на патогенез острой пневмонии, вызванной P. aeruginosa. Полученные данные могут послужить основой длё дальнейших клинических исследований в этой области.
8
7
1
6
5
4
3
2
1
0
0
