CC BY
9УДК 579.64:632
А.Н. Перебитюк, Л.Н. Конюшкевич, Г.В. Машковская, В.Н. Пучко
ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ФИТОТОКСИЧНЫХ ПСЕВДОМОНАД НА РАЗВИТИЕ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ РАЗЛИЧНЫХ ГЕНОТИПОВ
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Возможность применения биологических и, в частности, микробиологических объектов для стимуляции роста культурных растений, а также защиты от фитопатогенов и сорных растений исследуется около 70 лет [1]. В начале 1980-х интерес к биологическому контролю (биологическая защита растений с помощью других организмов) резко возрос в связи с появляющимися возможностями получения биопрепаратов и биотехнологий, конкурентных химическим средствам защиты растений [2]. В почвах, как и в других природных субстратах, находятся организмы -ингибиторы, которые в процессе своей жизнедеятельности подавляют рост и развитие высших и низших растений. Они образуют особые вещества, токсичные для растительных тканей. Исследования показывают, что микробы-ингибиторы своими токсинами могут оказывать отравляющее действие на растения в условиях их естественного произрастания в почве [3]. Они подавляют прорастание семян, рост проростков, развитие растений в целом, в значительной степени увеличивают поражение растений фитопатогенами различной этиологии и понижают их общий урожай. При массовом развитии эти организмы могут оказываться существенным фактором в определении плодородия почвы и урожайности сельскохозяйственных растений. Количество микроорганизмов, населяющих почву ризосферы растений, которые оказывают неблагоприятный эффект на растения, оценивается в 8-26% [4]. В ризосфере растений, в отличие от свободной почвы, доминируют грамотрицательные бактерии, причем преобладают флюоресцирующие бактерии рода псевдомонас [5]. Псевдомонады могут быть нейтральными во взаимодействии с растениями, многие оказывают отрицательное или положительное влияние на рост и развитие
различных сельскохозяйственных культур. Разнообразие биосинтетических и катаболических реакций, особенности генетической организации, в частности наличие плазмид, широкие возможности для генно-инженерного манипулирования позволяют рассматривать псевдомонады в качестве наиболее перспективных объектов агробиотехнологии. В настоящее время в биоконтроле широко используются бактерии, обладающие совокупностью полезных для растений свойств, которые принято обозначать как PGPR (от Plant Growth Promoting Rhizobacteria - ризо-бактерии, способствующие росту растений) [2]. Кроме того, в последнее время ведутся активные поиски биологических средств борьбы с сорными растениями, альтернативных традиционным химическим. Предполагается разработка таких препаратов на основе фитотоксичных бактерий, оказывающих негативное влияние на рост растений, так называемых DRB (от Deleterious Rhizobacteria - вредные ризобактерии) [4]. Необходимо отметить, что классификация ризобактерий на DRB и PGPR несколько условна и основана на их результирующем влиянии на рост растений в определенных условиях среды. Кроме того, ризобактерии можно определить и как DRB, и как PGPR, если выделяемые ими метаболиты действуют угнетающе одновременно и на рост растения, и на фитопатогены [3]. Целью настоящей работы являлось изучение способности ризосферных псевдомонад, изолированных из почв производственных полей, продуцировать фитотоксины, исследования по характеристике реакции линий, сортов и гибридов сахарной свеклы белорусской и зарубежной селекции, возделываемых на производственных площадях Республики Беларусь, на фитотоксины наиболее активных штаммов.
В работе были использованы сорта и гибриды сахарной свеклы отечественной и зарубежной селекции, а также изолированные ранее и в процессе выполнения исследований штаммы псевдомонад.
Источниками выделения штаммов служили:
- корнеплоды сахарной свеклы (теплица БОС ИГиЦ НАНБ, поле БОС ИГиЦ НАНБ, поле №1 и поле №2 - производственные посевы Опытно-научной станции НАНБ по сахарной свекле, г. Несвиж (предшественник - яровой ячмень);
- почва с производственных посевов сахарной свеклы ОНС НАНБ по сахарной свекле (поле №4);
- почва с производственных посевов озимой пшеницы ОНС НАНБ по сахарной свекле (поле №3);
- почва с участка поля ОНС НАНБ по сахарной свекле, неблагоприятного для возделыва-
[ и методы
ния с/х растений (поле №5).
Из всех указанных источников было выделено всего 59 штаммов флюоресцирующих псевдомонад, в том числе 3 штамма - из теплицы БОС, 7 штаммов - с поля БОС, 11 штаммов - с поля № 1; 26 - штаммов с поля №2; 6 штаммов - с поля №3; 4 штамма - с поля №4; 2 штамма - с поля №5.
Для выделения и селекции флюоресцирующих псевдомонад использовали среду Голда [6]. Первичная характеристика флюоресцирующих псевдомонад на способность продуцировать антиметаболиты проводили по описанной методике [7] с использованием в качестве индикаторной культуры Е.еоН В [8] .
Фитотоксичное действие псевдомонад на растения сахарной свеклы оценивали по влиянию бактериальных изолятов на всхожесть семян и развитие проростков [9, 10].
Результаты и обсуждение
В таблице 1 представлены результаты оценки отзывчивости сорта сахарной свеклы Белорусская 69 на инокуляцию семенного материала клетками штаммов флюоресцирующих псевдомонад, изолированных из различных почв. Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод о существенном уровне полиморфизма изолированных штаммов по признаку фито-токсичности. Как видно из данных, представленных в таблице 2, наибольшее количество штаммов, угнетающих развитие проростков сахарной свеклы, изолируется из производственных почв. Поскольку исследованные нами
штаммы выделялись, как правило, в осенний период и после уборки сельскохозяйственных культур, полученные нами данные согласуются с результатами исследований фитотоксичности различных сельскохозяйственных почв [11], в результате чего сделан вывод о том, что бактериальная фитотоксичность в большей степени характерна для почв, обедненных доступными формами углерода и с нерациональными севооборотами [12]. Результаты анализа полученных данных, представленные в таблице 3, подтверждают высокий уровень гетерогенности исследованных штаммов по характеру (см. стр. 28).
Таблица 1
Оценка влияния ризосферных псевдомонад на развитие проростков сахарной свеклы
сорта Белорусская 69
Источник выделения Штамм Всхожесть % от контроля Вес растения % от контроля Длина корня % от контроля
Теплица БОС ИГиЦ SB-1 90,6 90,7 88,0*
SB-2 93,6 100,0 87,9*
SB-3 95,3 94,0 94,9
Опытное поле БОС ИГиЦ SB-5 82,8* 99,8 89,3
SB-6 104,1 96,4 86,5*
SB-7 76,5* 90,2 87,8*
SB-8 85,9 92,9 85,6*
SB-13 95,3 92,9 91,1
SB-14 84,0* 103,4 79,4*
SB-25 65,6* 72,1* 88,0*
Поле №1, ОНС НАНБ по сахарной свекле, г. Несвиж SB-9 88,0 97,5 89,2*
SB-15 94,0 100,0 95,3
SB-16 86,6 98.2 114,4*
SB-17 87,3 94,9 102.5
SB-18 92,5 102,3 88,9*
SB-19 82,0* 101,8 82,9*
SB-20 101,5 101,1 88,9*
SB-21 91,1 106,8 100,3
SB-22 101,5 101,3 102,7
SB-23 84,2* 93,4 90,5
SB-24 94,0 102,9 96,1
Поле №2, ОНС НАНБ SB-10 74,6* 93,8 104,5
SB-26 87,3 87,5* 82,3*
SB-27 87,3 88,4* 102,7
SB-28 69,9* 74,9* 82,3*
SB-29 76,2* 100,0 89,3*
SB-30 92,0 95,9 109,2
SB-31 79,4* 97,7 103,0
SB-32 100,0 87,8* 123,2*
SB-33 82,5* 102,6 98,8
SB-34 95,6 95,3 108,7
SB-35 97,0 103,5 96,8
SB-36 90,5 97,1 94,5
SB-37 101,4 104.3 105.3
SB-38 91,1 93,9 97,2
SB-39 89,7 85,2* 96,3
SB-40 83,8* 95,1 95,9
SB-11 100,0 96,5 87,5*
SB-12 88,2 102,1 87,4*
SB-41 110,3 100,0 98,4
SB-42 117,0** 95,2 91,1
SB-43 98,3 97,3 97,1
SB-44 103,4 88,6 95,0
Продолжение таблицы 1
8Б-45 111,9 97,9 99,2
8Б-46 69,8* 77,1* 67,1*
8Б-47 89,8 93,7 103,7
8Б-48 101,6 97,4 86,4*
Поле №3 ОНС НАНБ 8Б-50 61,4* 89,0* 91,0
8Б-51 72,9* 90,1* 90,3
8Б-52 72,9* 97,8 88.8*
8Б-53 88,6 89,7* 92,2
8Б-54 81,4* 94,7 101,7
8Б-55 84,3 75,6* 91,5
Поле №4 ОНС НАНБ 8Б-56 82,8* 80,9* 86,6*
8Б-57 77,2* 93,8 86,2*
8Б-58 91,4 98,7 103,9
8Б-59 87,1 97,4 97,6
Поле №5 ОНС НАНБ 8Б-60 95,2 92,5 70,7*
8Б-61 84,2* 100,2 93,6
* отличие от контроля достоверно при Р(
Таблица 2
Структура популяции флюоресцирующих псевдомонад в ризосфере сахарной свеклы
Источник выделения штаммов Влияние штаммов на всхожесть растений Влияние штаммов на вес растений Влияние штаммов на длину корня растений
Нейтральное, % Отрицательное, % Положительное, % Нейтральное, % Отрицательное, % Положительное % Нейтральное, % Отрицательное, % Положительное, %
Теплица БОС 100,0 0,0 0,0 100,0 0,0 0,0 33,3 66,7 0,0
Поле БОС 42,9 57,1 0,0 85,7 14,3 0,0 28,6 71,4 0,0
Поле №1 ОНС 81,2 18,2 0,0 100,0 0,0 0,0 54,5 36,4 9,1
Поле №2 ОНС 69,2 26,9 3,8 76,9 23,1 0,0 65,4 26,9 7,7
Поле №3 ОНС 33,3 66,7 0,0 33,3 66,7 0,0 50,0 50,0 0,0
Поле №4 ОНС 50,0 50,0 0,0 75,0 25,0 0,0 50,0 50,0 0,0
Поле №5 ОНС 50,0 50,0 0,0 100,0 0,0 0,0 50,0 50,0 0,0
Таблица 3
Характеристика 38 штаммов ризосферных псевдомонад, угнетающих развитие
проростков сахарной свеклы
Ростовые показатели Количество штаммов, действующих на ростовые показатели
абс. %
Всхожесть 7 18,4
Вес проростка 4 10,5
Длина корня 10 26,3
Вес проростка + длина корня 2 5,3
Всхожесть + длина корня 8 21,1
Всхожесть + вес проростка 1 2,6
Всхожесть + вес проростка + длина корня 6 15,8
проявляемой фитотоксичности. Значительное количество штаммов наряду с угнетением прорастания, снижением веса проростков и длины корневой системы оказывают негативный эффект на все исследованные показатели физиологического состояния культуры сахарной свеклы сорта Белорусский 69.
Для изучения специфичности негативного эффекта фитотоксичных псевдомонад при воздействии на различный генетический материал сахарной свеклы были проведены исследования отзывчивости четырех сортов отечественной селекции на инокуляцию двумя из наиболее активных штаммов. Как видно из результатов, представленных в таблице 4,
существенное снижение всхожести семян Белорусская 69 и Несвижского гибрида коррелировало со снижением как веса проростков, так и длины корневой системы. При этом необходимо отметить и существенную активацию семенной популяции фитопатогенов. Таким образом, при взаимодействии растений сахарной свеклы с фитотоксичными почвенными пседомонадами уровень и характер негативного эффекта зависит как от генотипа растений, так и от свойств отдельных бактериальных штаммов, что подтверждает сделанные ранее выводы [13,14]. Приведенные выше данные и сделанные выводы подтверждаются и данными, представленными в таблице 5.
Таблица 4
Сорта сахарной свеклы Всхожесть, % от контроля Вес проростка, % от контроля Длина корня, % от контроля Увеличение заболеваемости проростков, %
Белорусская-69 63,8* 77,5* 65,4* 51,2
Несвижский гибрид 60,0* 65,0* 58,2* 51,3
Ганусовская-55 93,1 72,6* 66,2* 54,9
А-9541 100,0 89,3* 89.6* 26,6
*отличие от контроля достоверно при Р
Влияние штамма Pseudomonas sp.SB-46 на развитие проростков сахарной свеклы
сортов отечественной селекции
Таблица 5
Влияние штамма Pseudomonas sp.SB-28 на развитие проростков сахарной свеклы
сортов отечественной селекции
Сорта сахарной свеклы Всхожесть, % от контроля Вес проростка, % от контроля Длина корня, % от контроля Увеличение заболеваемости проростков, %
Белорусская-69 94,0 101,4 98,9 0,5
Несвижский гибрид 71,1* 74,0* 73,9* 46,4
Ганусовская-55 91,9 73,4* 101,7 24,7
А-9541 93,4 98,6 96,6 15,1
*отличие от контроля достоверно при Р
Сравнение результатов исследования штаммов 8Б-46 и 8Б-28, изолированных из различных почв, позволяет сделать вывод о том, что характер их негативного влияния на растения сахарной свеклы в значительной степени зависит от генетических особенностей изучаемых сортов и гибридов, и генетический материал поздней селекции менее отзывчив к воздействию бактериальных фитотоксинов.
Основные производственные площади посевов сахарной свеклы в Республике занимают гибриды зарубежной селекции. В связи с этим нами был проведен анализ отзывчивости генетического материала, в наибольшем объеме представленном в посевах в сезон 2007 - 2008 годов в свекловодческих хозяйствах. Семена сахарной свеклы дражи-рованы компаниями-изготовителями защитным фунгицидно-инсектицидным составом, не обладающим в тоже время бактерицидной активностью. Сравнение результатов, представленных в таблицах 6 и 7, позволяет сделать вывод о том, что оба исследованных бактериальных штамма, 8Б-28 и 8Б-46, в той или иной мере негативно влияют на посевной материал и развитие проростков исследованных гибридов. Наибольшей устойчивостью к штамму 8Б-28 отличались гибриды Борута и Кристалл, у последнего наблюдалось некоторое снижение показателя всхожести. Штамм 8Б-28 практически не влиял на проявление семенной инфекции, что при сравнении с данными, представленными в таблице 7, возможно объяснить определенным супрессивным потенциалом этого штамма по отношению к фитопатогенам. Как видно из результатов,
представленных в таблице 7, штамм 8Б-46 негативно влиял на физиологическое состояние практически всех исследованных гибридов. Существенное увеличение заболеваемости проростков объясняется, очевидно, как угнетающим эффектом фитотоксинов, так и незначительным антагонистическим потенциалом штамма 8Б-46. Очевидно, можно сделать вывод о том, что негативное влияние фитотоксичных псевдомонад приведет к заметному снижению продуктивности отдельных гибридов в производственных посевах. Таким образом, целесообразно в дальнейшем проведение подобных исследований с другими гибридами и сортами сахарной свеклы, представленными на семенном рынке Республики Беларусь.
Определенная степень зависимости отзывчивости на бактериальные фитотоксины от генотипа сахарной свеклы очевидна из результатов исследований, представленных в таблицах 8 и 9. При оценке воздействие штамма 8Б-46 на гибрид отечественной селекции А-9896 и его родительские линии показано, что родительская линия ММ чувствительна к влиянию фи-тотоксинов, что привело к значительному снижению веса растений (на 22%) и длины корня (на 18%). Второй родительский компонент МС был невосприимчив к действию данного штамма. Вместе с тем, инокуляция штаммом 8Б-28 приводила к угнетению корневой системы проростков данного генотипа. Для гибрида А-9896 показано достоверное снижение веса растений (на 27%), длина корня статистически не отличалась от контроля. При этом, как и в случае гибридов зарубежной селекции, существенно увеличивалась заболеваемость проростков всех
трех генотипов. Полученные данные подтверж- и генотипа растительного материала в уровне дают роль как специфичности фитотоксичных устойчивости/толерантности к бактериальным бактерий во взаимодействии с растениями, так фитотоксинам.
Таблица 6
Влияние штамма Pseudomonas sp.SB-28 на развитие проростков сахарной свеклы
сортов зарубежной селекции
Сорта сахарной свеклы Всхожесть, % от контроля Вес проростка, % от контроля Длина корня, % от контроля Увеличение заболеваемости проростков, %
Борута 89,8 97,9 111,9 1,9
Казино 95,3 78,8* 74,2* 36,3
Кристалл 78,8* 94,1 102,8 8,0
Марс 101,7 94,1 75,3* 13,0
Твинго 93,4 98,6 85,8* 6,1
Кассандра 88,0 88,4 74,2* 4,1
*отличие от контроля достоверно при Р
Таблица 7
Влияние штамма Pseudomonas sp.SB-46 на развитие проростков сахарной свеклы
сортов зарубежной селекции
Сорта сахарной свеклы Всхожесть, % от контроля Вес проростка, % от контроля Длина корня, % от контроля Увеличение заболеваемости проростков, %
Борута 89,4 78,7* 72,6* 35,2
Казино 71,6* 63,9* 65,7* 33,7
Кристалл 89,4 84,5* 83,2* 47,2
Марс 96,4 95,1 88,4* 27,0
Твинго 75,0* 91,4 81,2* 26,5
Кассандра 94,4 88,2 93,4 36,6
*отличие от контроля достоверно при Р
Таблица 8
Влияние штамма Pseudomonas sp.SB-28 на развитие проростков гибрида сахарной свеклы А9896 и его исходных родительских форм
Сорта сахарной свеклы Всхожесть, % от контроля Вес проростка, % от контроля Длина корня, % от контроля Увеличение заболеваемости проростков, %
ММ-компонент 66,1 85,0* 87,3 15,6
МС-компонент 92,3 100,1 87,5* 0,6
Гибрид А9896 100,0 86,2* 88,5* 15,2
*отличие от контроля достоверно при Р
Таблица 9
Влияние штамма Pseudomonas sp.SB-46 на развитие проростков гибрида сахарной свеклы А9896 и его исходных родительских форм
Сорта сахарной свеклы Всхожесть, % от контроля Вес проростка, % от контроля Длина корня, % от контроля Увеличение заболеваемости проростков, %
ММ-компонент 94,5 71,3* 75,0* 39,2
МС-компонент 101,8 93,7 100,1 36,8
Гибрид А9896 109,2 83,7* 90,8 23,8
*отличие от контроля достоверно при Р0 05
Заключение
В структуре популяции псевдомонад с производственных посевов от 27 до 38% выделенных штаммов оказывают отрицательное влияние на всхожесть растений сахарной свеклы сорта Белорусская-69, 23% снижают вес проростков, от 26 до 36% уменьшают длину корней. Обнаружены штаммы, стимулирующие рост проростков (от 4 до 9%). Остальные штаммы флюоресцирующих псевдомонад не оказывали воздействия на развитие растений сахарной свеклы.
Изучалось влияние активных штаммов токсинобразующих псевдомонад на развитие проростков сахарной свеклы отечественной и зарубежной селекции в гнотобиотической системе. Из выделенных штаммов ризос-ферных псевдомонад отобраны два с наиболее выраженным токсичным эффектом: Pseudomonas sp. SB-46 и SB-28. Показано, что штамм SB-46 угнетает развитие растений сортов сахарной свеклы Белорусская-69, Га-нусовская-55, Несвижский гибрид, А-9541, что проявляется в снижении всхожести (от 60 до 93% от контроля), уменьшении длины корня (от 64 до 89%) и веса 7-дневных проростков у всех указанных сортов.
При исследовании отзывчивости 6 сортов зарубежной селекции (Борута, Кристалл, Казино, Марс, Твинго, Кассандра) к фитоток-синам штамма ББ-46 установлено, что наиболее устойчивым является сорт Кассандра. Для сортов Твинго и Марс отмечено снижение длины корня (на 19 и 12% соответственно). У сортов Борута, Казино, Кристалл обнаружено влияние штамма как на длину корня (от 65 до 83% от контроля), так и на вес растения (от 63 до 84% от контроля). Для гибрида А-9896 показано достоверное снижение веса растений (на 27%), длина корня статистически не отличалась от контроля. Родительская линия ММ оказалась чувствительна к влиянию фи-тотоксинов, что привело к значительному снижению веса растений (на 22%) и длины корня (на 18%). Второй родительский компонент МС был невосприимчив к штамму ББ-46.
Использование активных штаммов фитоток-сичных псевдомонад позволяет оценить признак устойчивости генетического материала на ранних этапах селекционного процесса. Полученные результаты могут быть использованы в оптимизации агротехники возделывания сахарной свеклы.
Список использованных источников
1. Красильников, Н.А. Микроорганизмы почвы и высшие растения / Н.А. Красильников. - М.: Издательство АН СССР, 1958. -С. 338-352.
2. Schroth, M.N. Disease - Suppressive Soil and Root-Colonizing Bacteria / M.N. Schroth, J.G. Hancock // Science. - 1982. - Vol. 216. -
P. 1376-1381.
3. Cherrington, C.A. Incidence of inhibitory pseudomonads in the Pacific Northwest / C.A. Cherrington, L.F.Elliott // Plant Soil. -1987. - Vol. 101.- P. 159-165.
4. Nehl, D.B. Deleterious rhizosphere bacteria: an integrating perspective / D.B. Nehl,
S.J. Allen, J.F.Brown // Appl. Soil Ecol. - 1996. -Vol. 5. - P. 1-20.
5. Смирнов, В.В. Бактерии рода Pseudomonas / В.В Смирнов, Е.А. Киприанова. -Киев: Навукова думка. - 1990. - 438 с.
6. Gould, W.D. New selective media for enumeration and recovery of fluorescent pseudomonads from various habitats / W.D. Gould, C. Hagedorn, T.R.Bardinelli, R.M. Zablotowicz // Appl. Environ. Microbiol. -1985. - Vol. 49. - P. 28-32.
7. Gasson, M.J. Indicator technique for antimetabolite toxin production by phytopathogenic species of Pseudomonas / M.J Gasson // Appl. Environ. Microbiol. - 1980. - Vol. 29. - P. 433-440.
8. Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory Manual 2nd ed. / J. Sambrook, E.F Fritsch, T. Maniatis // N.Y. Cold Spring Harbor Lab. Press. - 1989. - 489 p.
9. Elliott, L.F. Plant growth-inhibitory pseudomonads colonizing of winter wheat (Triticum aestivum L.) roots / L.F Elliott, J.M Lynch // Plant Soil. - 1985. - Vol. 84. - P. 57-65.
10. Vaan de Geijn , Siebe C. A fast screening method for bacterial isolates producing substances affecting root-growth / Siebe C. Vaan de Geijn, Jose MM. Van Maaren. // Symbiosis. - 1986. -Vol. 2. - P. 67-75.
11. Schippers, B. Integration of deleterious and beneficial rhizosphere microorganisms and the affect of cropping practices / B. Schippers, A.W.Bakker, A.H.M.B. Peter // Ann. Rev. Phy-topathol. - 1987. - Vol. 25. - P. 331-358.
12. Suslow, T.V. Role of deleterious rhizo-bacteria as minor pathogens in reducing crop growth / T.V. Suslow, M.N. Schroth // Phytopathology. - 1982. - Vol. 72. - P. 111-115.
13. Howie, W.J. Rhizobacteria: influence of cultural and soil type on plant growth and yield of potato / W.J.Howie, E.Echandi // Soil Biology and Biochemistry. - 1983. - Vol. 15. -P. 127-132.
14. Kennedy, A.C. Suppressive to the weed-downy brome / A.C.Kennedy, L.F. Elliott, F.L. Young, C.L. Douglas // Soil Science Society of American Journal. - 1991. - Vol. 55. - P. 722-727.
