CC BY
58
УДК: 576.852.24: 599.323.4: 612.112.3
ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДОВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ РОДА LACTOBACILLUS НА ФАГОЦИТАРНУЮ АКТИВНОСТЬ МАКРОФАГОВ
БЕЛЫХ МЫШЕЙ
© 2011 М.И. Правдивцева1, Е.А. Горельникова1, О.В Абросимова2, Л.В Карпунина1
1 Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова, Саратов 2 Саратовский государственный технический университет, Саратов
Поступила 03.02.2011
Показано влияние экзополисахаридов молочнокислых бактерий - лаксаранов 1596, 1936, Z, выделенных из культур Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii ssp. bulgaricus, на фагоцитарную активность альвеолярных и перитонеальных макрофагов мышей. Установлено, что наибольшее стимулирующее воздействие на перигонеальные и альвеолярные макрофаги оказывает лаксаран Z. Ключевые слова: экзополисахариды молочнокислых бактерий, альвеолярные и перигонеальные макрофаги, индекс активации киллинга, индекс завершенности фагоцитоза.
Рядом исследователей показано, что экзополисахариды (ЭПС) бактерий, являясь важнейшими компонентами клеток, обладают антионкологическими, противовирусными, иммуномодулирующи-ми свойствами [7-9]. Сведения по влиянию ЭПС молочнокислых бактерий на процесс фагоцитоза в макрофагах животных практически отсутствуют [5, 6]. В связи с этим целью данной работы явилось изучение влияния экзополисахаридов молочнокислых бактерий рода Lactobacillus на активность макрофагов мышей в процессе фагоцитоза in vitro стафилококков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали экзополисахариды молочнокислых бактерий - лаксараны 1596, 1936, Z, которые были выделены нами ранее из Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii ssp. bulgaricus по методу [3].
Лаксараны в концентрации 0,006 г/мл вводили белым мышам (самцы, возраст 2-3 месяца, масса 20 - 22 грамма) по 0,2 мл внутрибрюшинно. Через 1, 3, 5 и 7 суток после иммунизации выделяли альвеолярные (АМФ) и перигонеальные (ПМФ) макрофаги по общепринятым методикам [2]. Животных умерщвляли транслокацией шейных позвонков. При моделировании in vitro процесса фагоцитоза использовали суточную культуру S. aureus 209-Р, полученную из музея микроорганизмов кафедры микробиологии и физиологии растений Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского. Бактериальные клетки добавляли во взвесь макрофагов в соотношении 50:1 и инкубировали при 37 С. Активность макрофагов на
Правдивцева Мария Ивановна, асп., e-mail: prav-85@rambler.ru; Горельникова Елена Александровна, к.б.н., ст. преподаватель, e-mail: novela@mail.ru; Абросимова Ольга Владимировна, к.б.н., доц., e-mail: Olga Abrosimova@gmail.com; Карпунина Лидия Владимировна, д.б.н., проф., e-mail: karpuninal@mail.ru
разных стадиях фагоцитоза оценивали через 30 минут, 1 и 6 часов инкубации. Фагоцитарный индекс (ФИ), индекс завершённости фагоцитоза (ИЗФ) и индекс активации киллинга (ИАК) определяли по [2]. Статистическую обработку результатов проводили методами вариационной статистики с применением t- критерия Стьюдента [1].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В процессе исследований было показано, что у контрольной группы мышей, которым не вводили внутрибрюшинно ЭПС бактерий активность АМФ в процессе фагоцитоза S. aureus 209-Р через 30 минут, 1 час и 6 часов составила 8, 19 и 24% соответственно. Значения ИЗФ (-0,26) свидетельствовали о не завершённости фагоцитарного процесса (табл.1). Наибольшая активность ПМФ контрольной группы мышей была отмечена через 1 час фагоцитоза бактерий и составляла 25%, а к 6 часам количество активных ПМФ снижалось до 9%, при этом ИЗФ был равен 0,64, что позволило говорить о частичном переваривании микробных клеток (табл. 1).
В опытной группе животных, которым вводили лаксаран 1596, было обнаружено изменение активности макрофагов. Через 1 и 3 суток эксперимента активность АМФ была максимальной через 1 час фагоцитоза in vitro бактерий и составила 72 и 81% соответственно, что было достоверно выше контроля (табл. 1). Значения ИАК составили 0,85 и 0,52 соответственно, что было выше, чем в контроле. Данные ИЗФ свидетельствовали о частичном переваривании микробных клеток. На 5 и 7 сутки эксперимента максимальная активность АМФ отмечена на начальных этапах фагоцитоза (через 30 минут), а значения ИАК (-0,11 и - 0,09) были ниже контрольных показателей, что свидетельствовало о снижении фагоцитарной активности на завершающих этапах фагоцитоза.
Активность ПМФ в опытной группе животных на 1 сутки эксперимента через 30 минут, 1 час и 6 часов процесса фагоцитоза S. aureus 209-Р составляла 43%, 47% и 46%, что достоверно выше кон-
Проблемы прикладной экологии
трольных значений. На 3 сутки после введения лак-сарана 1596 наибольшая активность ПМФ отмечена через 6 часов процесса фагоцитоза S. aureus 209-Р. На 5 сутки эксперимента активность ПМФ у белых мышей была на всех этапах процесса фагоцитоза достоверно выше контрольных значений. Максимальная активность зафиксирована через 1
час процесса фагоцитоза. Наибольшая активность ПМФ отмечена на 7 сутки через 30 минут от начала фагоцитоза бактериальных клеток, процесс фагоцитоза был не завершен (табл. 1). Скорость фагоцитоза во все сроки исследования была ниже, чем у контрольных макрофагов, ИАК имел отрицательные значения.
Таблица 1. Влияние лаксарана 1596 на альвеолярные и иеритонеальные макрофаги в процессе фагоцитоза S. aureus 209-Р
Время иммуногенеза Макрофаги с S. aureus 209- Р
30 минут 1ч 6ч
контроль (без ЭПС) АМФ 8,00±0Д5 19,00±1,22 24,13±2,13
ПМФ 6,00±0Д8 25,13±2,00 9,51±1,00
АМФ 63,11±4,21* 72,12±5,21* 29,23±2,21
1 сутки ПМФ 43,23±4Д 1* 47,51±3,53" 46,31±3,0*
АМФ 72,31±5,13* 81,13±6,0* 60,24±5,0*
3 сутки ПМФ 13,32±1,02* 8,00±0,43* 35,41±3,1*
АМФ 43,25±4,31* 27,60±2,21 37,32±3,41
5 сутки ПМФ 52,11±4Д5* 78,13±5,22* 46,22±4,2*
АМФ 46,22±4,21* 20,11±2,21 27,41±2,31
7 сутки ПМФ 43,13±4,11* 13,23±1,23 5,31±0,53*
Примечание: * - достоверные различия по сравнению с контролем при р<0,05.
Таблица 2. Влияние лаксарана 1936 на иеритонеальные и альвеолярные макрофаги в процессе фагоцитоза S. aureus 209-Р
Время иммуногенеза Макрофаги с S. aureus 209- Р
30 минут 1ч 6ч
контроль (без ЭПС) АМФ 8,00±0,15 19,00±1,22 24,13±2,13
ПМФ 6,00±0,18 25,13±2,00 9,51±1,00
1 сутки АМФ 24,21±2,51* 28,32±3,52 40,32±4,51*
ПМФ 48,32±3,54* 32,41±4,00" 34,41±4,00"
3 сутки АМФ 72,14±5,00" 58,42±3,21* 37,26±1,01*
ПМФ 50,31±4,52* 32,34±2,13" 30,41±2,00"
5 сутки АМФ 39,14±2,00" 10,11±1,00 7,21±0,41*
ПМФ 11,22±1,51 42,61±3,21* 6,00±0,34
7 сутки АМФ 25,31±2,52* 12,43±0,14 18,12±1,25
ПМФ 11,24±1,04 28,91±2,41 15,21±1,22
Примечание: * - достоверные различия по сравнению с контролем при р<0,05.
Таблица 3. Влияние лаксарана Z на альвеолярные и перитонеальные макрофаги в процесса фагоцитоза S. aureus 209-Р
Срок иммуногенеза Макрофаги Фагоцитарный индекс, (М±т) в %
с S. aureus 209- Р
30 минут 1ч 6ч
контроль (без ЭПС) АМФ 8,00±0,15 19,00±1,22 24,13±2,13
ПМФ 6,00±0,18 25,13±2,00 9,51±1,00
1 сутки АМФ 47,12±4,11* 19,31±2,44 13,15±2,36
ПМФ 41,21±4,21* 15,42±1,26 17,23±2,34
3 сутки АМФ 41,33±4,13* 18,14±1,30 12,41±2,00
ПМФ 81,34±6,21* 62,41±5,01* 30,22±2,13*
5 сутки АМФ 80,43±6,14* 31,46±2,31 19,16±2,41
ПМФ 70,21±5,21* 42,31±3,00 41,32±3,42*
7 сутки АМФ 22,43±2,11* 10,42±0,14 5,21±0,21*
ПМФ 31,47±3,25* 28,34±2,17 18,44±1,18*
Примечание: * - достоверные различия по сравнению с контролем при р<0,05.
При изучении активности макрофагов, выделенных от животных, которым вводили лаксаран 1936 в концентрации 0,006 г/мл, показано, что на 1 сутки эксперимента к 6 часам фагоцитоза активность АМФ была равна 40%, что в 1,6 раз выше контрольных значений, процесс фагоцитоза был не завершён (табл. 2). На 3, 5 и 7 сутки наибольшая активность АМФ наблюдалась через 30 минут фагоцитоза S. aureus 209-Р. ИЗФ на 3 и 5 сутки иммуногенеза после введения животным лаксарана 1936
был равен 0,3, что позволило говорить о частичном переваривании микробных клеток. На 7 сутки ИЗФ имел отрицательные значения и процесс фагоцитоза был незавершённым. ИАК для АМФ у мышей, которым вводили лаксаран 1936, на 1 и 7 сутки имел отрицательные значения -0,16 и -0,24, соответственно. Скорость фагоцитоза S. aureus 209-Р была ниже контрольных значений, в отличие от 3 и 5 суток эксперимента, когда ИАК был выше контроля и равен 0,62 и 0,56, соответственно. Актив-
ность ПМФ у мышей на 1 и 3 сутки достигла максимума через 30 минут процесса фагоцитоза S. aureus 209-Р, процесс фагоцитоза был не завершенным (-0,06 и 0,06). На 5 и 7 сутки через 1 час содержание ПМФ составляло 42% и 28%, соответственно и наблюдалось частичное переваривание микробных клеток также как и в контроле. ИЗФ был равен 0,85 и 0,46. ИАК имел отрицательные значения на 1, 3 и 7 сутки. На 5 сутки скорость фагоцитоза была выше, чем в контроле в 1,3 раза (ИАК равен 0,21).
При введении животным лаксарана Z максимальное число активных АМФ во все сроки исследований наблюдалось через 30 минут фагоцитоза S. aureus 209-Р, к 6 часам фагоцитоза S. aureus 209-Р количество активных АМФ снижалось, что говорило о частичном переваривании микробных клеток. Было отмечено, что активность ПМФ у белых мышей этой группы была максимальной через 30 минут фагоцитоза S. aureus 209-Р во все сроки исследований (табл. 3). ИЗФ на 1 сутки эксперимента имел отрицательные значения, фагоцитоз был не завершён. На 3, 5 и 7 сутки наблюдали частичное переваривание микробных клеток. По оценке активации киллинга показано, что скорость фагоцитоза АМФ была выше, чем ПМФ.
Таким образом, как показали экспериментальные данные, лаксараны 1596, 1936 и Z оказывают влияние на активность макрофагов при фагоцитозе S. aureus 209-Р. Как видно из полученных результатов наибольшее воздействие на макрофаги оказывал лаксаран Z. Он приводил к увеличению числа активных макрофагов, как альвеолярных, так и перитонеальных, способствовал увеличению переваривания микробных клеток и повышению индекса активации киллинга. Ранее было показано [4], что лаксаран Z оказывает влияние на продукцию провосполительных цитокинов (ИЛ-1а, ФНО-а) в сыворотке крови мышей при стафилококковой ин-
фекции. Вполне возможно предположить, что лаксаран Z влияет на активность макрофагов через стимуляцию продукции цитокинов и тем самым приводит к увеличению поглотительной функции макрофагов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Зайцев Т.Н. Математический анализ биологических данных. М.: Наука, 1991. 268 с.
2. Кондратьева И.А., Самушова В.Д. Практикум по иммунологии. М.: МГУ, 2001. 173 с.
3. Полукарое Е.В., Карпунина Л.В., Жемеричкин Д.А. Выделение экзополисахаридов Lactobacillus delbrueckii subsp ssp. bulgaricus при различных условиях культивирования // Вест. Сарат. гос. агр. ун-та. 2009. № 4. С. 2023.
4. Полукарое Е.В. Экзополисахариды молочнокислых бактерий и их функциональная значимость в организме животных: Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. Саратов, 2009. 22 с.
5. Chabot S., YuH., Leseleuc L. et. al. Exopolysaccharide from
Lactobacillus rhamnosus RW-9595M stimulate TNF, IL-6 and IL-12 in human and mouse cultured inmunocompetent cells, and IFN-g in mouse splenocytes // Lait. 2001. № 81. P. 683-697.
6. Kitazawa H., Roberts R., Dabour N. et al. Induction of IFN-
gamma and IL-l-a production in macrophages stimulates with phosphopolysaccharide produced by Lactococcus lactis ssp. cremoris II Int. J. Food Microbiol. 1996. № 31. P. 99106.
7. Makino S., Ikegami S., Капо H. Immunomodulatory Effects
of Polysaccharides Produced by Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus OLL1073R-1 // J. Dairy Sci. 2006. № 89. P. 2873-2881.
8. Nishimura-Uemura J., Kleerebezem E., Sralowska B. Func-
tional alteration of murine macrophages stimulated with extracellular polysaccharides from Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus OLL1073R-1 // Food Microbiology. 2003. № 20. P. 267-273.
9. Vinderola G., Perdigona A., Duarlec J. Effects of the oral administration of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus kefiranofaciens on the gut mucosal immunity // Cytokine. 2006. № 36. P. 254-260.
ASSESSING THE EXOPOLYSACCHARIDES BY LACTIC ACID BACTERIA OF THE GENUS LACTOBACCIL US ON THE PHAGOCYTIC ACTIVITY OF MACROPHAGES OF WHITE MICE
© 2011 M.I. Pravdivtseva1, E.A. Gorelnikova1, O.V. Abrosimova2, L.V. Karpunina1
Saratov State Agrarian University in honor of N.I. Vavilov, Saratov 2 Saratov State Technical University, Saratov
Shows the effect of exopolysaccharides of lactic acid bacteria - laksarans 1596, 1936, Z, isolated from cultures of Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii B-l596, L. delbrueckii B-l936 and L. delbrueckii ssp. bulgaricus, on the phagocytic activity of alveolar and peritoneal macrophages of mice. Set, that greatest stimulating influence on peritoneal and alveolar macrophages has laksaran Z.
Key words', exopolysaccharides lactic acid bacteria, alveolar and peritoneal macrophages, activation code killing, index of completeness of phagocytosis.
PravdivtsevaMariya Ivanovna, Post-graduate Student, E-mail: Prav-85@rambler.ru; 1 Gorelnikova Elena Aleksandrovna, Saratov State Agrarian University in honor of N.I. Vavilov, Eldest Teacher, Candidate of Biology. Sciences. E-mail: novela@mail.ru;
2Abrosimova Olga Vladimirovna,Fvofessov, Candidate of Biology. Sciences, e-mail: 01gaAbrosimova@gmail.com; 1 Karpunina Lidiya Vladimirovna, Professor, Doctor of. Biology. Sciences, e-mail: karpuninal@mail.ru
