CC BY
26
DOI: 10.24411/2074-5036-2019-10033 УДК 57.047
Ключевые слова: Candida maltosa, иммунный статус, титр антител Keywords: Candida maltosa, immune status, antibody titer
Рустамов Р. Д., Трофимов О. В., Пак И. В.
ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ДРОЖЖЕВОЙ ДОБАВКИ НА ПОКАЗАТЕЛИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО СТАТУСА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
ASSESSING THE INFLUENCE OF YEAST ADDITIVE ON THE IMMUNOLOGICAL STATUS PARAMETERS OF FARM ANIMALS
ФГАОУ Тюменский государственный университет Адрес: 625003, г. Тюмень, ул. Володарского, 6
Tyumen State University Address: 625003, Tyumen, Volodarsky street, 6
Рустамов Ризван Дилман оглы, аспирант, E-mail: [email protected]. Тел.: 8 (3452) 597400 (доб. 16622)
Rustamov Rizvan Dilman oglu, Post-graduate student E-mail: [email protected]. Tel.: 8 (3452) 597400 (ext. 16622) Трофимов Олег Владимирович, кандидат биологических наук, доцент кафедры экологии и генетики
E-mail: [email protected]. Тел.: 8 (3452) 597400 (доб. 16612) Trofimov Oleg Vladimirovich, PhD in Biological Sciences, Associate professor of the Department of Ecology
and Genetics. E-mail: [email protected]. Tel.: 8 (3452) 597400 (ext. 16612) Пак Ирина Владимировна, доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой экологии и генетики
E-mail: [email protected]. Тел.: Тел.: 8 (3452) 597400 (доб. 16604) Pak Irina Vladimirovna, Doctor of Biological Sciences, Professor, Head Department of Ecology and Genetics E-mail:[email protected]. Tel.: 8 (3452) 597400 (ext. 16604)
Аннотация. Цель работы заключалась в оценке влияния дрожжевых добавок Candida maltosa ВСБ-829 и Candida maltosa Тм-12 на показатели иммунного статуса сельскохозяйственных животных. Дрожжевую биомассу получали с использованием метода культивирования микроорганизмов в биоферментере «BioFlo 115» по отработанной нами технологии с последующим центрифугированием и высушиванием в лиофили-заторе FreeZone 2.5. Полученную биомассу добавляли в рацион питания опытных животных в количестве 1,5 % цыплятам-бройлерам (кросс Арбор Айкерс) и 2,0 % телятам. Оценку влияния дрожжевых добавок на показатели иммунитета проводили на основе определения общего содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови по методу Бредфорда и с использованием электрофореза по Лэммли. Титры антител определяли методом иммуноферментного анализа. Было показано, что кормовые добавки на основе дрожжей Candida maltosa положительно влияют на иммунный статус цыплят-бройлеров и телят. Во всех опытных группах наблюдается увеличение содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови. Выявлено при использовании дрожжевой добавки увеличение титра антител у вакцинированных цыплят против вирусов Ньюкаслской болезни и инфекционного бронхита кур.
Summary. The study is intended to assess the influence of the yeast additives Candida maltosa VSB-829 and Candida maltosa Tm-12 on the immune status parameters of farm animals. The yeast biomass was generated using a method of cultivation of microorganisms in the "BioFlo 115" biofermentor according to the technology developed by us, followed by centrifugation and drying out in the "FreeZone 2.5" lyophilizer. The obtained biomass was added to the diet of the test animals in the amount of 1.5 % of the total feed volume for broiler chickens (cross Arbor Ikers) and 2.0 % of the total feed volume for calves. The impact of the yeast supplements on the parameters of immunity was assessed with measuring the total content of immunoglobulins in the blood serum by the Bradford method and using Laemmli electrophoresis method. Antibody titers were measured with enzyme-immunoassay (ELISA method). The study revealed the positive effect of the Candida maltosa based yeast additives on the immune status of broiler chickens and calves. An increase in the content of immunoglobulins in the blood serum was observed in all experimental groups. An increase in antibody titer against viruses of Newcastle disease and avian infectious bronchitis was detected in vaccinated chickens when using the yeast additives.
Введение
В настоящее время активное развитие сельского хозяйства во многом связано с использованием современных наукоемких технологий. Одним из таких направлений является биотехнологическое производство. С помощью методов биотехнологии можно решить проблему сбалансированного питания и иммунологической резистентности животных. Основываясь на этом подходе, актуальными остаются исследования влияния микробных добавок на продуктивность и устойчивость животных [1].
Помимо источников биологически активных веществ (белков, аминокислот, витаминов и др.) микроорганизмы могут выступать в роли пробиотических препаратов [2, 6].
В настоящее время пробиотики нашли свое применение в качестве иммуностимулирующих препаратов. Объясняется это тем, что пробиотики обладают способностью стимулировать лимфатическую систему кишечника. Стимуляция последней приводит к активации мукозного иммунитета за счет усиления активности клеток неспецифического иммунитета и синтеза иммуноглобулинов [3, 4, 5]. Пробиотики обеспечивают также более полное усвоение кормов за счет синтеза экзогенных ферментов.
В последнее время в животноводстве большое внимание уделяется изучению роли пробиотиков на основе бактерий, тогда как роль дрожжей как возможных пробиотиче-ских препаратов остается недостаточно изученной, что делает исследования в этом направлении актуальными.
Цель исследований. Целью настоящей работы явилось изучение влияния дрожжевой добавки Candida maltosa на показатели иммунитета цыплят-бройлеров и телят.
Материалы и методы
Исследование проводили на базе лаборатории биотехнологии и генодиагностики Тюменского государственного университета в 2015-2017 гг.
В работе использовали дрожжевые добавки на основе двух штаммов дрожжей Candida maltosa ВСБ-829 (по ВКПМ Y-2043) и Candida maltosa Тм-12 (по ВКПМ
20
Y-612), которые были приобретены во ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика». Биомассу дрожжей получали культивированием в жидких питательных средах с уровнем рН 6,5, содержащих 1 % пептона, 2 % D-глюкозы и 0,5 % дрожжевого экстракта. Условия культивирования микроорганизмов были определены в ходе экспериментальных работ по подбору оптимального состава питательной среды (путем испытания 8 вариантов сред) и выбора оптимального уровня рН среды. После предварительного автоклавирования и добавления антибиотика хлорамфеникола в питательную среду, проводили пересев колоний дрожжей из чашек Петри.
Препаративные количества дрожжевой добавки получали в биоферментере методом прерывистого культивирования. Наработанную клеточную суспензию концентрировали методом последовательного центрифугирования при 2000 g в течение 5 мин. Осажденную биомассу высушивали в лиофилизаторе FreeZone 2.5 (фирмы <^аЬсопсо»). Испытания полученных кормовых добавок проводили на цыплятах-бройлерах (кросс Арбор Айкерс) и телятах.
Исследование на цыплятах-бройлерах проводилось в лаборатории Центра биотехнологии и генодиагностики. При этом были сформированы группы опытных цыплят-бройлеров и контрольная группа, в возрасте 14 суток. Кормление цыплят с включением дрожжевой добавки в количестве 1,5 % от общего объема стандартного суточного рациона проводили в течение 40 суток. В корм контрольной группы дрожжевая добавка не включалась.
На 20-ые сутки кормления проводили вакцинирование 50 % цыплят-бройлеров из каждой группы инактивированной комплексной вакциной «АВИВАК», которая содержала в себе антигены Ньюкаслской болезни (НБ), инфекционного бронхита кур (ИБК), реовирусной инфекции (РЕО) и инфекционной бурсальной болезни (ИББ). Невакцинированные цыплята служили дополнительным контролем. В конце опыта проводили взятие сыворотки крови у испытуемых цыплят.
Параллельно проводилось испытание кормовых добавок на телятах. Кормление телят дрожжевыми добавками проводилось в ЗАО «Агрофирма Луговская». При этом были сформированы 3 группы испытуемых животных: две опытные группы, получавшие дрожжевую добавку (в количестве 2 % от общего объема суточного рациона) Candida maltosa ВСБ-829 (группа ВСБ-829) и Candida maltosa Тм-12 (группа Тм-12), и одна контрольная группа, не получавшая в составе корма дрожжевую добавку. Каждая группа включала по 10 животных. Общий период кормления составил 50 суток. Взятие биологического материала (сыворотки крови) осуществлялось 4 раза: 1-ое взятие до начала кормления с дрожжевой добавкой (1 сутки), 2-ое взятие после 10 суток кормления с дрожжевой добавкой, 3-ье взятие -через 30 суток после кормления с дрожжевой добавкой и 4-ое взятие - через 50 суток после кормления с дрожжевой добавкой.
Иммуноферментный анализ сыворотки крови цыплят-бройлеров проводили по стандартной методике, включавшей в себя следующие этапы: инкубацию с использованием планшетного термошейкера «PST-60HL» (BioSan); промывку на планшетном вошере «WellWash4MK» (Thermo Fisher Scientific) и измерение оптической плотности на планшетном спектрофотометре «Multiskan FC» (Thermo Fisher Scientific). В анализе использовали набор фирмы ООО «НПП АВИВАК» для выявления антител к вирусам инфекционного бронхита кур (IBV), инфекционной бурсальной болезни птиц (IBDV), реовируса птиц (ARV), Ньюкасл ской болезни (NDV). Постановку анализа проводили в соответствии с инструкцией набора «АВИВАК» для проведения ИФА. В качестве контроля использовали сыворотку крови кур с антителами к исследуемым антигенам (положительный) и сыворотку крови, не содержащую антитела (отрицательный).
Количественный анализ иммуноглобулинов в крови цыплят-бройлеров и телят проводили по методу Бредфорда. Для этого предварительно осаждали иммуноглобулины с использованием насыщенного раствора сульфата аммония. Концентрацию опре-
деляли на спектрофотометре «Eppendorf Biospectrometr» [7].
Электрофорез иммуноглобулинов проводили на основе метода ДСН-электрофореза по Лэммли [10]. Для визуализации иммуноглобулинов в геле их окрашивали серебром.
Полученные результаты были статистически обработаны с помощью прикладных программ «Microsoft Office Excel» и «Statistica».
Результаты исследований
Кормление сформированных групп цыплят осуществляли в течение 40 дней. В рацион питания опытных групп цыплят добавляли 1,5 % микробной добавки (Тм-12 и ВСБ-829 соответственно). После окончания кормления отбирали сыворотку крови для проведения иммунологических анализов.
Определение титров антител методом ИФА позволило выявить влияние дрожжевой добавки на иммунитет цыплят. У вакцинированных цыплят, получавших с кормом дрожжевую добавку, усиливается иммунный ответ против вируса Ньюкаслской болезни (NDV) и инфекционного бронхита кур (IBV). Против остальных вирусов титры антител в опытных группах вакцинированных цыплят, получавших кормовую добавку, были на уровне показателей в контрольных группах (табл. 1).
Полученные данные по количественному определению содержания иммуноглобулинов свидетельствуют об увеличении концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови подопытных животных в сравнении с контролем на 60 % (табл. 2).
О повышении иммуноглобулинов у цыплят, употреблявших с кормом Candida maltosa ВСБ-829 и Тм-12, свидетельствуют и результаты анализа электрофореграмм (рис. 1). Сопоставление с белковым маркером показало, что увеличивается доля иммуноглобулинов с молекулярной массой 70 кСа и более 20 кСа, в сравнении с контролем.
Полученные результаты по количественному анализу концентрации иммуноглобулинов у телят свидетельствуют о достоверном увеличении концентрации иммуноглобулинов у животных, получавших дрожжевую добавку в составе корма, в сравнении с кон-
21
Таблица 1
Титры специфических антител у цыплят-бройлеров
Группы Титр антител (средний показатель)
Вирус
NDV IBV IBDV ARV
Пороговые значения титров
>1528 >765 >1677 >1899
Невакцинированные цыплята
ВСБ-829 1:291 1:177 - 1:145
Тм-12 1:150 1:223 1:7 1:124
Контроль 1:230 1:14 - 1:71
Вакцинированные цыплята
ВСБ-829 1:2298 * 1:846 * 1:23 1:387
Тм-12 1:3470 * 1:1119 * 1:25 1:232
Контроль 1:954 1:469 1:22 1:131
Контроли ИФА
Положительный 1:6620 1:9941 1:1179 1:13659
Отрицательный - - - -
Примечание: * - различия достоверны между контролем и опытными вариантами при р < 0,01.
Таблица 2
Концентрация иммуноглобулинов у разных групп цыплят
Группы цыплят-бройлеров
Контроль ВСБ-829 Тм-12
Средняя концентрация иммуноглобулинов (цг/мл) 544±25 881±62* 890±53*
Примечание: * - различия достоверны между контролем и опытными вариантами при р < 0,01.
Таблица 3
Концентрация иммуноглобулинов у разных групп телят
Группы телят Средняя концентрация иммуноглобулинов (цг/мл)
1 сутки (до кормления) 10 суток кормления добавкой 30 суток кормления добавкой 50 суток кормления добавкой
Контроль 666±20 666±70 613±82 632±43
ВСБ-829 628±60 592±81 680±131* 730±61*
Тм-12 403±100 520±110 ** 654±94 ** 761±75 ***
Примечание:
* - различия достоверны в группе телят, употреблявших ВСБ-829 между 30 сутками кормления и 1 сутками, а также между 50 сутками и 1 сутками при р < 0,05;
** - различия достоверны в группе телят, употреблявших Тм-12 между 10 сутками кормления и 1 сутками, а также между 30 сутками и 1 сутками при р < 0,05;
*** - различия достоверны в группе телят, употреблявших Тм-12 между 50 сутками кормления и 1 сутками при р < 0,01.
Рис. 1. Анализ фракций иммуноглобулинов в сыворотке крови цыплят-бройлеров.
Маркер пхэ? ■
2 SOkDa
70kDi
ЗОЮа
30Ы>а SfcDa
ВСБ-Й29 Тм-12 Контроль
■ ■ . .. Hi -- -.
шщ ■
Рис. 2. Анализ фракций иммуноглобулинов в сыворотке крови телят.
тролем (табл. 3). Отмечено, что увеличение концентрации иммуноглобулинов с увеличением возраста наиболее отчетливо проявляется в группе телят, в рационе питания которых присутствовала кормовая добавка Candida maltosa Тм-12.
Анализ фракций иммуноглобулинов на электрофореграммах у телят не выявил существенных различий между группами (рис. 2). Возможно, все изменения происходят на уровне минорных фракций, которые обычным методом ДСН-электрофореза по Лэммли визуализировать не удалось.
Таким образом, использование дрожжевой добавки Candida maltosa в рационе питания цыплят-бройлеров и телят положительно отразилась на иммунологических показателях животных.
Обсуждение результатов
Полученные данные о положительном влиянии микробного белка на рост животных, согласуются с результатами, полученными другими исследователями [8, 9].
Положительное влияние дрожжевой добавки на иммунитет подопытных животных можно объяснить стимулирующим эффектом компонентов добавки. Используемые в работе кормовые добавки представляют собой гомогенный продукт штаммов дрожжей Candida maltosa ВСБ-829 и Тм-12, обогащенный продуктами жизнедеятельности последних (микроэлементами, белками, витаминами и др.). Немаловажное значение играют живые клетки, находящиеся в дрож-
жевой добавке. Микроорганизмы, достигшие кишечника вместе с кормами, начинают активно контактировать с рецепторами лим-фоидных тканей, тем самым вызывая активацию иммунной системы. Также попадая в кишечник, дрожжи участвуют в процессах нейтрализации токсических веществ.
Заключение
Результаты работы по испытанию дрожжевых добавок Candida maltosa ВСБ-829 и Candida maltosa Тм-12 позволили выявить влияние этих добавок на показатели иммунитета испытуемых животных.
Использование дрожжевой добавки в корм-лении цыплят-бройлеров повышает титр антител против возбудителей Ньюкасл-ской болезни (NDV) и инфекционного бронхита кур (IBV). Выявлено увеличение общего содержания иммуноглобулинов при использовании кормовых добавок Candida maltosa ВСБ-829 и Candida maltosa Тм-12.
Таким образом, проведенные испытания позволили получить данные о положительном влиянии кормовых добавок Candida maltosa ВСБ-829 и Тм-12 на иммунитет животных. Этот результат свидетельствует о перспективности продолжения исследований в этом направлении.
Список литературы
1. Егоров И. А. Современные подходы к кормлению птицы / И. А. Егоров // Птицеводство. 2014. № 4. С. 11-16.
2. Егорова Т. А. Влияние пробиотиков на основе Saccharomyces sp. и Bacillus subtilis на бактериальное
23
сообщество слепых отростков кишечника и продуктивность цыплят бройлеров / Т. А. Егорова, Т. Н. Лен-кова, Л. А. Ильина, Е. А. Йылдырым, И. Н. Никонов, В. А. Филиппова, Г. Ю. Лаптев, Н. И. Новикова, А. А. Грозина, В. А. Манукян, В. И. Фисинин, И. А. Егоров // Сельскохозяйственная биология. 2016. Т. 51. № 6. С. 891-902.
3. Крапивина Е. В. Иммунный статус телят под влиянием пробиотика Провагена / Е. В. Крапивина, Д. В. Иванов, А. И. Феськов, Ю. Н. Федоров, А. И. Ал-булов, О. В. Буханцев, О. А. Богомолова // Сельскохозяйственная биология. 2012. № 4. С. 78-82.
4. Мулюкова Э. Ф. Биохимические и иммунологические показатели крови цыплят-бройлеров на фоне вакцинации и при использовании пробиотика «Ветоспорин-С» в сочетании с кормовой добавкой «Витамэлам» / Э. Ф. Мулюкова, А. В. Андреева // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н. Э. Баумана. 2015. С. 155-158.
5. Смирнова Л. В. Применение дрожжевого про-биотика в рационах молочных коров / Л. В. Смирно-
ва, С. В. Субботин, Е. Е. Хоштария // Молочнохозяй-ственный вестник. 2014. № 2 (14). С. 36-40.
6. Фисинин В. И. Биопрепарат на основе штамма Lactobacillus plantarum 1-211 для животноводства. Сообщение. Кормление бройлеров / В. И. Фисинин, Е. Н. Андрианова, И. И. Чеботарев, Г. Ю. Лаптев, И. Н. Никонов, Л. А. Ильина, А. В. Савинов, Н. Г. Машенцева, Д. Л. Кла-букова, Е. А. Йылдырым, Н. И. Новикова // Сельскохозяйственная биология. 2017. Т. 52. № 2. С. 382-390.
7. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M. M. Bradford // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.
8. Clements M. Stress, disease and nutritional solutions in poultry production / M. Clements // Poultry International. 2011. Vol. 50. № 1. Р. 22-25.
9. Herich R. Lactic acid bacteria, probiotics and immune system / R. Herich, M. Levcut // Vet. Med. 2002. № 47 (6). Р. 169-180.
10. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U. K. Laemmli // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.
