CC BY
20© Коллектив авторов, 2013
Оценка васкуляризации и микроокружения опухолевой ткани при фолликулярной лимфоме
Е.С. НЕСТЕРОВА1, С.К. КРАВЧЕНКО1, Э.Г. ГЕМДЖЯН1, Е.А. ОСМАНОВ2, А.М. КОВРИГИНА1
Гематологический научный центр Минздрава России; 2Российский онкологический научный центр им. акад. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Evaluation of tumor vascularization and microenvironment in follicular lymphoma
E.S. NESTEROVA1, S.K. KRAVCHENKO1, E.G. GEMDJIAN1, E.A. OSMANOV2, A.M. KOVRIGINA1
'Hematology Research Center, Ministry of Health of Russia; 2Acad. N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
Резюме
Цель исследования. Оценить васкуляризацию и микроокружение опухолевой ткани при фолликулярной лимфоме (ФЛ) на основе иммуногистохимического исследования (ИГХИ) на срезах с парафиновых блоков биоптатов лимфатических узлов в сравнительном исследовании 2 групп пациентов, отличающихся исходами заболевания.
Материалы и методы. В исследование включили 59 больных (39 (67%) женщин и 20 (33%) мужчин) в возрасте от 27 до 83 лет (медиана 53 года), проходивших лечение с апреля 2001 г. по май 2011 г. в Гематологическом научном центре МЗ РФ (n=49) и в Российском онкологическом научном центре им. Н.Н. Блохина РАМН (n=10). В соответствии с особенностями клинического течения заболевания выделены 2 группы пациентов: 1-я (n=31) — с хорошими результатами лечения ФЛ и 2-я (n=28) — с неблагоприятными исходами. ИГХИ выполнено на срезах с парафиновых блоков биоптатов опухолевых лимфатических узлов до лечения с использованием антител к CD34, D2-40, CD68 и granzyme B. Морфометрический анализ проведен с использованием микроскопии и цифровой камеры Leica (об. х400). Фотографии гистологических препаратов обработаны с помощью компьютерной программы «ВидеоТесТ-Морфология 5.2»: оценена удельная площадь сосудов (в процентах) по отношению к опухолевой ткани при визуальном контроле исследователя. Количественная характеристика цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ) и макрофагов проводилась на 1 мм2 опухолевой ткани (12 полей зрения при увеличении объектива х400). Выбор иммуногистохимических препаратов для исследования проводили случайным образом (с помощью таблицы случайных чисел).
Результаты. Удельная площадь кровеносных сосудов во 2-й группе оказалась статистически значимо больше, чем в 1-й: 0,04% (при 95% доверительном интервале — ДИ от 0,03 до 0,05%) против 0,02% (при 95% ДИ от 0,01 до 0,03%; р=0,05). Удельная площадь лимфатических сосудов во 2-й группе значимо больше, чем в 1-й: 0,06% (при 95% ДИ от 0,04 до 0,07%) против 0,03% (при 95% ДИ от 0,01 до 4%; p=0,03). При нодулярно-диффузном характере роста во 2-й группе количество CD68-позитивных макрофагов оказалось значимо больше, чем в 1-й: 800 (при 95% ДИ от 380 до 1222) против 79 (при 95% ДИ от 10 до 566; р=0,01). Количество ЦТЛ в 1-й группе статистически значимо (р=0,05) больше, чем во 2-й, как в нодулярном (при нодулярном росте опухоли: 14 (5—27) против 5 (1—11)), так и в интернодулярном пространстве (при нодулярном характере роста опухоли: 158 (118—410) против 35 (5—287) и при нодулярно-диффузном характере роста: 126 (102—360) против 35 (3—120)).
Заключение. Повышенная васкуляризация опухоли (оцениваемая удельной плотностью сосудистой сети в опухолевой ткани) и выраженная макрофагальная реакция ассоциированы с неблагоприятными исходами фолликулярной лимфомы; выраженный цитотоксический компонент в опухолевой ткани ассоциирован с благоприятными исходами заболевания.
Ключевые слова: фолликулярная лимфома, кровеносные сосуды, лимфатические сосуды, макрофаги, цитотоксические лимфоциты, поисковый анализ данных, многофакторный статистический анализ.
Aim. To characterize the degree of follicular lymphoma (FL) vascularization and microenvironment by immunohistochemical studies (IHCS) of lymph node biopsy paraffin-embedded sections in 2 different disease pattern groups.
Subjects and methods. The investigation included 59 patients: 39 (67%) women and 20 (33%) men whose age was 27 to 83 years (median age 53 years) treated at the Hematology Research Center, Ministry of Health of the Russian Federation (n=49), and the N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences (n=10), in April 2001 to May 2011. In accordance with the clinical features of the disease, the authors identified 2 patient groups: 1) 31 patients with the good results of FL treatment and 2) 28 patients with its poor results. IHCS was performed on lymph node tumor biopsy paraffin-embedded sections prior to treatment using antibodies to CD34, D2-40, CD68, and granzyme B. Morphometric analysis was made applying microscopy and a Leica х400 digital camera. The images of histological specimens were processed by the computer program VideoTesT-Morphology 5.2: the specific vessel area (%) in relation with tumor tissue was estimated under visual guidance of an investigator. Cytotoxic lymphocytes (CTL) and macrophages were quantitatively characterized using 1 mm2 of tumor tissue (12 fields of vision with the objective lens magnifying х400). Immunohistochemical specimens to be examined were chosen randomly, by using the random number table.
Results. In Group 2, the specific area of blood vessels was statistically significantly higher than in Group 1: 0.04% (95% confidence interval (CI), 0.03 to 0.05%) versus 0.02% (95% CI, 0.01 to 0.03%; p=0.05). In Group 2, that of lymphatic vessels was significantly higher than in Group 1: 0.06% (95% CI, 0.04 to 0.07%) versus 0.03% (95% CI, 0.01 to 4%; p=0.03). With a nodular diffuse growth, Group 2 showed a significantly more CD68-positive macrophages than did Group 1: 800 (95% CI, 380 to 1222) versus 79 (95% CI, 10 to 566; р=0.01). In Group 1, the count of CTL was statistically significantly (p=0.05) higher than in Group 2 in both the nodule (with a nodular growth pattern: 14 (5-27) versus 5 (1—11)) and the internodular space (with a nodular growth pattern: 158 (118—410) versus 35 (5—287) and with a nodular diffuse growth pattern: 126 (102—360) versus 35 (3—120)). Conclusion. Increased tumor vascularization (estimated by the specific density of tumor vasculature) and a pronounced
macrophageal reaction are associated with the poor outcomes of FL; the marked cytotoxic component in tumor tissue is linked to the favorable outcomes of the disease.
Key words: follicular lymphoma, blood vessels, lymphatic vessels, macrophages, cytotoxic lymphocytes, exploratory data analysis, multivariate statistical analysis.
БРВ — безрецидивная выживаемость
БСВ — «бессобытийная» выживаемость
ДВККЛ — диффузная В-крупноклеточная лимфома
ИГХИ — иммуногистохимическое исследование
ИЛ — интерлейкин
ЛУ — лимфатические узлы
НХЛ — неходжкинские лимфомы
ОВ — общая выживаемость
ПХТ — полихимиотерапия
УПС — удельная площадь сосудов ФЛ — фолликулярная лимфома HIF (hypoxia-inducible factor) — фактор, индуцированный гипоксией
MVD (microvessel density) — плотность сосудистой сети TAM (tumor-associated macrophages) — макрофаги, ассоциированные с опухолью
VEGF (ascular endothelial growth factor) — фактор роста эндотелия сосудов
Фолликулярная лимфома (ФЛ) — один из наиболее часто встречающихся вариантов лимфоидных опухолей; составляет 20—30% всех неходжкинских лимфом (НХЛ) в США [1], Западной Европе и 70% среди всех зрелоклеточ-ных лимфом в Европе и Северной Америке [2]. По данным Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина (на 2009 г.), ФЛ составляет около 22% всех НХЛ в России.
Заболевание ФЛ гетерогенно не только по происхождению и морфологической картине, но и по ответу на лечение. ФЛ характеризуется, как правило, длительным, часто рецидивирующим течением. Пятилетняя общая выживаемость (ОВ) пациентов после проведения стандартных курсов полихимиотерапии (ПХТ) по программе К-СИОР достигает 50% [3]. Заболевание рецидивирует в первые 3—4 года после окончания лечения: 2-летняя безрецидивная выживаемость (БРВ) после проведения курсов ПХТ по программе К-СИОР составляет 60%, 4-летняя — 40% [4]. У 15—20% больных наблюдается быстро прогрессирующее течение опухоли, больше напоминающее диффузную В-крупноклеточную лимфому (ДВККЛ); пациенты этой группы умирают в первые 1,5—2 года от установления диагноза [3, 5].
Такие прогностические индексы, как FLIPI-1 и FLIPI-2, не позволяют в достаточной мере прогнозировать характер течения заболевания, в связи с чем возникает необходимость разработки дополнительных прогностических критериев (иммуногистохимических, молекулярных, генетических). Одно из направлений исследовательских работ — изучение взаимодействия системы опухоль—микроокружение, а также ангиогенеза в опухолевой ткани, отражающего активность метаболических процессов в опухолевых клетках и влияющего на пролиферацию и генерализацию ФЛ [6, 7].
Сведения об авторах:
Кравченко Сергей Кириллович — доц., зав. научно-клинического отд-ния химиотерапии и интенсивной терапии гематологических заболеваний с биохимической функциональной группой Гематологического научного центра
Ковригина Алла Михайловна — зав. патолого-анатомическим отд-нием Гематологического научного центра
Гемджян Эдуард Георгиевич — с.н.с. лаб. биостатистики Гематологического научного центра
Османов Евгений Александрович — д.м.н., проф., зав. отд-нием химиотерапии гемобластозов Российского онкологического центра им. Н.Н. Блохина
Из целого спектра проангиогенных факторов, выделяемых опухолевыми клетками, наиболее важным можно считать фактор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor — VEGF). Он является секретиру-емым опухолью мультифункциональным цитокином, оказывающим основное митогенное действие на эндоте-лиальные клетки [8, 9]. Этот фактор обусловливает активацию миграции и митоза эндотелиальных клеток посредством активации метанмонооксигеназы, фермента окси-доредуктазы [10] и интегрина alpha-v beta-3 [11].
Результатом этого процесса является формирование сосудистой трубки и фенестраций (небольших пор в эндотелиальных клетках, позволяющих осуществлять быстрый обмен молекулами между синусоидами кровеносных сосудов и окружающими тканями). VEGF (наряду с ангио-генными свойствами) выполняет роль хемоаттрактанта для моноцитов и макрофагов: привлекает моноциты крови в очаг воспаления и роста сосудов через взаимодействие с рецептором VEGFR-1 [12]. Через рецепторы VEGFR-1 и VEGFR-2 на макрофагах VEGF опосредует хемотаксическую активность [13, 14], а через рецептор VEGFR-3 влияет на миграцию макрофагов [15]. Таким образом, VEGF участвует в активации микроокружения (макрофагов и моноцитов) опухолевой ткани [16—21].
Секрецию VEGF опухолевой тканью стимулирует гипоксия, развивающаяся в процессе пролиферации опухолевых клеток [22, 23]. В условиях клеточной гипоксии клетка синтезирует фактор, индуцированный гипоксией (hypoxia-inducible factor HIF). Фактор транскрипции HIF стимулирует высвобождение VEGF. Каждая из изоформ HIF (HIF-1a, HIF-1ß, HIF-2a, HIF-2ß, HIF-3a, HIF-3ß) выполняет определенную функцию. HIF-1a является наиболее чувствительным к наличию кислорода в клетке, и в аэробных условиях деградирует (при развитии гипоксии HIF-1a накапливается). Комплекс HIF-1a—HIF-1ß стимулирует высвобождение VEGF.
Степень васкуляризации опухолевой ткани определяют иммуногистохимически посредством оценки плотно-
Контактная информация:
Нестерова Екатерина Сергеевна — асп. научно-клинического отд-ния химиотерапии и интенсивной терапии гематологических заболеваний с биохимической функциональной группой Гематологического научного центра; 125167 Москва, Новый Зыковский пр-д, д. 4а; тел.: +7(910)429-6226; e-mail: nest.ek@ yandex.ru
сти сосудистой сети (microvessel density — MVD) и определения расстояния между сосудами в опухолевой ткани.
Исследований, касающихся изучения лимфатических сосудов при НХЛ, включая ФЛ, мы не нашли. Результаты по изучению кровеносных сосудов при лимфатических опухолях и их роль в течении заболевания противоречивы [24—31]. Ряд исследователей считают, что при НХЛ повышение концентрации VEGF в сыворотке крови, повышение экспрессии VEGF в опухолевой ткани, а также увеличение MVD являются предикторами неблагоприятного прогноза, и это ассоциировано с трансформацией опухоли в более агрессивную форму [32—38]. Однако есть предположения, что именно уменьшение MVD ассоциировано с химиоустойчиво-стью ФЛ, а повышенная васкуляризация опухолевой ткани при ФЛ ассоциирована с хорошим противоопухолевым ответом на терапию [39]. Результаты, представленные D. Aggarwal и соавт. [40], свидетельствуют об увеличении плотности сосудов в опухолевой ткани при различных В-клеточных НХЛ (преимущественно у пациентов с ФЛ и ДВККЛ), что соответствует более агрессивному опухолевому процессу. В исследовании P. Farinha и соавт. [41] приведены схожие выводы: обильная васкуля-ризация ассоциирована с неблагоприятным прогнозом и низкой ОВ.
Изучение роли только кровеносных сосудов для характеристики опухолевой ткани недостаточно. Оценку васкуляризации ткани целесообразно проводить как с позиции кровеносных, так и лимфатических сосудов.
К настоящему времени опубликован ряд работ, касающихся изучению васкуляризации при солидных опухолях, в которых обилие лимфатических сосудов в опухолевой ткани ассоциировано с более агрессивным течением и генерализацией опухолевого процесса [42, 43]. Например, в одной из исследовательских работ [44] с помощью системы биолюминесценции продемонстрирован механизм лимфангиогенеза на примере культуры клеток рака легкого у мышей, у которых блокировали рецептор VEGFR-3. Было определено, в какие сроки происходит запуск механизма неолимфангиогенеза, и доказано, что лимфатические сосуды служат основными транспортными системами для распространения опухолевых клеток.
Несомненно, что количественная оценка сосудистой ткани в полном объеме позволяет лучше понять различия в характере течения ФЛ.
В настоящее время установлено, что иммунное микроокружение опухолевых клеток при ФЛ определяет исход заболевания [45]. Результаты многих исследовательских работ отражают роль целого ряда иммунных клеток в характере течения опухолевого процесса: клеток с запрограммированной гибелью (PD1 — programmed death-1-positive cells, регуляторные Т-клетки-хелперы), цитотокси-ческих лимфоцитов, фолликулярных Т-хелперов, FOXP3-позитивных регуляторных клеток, макрофагов и др.
Макрофаги (клетки, полученные путем дифференциации моноцитов в тканях) разделяются на 3 типа: «классический» — М1-активированные макрофаги (иммунные эффекторные клетки, агрессивно фагоцитирующие и активно вырабатывающие лимфокины), «альтернативный» — М2-активированные макрофаги (секретирующие про-воспалительные лимфокины: интерлейкины — ИЛ-4, ИЛ-10 и ИЛ-13) и третий тип — М3-активированные ма-
крофаги (связанные с противовоспалительным действием и индукцией ТИ2-типа гуморального иммунитета) [46].
Макрофаги (наряду с дендритными клетками) пре-зентируют также антигены. Внутриклеточные антигены презентируются цитотоксическим Т-лимфоцитам (CD8+), а внеклеточные антигены — Т-хелперам (CD4+). Наряду с секреторными клетками макрофаги секретируют разнообразные монокины: ферменты, белки комплемента, регуляторные факторы (ИЛ-1). Макрофаги несут на себе рецепторы лимфокинов, которые вызывают их активацию, в результате которой происходит фагоцитирование микробов и опухолевых клеток. Макрофаги привлекаются в опухолевую ткань состоянием гипоксии. В опухолевой ткани они секретируют фактор некроза опухоли (TNF), вызывающий активацию гена — ядерного фактора NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), который, попадая в ядро опухолевой клетки, изменяет в нем процесс трансляции и тем самым останавливает апоптоз [47].
Значение макрофагального компонента в течении опухолевого процесса, как и роль васкуляризации, расценивается в различных исследованиях неоднозначно [48]. Большинство исследований посвящены изучению интра-фолликулярных макрофагов. В ряде работ сообщается, что повышенное количество клеток CD68+ (активированных макрофагов) ассоциировано с плохим ответом на терапию [49—52]. В работе D. Canioni и соавт. [53] дана оценка макрофагов, ассоциированных с опухолью (tumor-associated macrophages — ТАМ) у пациентов с ФЛ, получавших ПХТ по программам CHVP-I (циклофосфамид, доксорубицин, этопозид, преднизолон, интерферон) и CHVP-I с ритуксимабом. Определив количество ТАМ в 2 сравниваемых группах и оценив ответ опухоли на ПХТ, исследователи пришли к выводу, что повышенное количество ТАМ в интрафолликулярном пространстве ассоциировано с низкой «бессобытийной» выживаемостью (БСВ). Ритуксимаб ингибирует пролиферацию клеток, вызывает зависимую от комплемента и антител цитоток-сичность. Посредством механизма зависимой от антител клеточной цитотоксичности ритуксимаб способен усиливать фагоцитирование макрофагов, что ассоциировано с повышением ОВ. Таким образом, важно оценивать ма-крофагальный компонент, принимая во внимание использование в терапии ритуксимаба.
В работе М. Taskinen и соавт. [54] представлены данные, доказывающие, что выраженная макрофагальная реакция в опухолевой ткани при ФЛ ассоциирована с более высокими ОВ и БСВ. B. Wahlin и соавт. [45], проведя им-муногистохимическое исследование (ИГХИ) биоптатов лимфатических узлов (ЛУ) у 70 пациентов с разным клиническим течением ФЛ, заметили, что повышенное количество активированных макрофагов в интрафолликуляр-ном пространстве ассоциировано с неблагоприятным прогнозом.
Можно предположить, что противоречивость этих результатов объясняется разными типами активированных макрофагов в опухолевом микроокружении: действие одного типа способствует уничтожению патологической ткани, действие другого — подавлению иммунных реакций и тем самым распространению опухоли.
Важность механизма активации Т-клеточной реакции в опухолевой ткани при ФЛ описана в 1994 г. [55]:
пролиферация опухолевых клеток вызывает стимуляцию ассоциированных с опухолью антител, что в свою очередь вызывает активацию цитотоксических Т-лимфоцитов. Основная часть исследовательских работ посвящена изучению интрафолликулярных Т-лимфоцитов как компонента реактивного микроокружения. Результаты изучения роли Т-клеточного реактивного компонента в характере течения ФЛ также неоднозначны [48]. Большинство исследователей делают заключение, что повышенная реакция клеток CD4+ ассоциирована с худшим прогнозом, а повышенная реакция клеток CD8+ — с лучшим прогнозом. В работе B. Wahlin [45] сообщается о том, что повышенная экспрессия клеток CD4+ в интерфолликулярном пространстве и большой коэффициент CD4/CD8 и клеток CD4+ в фолликулярном и интерфолликулярном пространстве связаны с худшим прогнозом. Повышенная реакция клеток с запрограммированной гибелью, клеток CD8+ и FOXP3+ в опухолевой ткани ассоциирована с лучшим прогнозом. Подобные результаты представили также T. Alvaro и соавт. [56] и A. Lee и соавт. [57]. В работе C. Laurent и соавт. [58] подчеркивается ведущая роль ци-тотоксического компонента CD8+ в противоопухолевом ответе при ФЛ (количественная оценка ЦТЛ была проведена с использованием антитела к granzyme B-белковому продукту гранул цитотоксических лимфоцитов). Исследователями продемонстрирована связь повышенного количества ЦТЛ с высокой БСВ.
Таким образом, наиболее важными критериями, коррелирующими с ОВ, являются васкуляризация опухолевой ткани, состояние макрофагального и цитотоксиче-ского компонентов [59—64]. Данные о значении этих компонентов в отдельности при НХЛ противоречивы. В доступной нам литературе мы не обнаружили работ, изучающих одновременно все эти параметры при ФЛ.
В нашем исследовании сопоставлены клинико-мор-фологические особенности ФЛ с особенностями васкуля-ризации и опухолевого микроокружения с целью выявления дополнительных факторов прогноза. Выявленные вышеперечисленные факторы будут способствовать разработке дифференцированного подхода к терапии больных ФЛ.
Материалы и методы
В исследование включили 59 больных (39 (67%) женщин и 20 (33%) мужчин) в возрасте от 27 до 83 лет (медиана 53 года), которые наблюдались с апреля 2001 г. по май 2011 г. в отделении химиотерапии гематологических заболеваний и интенсивной терапии Гематологического научного центра (ГНЦ) МЗ РФ («=49) и в отделении химиотерапии гемобластозов РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН («=10); 18 (31%) пациентов были старше 60 лет, 4 — моложе 30 лет.
В соответствии с исходами клинического течения заболевания выделили 2 группы пациентов. В 1-ю группу (n=28) вошли больные, наблюдавшиеся в течение 2 лет и более без лечения, либо находившиеся в ремиссии основного заболевания более 3 лет, либо имевшие поздние (спустя не менее 5 лет от начала заболевания) рецидивы. Во 2-ю группу («=31) включены больные, умершие в результате прогрессирования опухоли в первые 2 года от установления диагноза, либо имевшие первично резистентное течение опухоли. Характеристики пациентов представлены в таблице.
Пациенты двух сравниваемых групп получили одинаковую начальную терапию, были сопоставимы по основным демографическим факторам, морфологическим характеристикам опухо-
ли, объему опухолевой массы, индексу FLIPI-1, наличию поражения костного мозга.
Материал исследования состоит из ретроспективных и проспективных данных. Диагноз ФЛ устанавливали на основании комплексной диагностики: анамнеза заболевания, объективного осмотра, данных инструментальных и лабораторных исследований, а также исследования биоптатов периферических ЛУ (данные цитологического, гистологического, кариологического исследований, ИГХИ трепанобиоптатов).
Морфологическую диагностику ФЛ проводили по результатам гистологического исследования опухолевой ткани в соответствии с критериями классификации опухолей кроветворной и лимфоидной тканей ВОЗ (2008) [67].
Обследование первичных больных с диагнозом ФЛ проводили по протоколу оценки первичного пациента с лимфопроли-феративным заболеванием.
При обработке ретроспективного материала оценивали анамнестические данные и результаты клинико-инструменталь-ных исследований. Гистологическое и ИГХИ выполнены преимущественно на ретроспективном материале (на срезах с парафиновых блоков биоптатов опухолевых ЛУ) до начала лечения.
У всех больных оценивали особенности гистологической (нодулярный, нодулярно-диффузный или диффузный тип роста) и цитологической (1—2-й или 3-й цитологический тип) картин опухоли с помощью микроскопии. Особенности васкуляризации опухолевой ткани оценивали с помощью иммуногистохимиче-ского исследования с использованием антител к CD34 (QBend — 10, разведение 1:25, Dako, Denmark A/S) и к D2-40 (подопланин, клон D2-40, разведение 1:100, Dako, Denmark A/S). Негативный критерий оценки реакции c антителом CD34 состоял в отсутствии окрашенности сосудов в иммуногистохимическом препарате. Во всех случаях негативного контроля использовали эндотелий лимфатических сосудов. Критерием оценки реакции с антителом D2-40 являлись неокрашенные сосуды в иммуногисто-химическом препарате. Позитивным контролем считалось окрашивание эндотелия кровеносных сосудов разного калибра (мембранное окрашивание).
Оценку васкуляризации опухолевой ткани проводили с помощью морфометрического анализа с использованием микроскопии и применением цифровой камеры Leica.
Фотографии выполнены с увеличением объектива в 400 раз. Характеристика проводилась на 1 мм2 опухолевой ткани (площадь одного поля зрения на увеличении х400 равна 0,075 мм2) — 12 полей зрения в зависимости от характера опухолевого роста: при нодулярном росте опухоли — 12 опухолевых нодулей, при нодулярно-диффузном — 6 опухолевых нодулей и 6 полей зрения с диффузным характером роста, при диффузном — 12 полей зрения с диффузными участками роста.
Для получения точных количественных результатов фотографии обрабатывали с помощью компьютерной программы «ВидеоТесТ-Морфология 5.2» (Санкт-Петербург, 2011). При визуальном контроле оценили (в процентах) удельную площадь сосудов (УПС) по отношению к опухолевой ткани. Выбор иммуногистохимиче-ских препаратов для визуального исследования осуществляли случайным образом (с помощью таблиц случайных чисел).
Для визуализации активированных макрофагов использовано антитело к CD68 (PG-M1, разведение 1:100, Dako, Denmark A/S). Количественную характеристику позитивных клеток проводили на 1 мм2 опухолевой ткани на увеличении объектива х400 — 12 полей зрения. В нодуле подсчет макрофагов не проводили (интрафолликулярный компонент относится к реактивному микроокружению).
Критерии оценки реакции с антителом к CD68: позитивным контролем считалось внутрицитоплазматическое окрашивание макрофагов. Негативный контроль — отсутствие окрашивания.
Для визуализации цитотоксических лимфоцитов в работе использовали антитело к granzyme B (NCL-GRAN-B в разведении 1:25; Dako, Denmark A/S). Позитивным критерием оценки реакции с антителом к granzyme B считали диффузное гранулярное окрашивание цитотоксических лимфоцитов.
Количественную характеристику позитивных клеток проводили на 1 мм2 опухолевой ткани при увеличении объектива в 400
Характеристики пациентов сравниваемых групп
Параметр
Сравниваемая группа больных ФЛ
1-я (с благоприятными исходами, n=28) 2-я (с неблагоприятными исходами, n=31)
Возраст, годы: 52 (20—83)* 53 (27—85)*
<60 20 (71%) 20 (65%)
>60 8 (29%) 11 (35%)
Пол:
мужчины 9 (32%) 11 (35%)
женщины 19 (68%) 20 (65%)
Цитологический тип:
1—2 18 (64%) 18 (58%)
ЗА 10 (36%) 13 (42%)
Характер роста:
нодулярный и нодулярно-диффузный 23 (81%) 24 (77%)
диффузный 5 (19%) 7 (23%)
ЛДГ (норма 480 ед/л):
< норма 21 (75%) 19 (61%)
> норма 7 (25%) 12 (39%)
Наличие В-симптомов 13 (46%) 26 (84%)
Наличие bulky 10 (36%) 13 (42%)
Стадия по Ann-Arbor:
I 7 (25%) 3 (10%)
II 1 (4%) 5 (16%)
ш—rv 20 (71%) 23 (74%)
FLIPI-1:
0—I 11 (40%) 4 (13%)
II 3 (10%) 10 (32%)
III—IV 14 (50%) 17 (55%)
Концентрация Hb <120 г/л 10 (35%) 11 (35%)
Наличие поражения костного мозга 20 (71%) 25 (80%)
Терапия:
(R)-CHOP-like 19 (68%) 25 (81%)
(R)-FMC-like 5 (18%) 5 (13%)
Интенсивная терапия 2 (7%) 1 (3%)
Наблюдение 2 (7%) —
Примечание. * Данные представлены в виде медианы (размах). ЛДГ — лактатдегидрогеназа.
раз и количестве полей зрения в зависимости от характера опухолевого роста: при нодулярном росте опухоли — 12 опухолевых нодулей, при нодулярно-диффузном — 6 опухолевых нодулей и 6 полей зрения с диффузным характером роста. Отдельно оценивали количество позитивных клеток как в интрафолликулярном, так и в интерфолликулярном пространстве.
Статистический анализ данных проводили с использованием методов описательной статистики, сравнения выборок и логистической регрессии. Пороговый уровень статистической значимости принят равным 0,05. Для представления эмпирических распределений использованы среднее арифметическое (И), медиана (Ме) и 95% доверительный интервал (ДИ).
Результаты и обсуждение
На серийных срезах парафиновых блоков биопсийно-го материала (всего 59 парафиновых блоков) проведено ИГХИ с использованием антител к CD34, D2-40, CD68 и granzyme В. ИГХИ выполнено в обеих сравниваемых группах пациентов.
При оценке степени васкуляризации опухоли кровеносными сосудами (оцениваемой по УПС) получены следующими результаты: удельная площадь кровеносных со-
судов во 2-й группе оказалась статистически значимо больше, чем в 1-й: 0,04% (при 95% ДИ от 0,03 до 0,05%) против 0,02% (95% ДИ от 0,01 до 0,03%; ОР 2; р=0,05). Следовательно, повышенная плотность кровеносных сосудов ассоциирована с неблагоприятными исходами течения опухоли при ФЛ. Отметим, что кровеносные сосуды располагались преимущественно в интер- и перинодуляр-ном пространствах.
Аналогичные измерения удельной площади лимфатических сосудов дали следующие результаты: удельная площадь лимфатических сосудов во 2-й группе статистически значимо больше, чем в 1-й: 0,06% (при 95% ДИ от 0,04 до 0,07%) против 0,03% (при 95% ДИ от 0,01 до 0,04%; ОР 2; р=0,03). Лимфатические сосуды располагались преимущественно в интер- и перинодулярном пространствах.
В ходе оценки степени выраженности макрофагаль-ного компонента получены следующие результаты: при нодулярно-диффузном характере роста во 2-й группе количество CD68-позитивных макрофагов статистически значимо больше, чем в 1-й: 800 (при 95% ДИ от 380 до 1222) против 79 (при 95% ДИ от 10 до 566; ОР 9; р=0,01).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что выраженный макрофагальный компонент в опухолевой ткани связан с неблагоприятными исходами заболевания.
Количество ЦТЛ подсчитано в зависимости от характера опухолевого роста (нодулярный, учитывая минимальное интранодулярное количество ЦТЛ как компонент микроокружения, и нодулярно-диффузный) в различных зонах опухолевого биоптата (в нодуле, интерноду-лярном пространстве, диффузных участках). Оказалось, что благоприятный исход лечения статистически значимо (р=0,05) связан с повышенным количеством ЦТЛ: 1) в нодуле при нодулярном росте опухоли: количество ЦТЛ у больных в 1-й группе равно 14 (5—27), во 2-й группе — 5 (1—11); 2) в интранодулярном пространстве: количество ЦТЛ у больных в 1-й группе примерно в 4 раза больше, чем у больных во 2-й группе, а именно 158 (118 — 410) против 35 (5 — 287) при нодулярном характере роста опухоли и 126 (102 — 360) против 35 (3 — 120) при нодулярно-диффузном росте (превышение ЦТЛ значительное); 3) в диффузной области при нодулярно-диффузном росте опухоли также имеется статистически значимое различие: 31 (7—65) в 1-й группе против 7 (2—20) во 2-й группе (р=0,05). Выраженный цитотоксический компонент в опухолевой ткани (при нодулярном и нодулярно-диффуз-ном характере роста) ассоциирован с благоприятными исходами течения фолликулярной лимфомы.
Полученные результаты позволяют предположить, что состояние ангиогенеза, оцениваемое с помощью УПС в опухолевой ткани, является важным прогностическим признаком, ассоциированным с неблагоприятным течением заболевания (и соответственно с низкой общей выживаемостью больных ФЛ). Многие вопросы остаются открытыми, например, какие факторы обусловливают рост сосудистой ткани? Одной из причин может являться генетически обусловленная особенность васкуляризации ЛУ (известно, что кровоснабжение периферических и за-брюшинных ЛУ различно), а также особенность метаболизма биопсийной ткани (способность некоторых опухолевых клеток к анаэробному гликолизу, обусловливающему резистентность опухолевой ткани к гипоксии). Углубленное изучение экспрессии генов позволит, по-видимому, ответить на эти и другие вопросы.
Результаты, характеризующие опухолевое микроокружение, демонстрируют реципрокные взаимосвязи цитотоксического и макрофагального компонентов: выраженный макрофагальный компонент в опухолевой ткани связан с неблагоприятными исходами заболевания (и характеризуется низкой ОВ); выраженный цитотоксиче-ский компонент, наоборот, ассоциирован с благоприятным исходом заболевания (и характеризуется более высокой ОВ).
Обилие макрофагов в группе с неблагоприятным течением можно объяснить нарастанием состояния гипоксии, привлекающим макрофаги в опухолевую ткань.
Имеет значение и функциональный тип макрофага. Замечено, если в презентации опухолевого антигена участвуют преимущественно активированные макрофаги типа М1, то происходит подавление опухолевого роста посредством агрессивного фагоцитирования (возникает реактивный клон ЦТЛ). Наоборот, если в презентации опухолевого антигена участвуют преимущественно макрофаги типа М2, то происходит стимуляция опухолевого роста посредством подавления иммунных реакций в опухолевой ткани (возникает реактивный клон Т-хелперов). В связи с этим можно предположить, что реакция цитотоксических лимфоцитов в опухолевой ткани у пациентов с неблагоприятным течением ФЛ обусловлена активным участием макрофагов именно типа М2.
ЦТЛ, связавшись со специфическим рецептором на опухолевой клетке, вступает с ней «в плотный контакт», выделяя перфорины. Последние встраиваются в мембрану опухолевой клетки, затем (в присутствии ионов кальция) полимеризуются и образуют каналы, через которые в опухолевую клетку входит избыточное количество воды, разрывающей эту клетку. Один ЦТЛ разрушает лишь несколько опухолевых клеток, после чего в нем происходит истощение энергетических запасов и перфоринов, и он разрушается. Возможно, функциональное состояние «много макрофагов—мало ЦТЛ» в опухолевой ткани у пациентов 2-й группы обусловлено именно быстрой гибелью ЦТЛ.
В группе с неблагоприятными исходами заболевания отмечено сочетание обилия сосудов (кровеносных и лимфатических) и повышения количества активированных макрофагов в опухолевой ткани. В группе с благоприятным течением заболевания, наоборот, наблюдается меньшее количество сосудистой ткани, небольшое количество макрофагов и выраженная инфильтрация опухолевой ткани ЦТЛ.
Заключение
Таким образом, принимая во внимание не только клиническую картину ФЛ (анамнез заболевания, прогностические индексы FLIPI-1,2 и наличие массивных опухолевых конгломератов), но и биологическую характеристику опухоли (цитологический тип, характер опухолевого роста, степень васкуляризации, выраженность макро-фагального и цитотоксического компонентов) в дебюте болезни, можно будет выделять пациентов с предположительно неблагоприятным течением заболевания и формировать дифференцированную тактику их ведения.
ЛИТЕРАТУРА
Morton L.M., Wang S.S., Devesa S.S. et al. Lymphoma incidence patterns by WHO subtype in the United States, 1992—2001. Blood 2006; 107 (1): 265—276.
2. A clinical evaluation of the International Lymphoma Study Group classification of non-Hodgkin's lymphoma. The Non-Hodgkin's Lymphoma Classification Project. Blood. 1997; 89 (11): 3909—3918.
3. RohatinerA.Z., NadlerL., DaviesA.J. et al. Myeloablative therapy with autologous bone marrow transplantation for follicular lymphoma at the time of second or subsequent remission: long-term follow-up. J Clin Oncol 2007; 25 (18): 2554—2559.
4. van Oers M.H., Van Glabbeke M., Giurgea L. et al. Rituximab maintenance treatment of relapsed/resistant follicular non-Hodgkin's lymphoma: long-term outcome of the EORTC 20981 phase III randomized intergroup study. J Clin Oncol 2010; 28 (17): 2853—2858.
5. Schouten H.C., Qian W., Kvaloy S. et al. High-dose therapy improves progression-free survival and survival in relapsed follicular non-Hodgkin's lymphoma: results from the randomized European CUP trial. J Clin Oncol 2003; 21 (21): 3918—3927.
6. Hazar B., Paydas S., Zorludemir S. et al. Prognostic significance of microvessel density and vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in non-Hodgkin's lymphoma. Leuk Lymphoma 2003; 44: 2089—2093.
7. Tzankov A., Heiss S., Ebner S. Angiogenesis in nodal B cell lymphomas: a high throughput study. J Clin Pathol 2007; 60: 476—482.
8. Ferrara N., Winer J., Burton T. et al. Expression of vascular endothelial growth factor does not promote transformation but confers a growth advantage in vivo to Chinese hamster ovary cells. J Clin Invest 1993; 91: 160—170.
9. Zhang H.T., Craft P., Scott P.A. et al. Enhancement of tumor growth and vascular density by transfection of vascular endothelial cell growth factor into MCF-7 human breast carcinoma cells. J Nat Cancer Inst 1995; 87: 213—219.
10. Murrell J.C., Lidstrom M.E., Holmes A.J., Costello A. Evidence that particulate methane monooxygenase and ammonia monooxygenase may be evolutionary related. FEMS Microbiol Lett 1995; 132 (3): 203—208.
11. Yamaguchi H., Takagi J., Miyamae T. et al. Milk fat globule EGF factor 8 in the serum of human patients of systemic lupus erythematosus. J Leukoc Biol 2008; 83 (5): 1300—1307.
12. Barleon B., Sozzani S., Zhou D. et al. Migration of human monocytes in response to vascular endothelial growth factor (VEGF) is mediated via the VEGF receptor flt-1 Blood 1996; 87: 3336—3343.
13. Hiratsuka S., Minowa O., Kuno J. et al. Flt-1 lacking the tyrosine kinase domain is sufficient for normal development and angiogenesis in mice. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 9349—9354.
14. Yang Z.F., Poon R.T., Luo Y. et al. Up-regulation of vascular endothelial growth factor (VEGF) in small-for-size liver grafts enhances macrophage activities through VEGF receptor 2-dependent pathway. J Immunol 2004; 173: 2507—2515.
15. Skobe M., Hamberg L.M., Hawighorst T. et al. Concurrent induction of lymphangiogenesis, angiogenesis, and macrophage recruitment by vascular endothelial growth factor-C in melanoma. Am J Pathol 2001; 159: 893—903.
16. Pepper M.S. Lymphangiogenesis and Tumor Metastasis: Myth or Reality? Clin Cancer Res 2001; 7 (3): 462—468.
17. Schneider M., Othman-Hassan K., Christ B., Wilting J. Lymphangioblasts in the avian wing bud. Dev Dyn 1999; 216: 311—319.
18. Takahashi T., Kalka C., Masuda D. et al. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med 1999; 5: 434— 438.
19. GillM., Dias K., HattoriM.L. et al. Vascular trauma induces rapid but transient mobilization of VEGFR2(+) AC133(-) endothelial precursor cells. Circ Res 2001; 88: 167—174.
20. Dengjel J., Kratchmarova I., Blagoev B. Receptor tyrosine kinase signaling: a view from quantitative proteomics. Mol Biosyst 2009; 5 (10): 1112—1121.
21. Folkman J., DAmore P.A. Blood vessel formation: what is its molecular basis? Cell 1996; 87: 1153—1155.
22. Holmes K., Owain R.L., Angharad M.T. Cross M.J. Vascular endothelial growth factor receptor-2: Structure, function, intracellular signalling and therapeutic inhibition. Cellular Signalling 2007; 19 (10): 2003—2012.
23. Wey J.S., Fan F., Gray M.J. et al. Vascular endothelial growth factor receptor-1 promotes migration and invasion in pancreatic carcinoma cell lines. Cancer 2005; 104: 427—438.
24. Koster A., Raemaekers J.M. Angiogenesis in malignant lymphoma. Curr Opin Oncol 2005; 17: 611—616.
25. Foss H.D., Araujo I., Demel G. et al. Expression of vascular endothelial growth factor in lymphomas and Castleman's disease. J Pathol 1997; 183: 44—50.
26. Ribatti D., Vacca A., Bertossi M. et al. Angiogenesis induced by B-cell non-Hodgkin's lymphomas. Lack of correlation with tumor malignancy and immunologic phenotype. Anticancer Res 1990; 10: 401—406.
27. Stewart M., Talks K., Leek R. et al. Expression of angiogenic factors and hypoxia inducible factors HIF 1, HIF 2 and CA IX in non-Hodgkin's lymphoma. Histopathology 2002; 40: 253—260.
28. J0rgensen J.M., S0rensen F.B., Bendix K. Expression level, tissue distribution pattern, and prognostic impact of vascular endothelial growth factors VEGF and VEGF-C and their receptors Flt-1, KDR, and Flt-4 in different subtypes ofnon-Hodgkin lymphomas. Leuk Lymphoma 2009; 50 (10): 1647—1660.
29. Ho C.L., Sheu L.F., Li C.Y. Immunohistochemical expression of angiogenic cytokines and their receptors in reactive benign lymph nodes and non-Hodgkin lymphoma. Ann Diagn Pathol 2003; 7 (1): 1—8.
30. Gately S., Li W.W. Multiple roles of COX-2 in tumor angiogenesis: a target for antiangiogenic therapy. Semin Oncol 2004; 31 (Suppl 7): 2—11.
31. Hoper M.M., Voelkel N.F., Bates T.O. et al. Prostaglandins induce vascular endothelial growth factor in a human monocytic cell line and rat lungs via cAMP. Am J Respir Cell Mol Biol 1997; 17: 748—756.
32. Bellamy W.T., Richter L., Frutiger Y. et al. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in hematopoietic malignancies. Cancer Res 1999; 59: 728—733.
33. Bono P., Teerenhovi L., Joensuu H. Elevated serum endostatin is associated with poor outcome in patients with non-Hodgkin lymphoma. Cancer 2003; 97: 2767—2775.
34. Pedersen L.M., Klausen T.W., Davidsen U.H. et al. Early changes in serum IL-6 and VEGF levels predict clinical outcome following first-line therapy in aggressive non-Hodgkin's lymphoma. Ann Hematol 2005; 84: 510—516.
35. Potti A., Ganti A.K., Kargas S. et al. Immunohistochemical detection of C-kit (CD117) and vascular endothelial growth factor (VEGF) overexpression in mantle cell lymphoma. Anticancer Res 2002; 22: 2899—2901.
36. Salven P., Orpana A., Teerenhovi L. et al. Simultaneous elevation in the serum concentrations of the angiogenic growth factors VEGF and bFGF is an independent predictor of poor prognosis in non-Hodgkin lymphoma: a singleinstitution study of200 patients. Blood 2000; 96: 3712—3718.
37. Vacca A., Ribatti D., Ruco L. et al. Angiogenesis extent and macrophage density increase simultaneously with pathological progression in B-cell non-Hodgkin's lymphomas. Br J Cancer 1999; 79: 965—970.
38. Zhao W.L., Mourah S., Mounier N. et al. Vascular endothelial growth factor-A is expressed both on lymphoma cells and endothelial cells in angioimmunoblastic T-cell lymphoma and related to lymphoma progression. Lab Invest 2004; 84: 1512—1519.
39. Koster A., van Krieken J.H., Mackenzie M.A. et al. Increased vascularization predicts favorable outcome in follicular lymphoma. Clin Cancer Res 2005; 11: 154—161.
40. Aggarwal D., Srivastava G., Gupta R. et al. Angiogenesis in Non-Hodgkin's Lymphoma: An Intercategory Comparison of Microvessel Density. ISRN Hematol 2012; 2012: 943089.
41. Farinha P., Kyle A.H., Minchinton A.I. et al. Vascularization predicts overall survival and risk of transformation in follicular lymphoma. Haematologica 2010; 95 (12): 2157—2160.
42. Shayan R, Achen M.G., Stacker S.A. Lymphatic vessels in cancer metastasis: bridging the gaps. Carcinogenesis 2006; 27 (9): 1729—1738.
43. Banerji S., Ni J., Wang S.X. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. J Cell Biol 1999; 144: 789—801.
44. Wigle J.T., OliverG. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell 1999; 98: 769—778.
45. Wahlin B.E., Aggarwal M., Montes-Moreno S. A Unifying Microenvironment Model in Follicular Lymphoma: Outcome Is Predicted by Programmed Death-1—Positive, Regulatory, Cytotoxic, and Helper T Cells and Macrophages. Clin Cancer Res 2010; 16 (2): 637—650.
46. Mosser D.M. The many faces of macrophage activation. J Leukoc Biol 2003; 73 (2): 209—212.
47. Stix G. A malignant flame. Understanding chronic inflammation, which contributes to heart disease, Alzheimer's and a variety of other ailments, may be a key to unlocking the mysteries of cancer. Sci Am 2007; 297 (1): 60—67.
48. Jong D., Koster A., Hagenbeek A. et al. Impact of the tumor microenvironment on prognosis in follicular lymphoma is dependent on specific treatment protocols. Haematologica 2009; 94: 70—77.
49. Richendollar B.G., Pohlman B., Elson P., Hsi E.D. Follicular programmed death 1-positive lymphocytes in the tumor microenvironment are an independent prognostic factor in follicular lymphoma. Hum Pathol 2011; 42 (4): 552—557.
50. Clear A.J., Lee A.M., Calaminici M. et al. Increased angiogenic sprouting in poor prognosis FL is associated with elevated numbers of CD163-macrophages within the immediate sprouting microenvironment. Blood 2010; 115 (24): 5053—5056.
51. Andjelic B., Mihaljevic B., Todorovic M. et al. The number of lymphoma-associated macrophages in tumor tissue is an independent prognostic factor in patients with follicular lymphoma. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2012; 20 (1): 41—46.
52. Álvaro T., Lejeune M., Camacho F.I. et al. The presence of STAT1-positive tumor-associated macrophages and their relation to
outcome in patients with follicular lymphoma. Haematologica 2006; 91: 1605—1612.
53. Canioni D., Salles G., Mounier N. et al. High Numbers of Tumor-Associated Macrophages Have an Adverse Prognostic Value That Can Be Circumvented by Rituximab in Patients With Follicular Lymphoma Enrolled Onto the GELA-GOELAMS FL-2000 Trial. J Clin Oncol 2008 26 (3): 440—446.
54. Taskinen M., Karjalainen-Lindsberg M.-L., Nyman H. et al. A HighTumor-Associated Macrophage Content Predicts Favorable Outcome in Follicular Lymphoma Patients Treated with Rituximab and Cyclophosphamide-Doxorubicin-Vincristine-Prednisone. Clin Cancer Res 2007; 13: 5784—5789.
55. Leger-RavetM.B., Devergne O, PeuchmaurM. In situ detection of activated cytotoxic cells in follicular lymphomas. Am J Pathol 1994; 144 (3): 492—499.
56. Alvaro T, Lejeune M, Salvado M.T. et al. J Clin Oncol 2007; 25 (10): 1289—1891.
57. Lee A.M., Clear A.J., Calaminici M. et al. Number of CD4 Cells and Location of Forkhead Box Protein P3-Positive Cells in Diagnostic Follicular Lymphoma Tissue Microarrays Correlates With Outcome. J Clin Oncol 2006; 24 (31): 5052—5059.
58. Laurent C, Müller S, Do C. et al. Distribution, function, and prognostic value of cytotoxic T lymphocytes in follicular lymphoma: a 3-D tissue-imaging study. Blood 2011; 118 (20): 5371—5379.
59. Нестерова Е.С., Кравченко С.К., Гемджян Э.Г. и др. Лечение фолликулярной лимфомы: 10-летний опыт. Гематол и трансфузиол 2012; 5: 3—8.
60. Покровская О.С., Менделеева Л.П., Капланская И.Б. и др. Ан-гиогенез в костном мозге больных множественной миело-мой на различных этапах высокодозной химиотерапии. Клин онкогематол 2010; 4: 347—353.
61. Любимова Л.С., Савченко В.Г., Менделеева Л.П. и др. Трансплантация аллогенного костного мозга при хроническом миелолейкозе. Тер арх 2004; 7: 18—24.
62. Пивник А.В., Самойлова Р. С., Новиков В.А. и др. Дифференциально-диагностическое и прогностическое значение показателей сывороточных цитокинов при лимфогранулематозе и лимфосаркомах. Тер арх 2001; 4: 45—51.
63. Магомедова А.У., Кравченко С.К., Кременецкая А.М. и др. Модифицированная программа NHL-BFM-90 для лечения больных диффузной В-крупноклеточной лимфосаркомой. Тер арх 2006; 10: 44—47.
64. Магомедова А.У., Кравченко С.К., Кременецкая А.М. и др. Эффективность курса CHOP-21 в терапии диффузной В-крупноклеточной лимфосаркомы. Тер арх 2005; 7: 58—61.
65. Swerdlow S.H., Campo E, Harris N.L. et al. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Lyon: IARC Press; 2008.
Поступила 12.02.2013
