CC BY
56
Вестник ОрелГАУ, 6(57), Декабрь 2015, http://dx.doi.org/10.15217/issn1990-3618.2015.6.79 УДК / UDC 634.11:577.121.7:577.115:632.16
ОЦЕНКА УСТОЙЧИВОСТИ ЯБЛОНИ К ГИПЕРТЕРМИИ НА ОСНОВЕ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ ЗАЩИТЫ
EVAVALUATION OF APPLE RESISTANCE TO HYPERTHERMIA BASED ON LIPID PEROXIDATION AND ANTIOXIDANT DEFENSE SYSTEM
Прудников П.С., кандидат биологических наук Prudnicov P.S., candidate of Biological Sciences Седов Е.Н., академик РАН Sedov E.N., Academician of RAS ФГБНУ ВНИИ селекции плодовых культур, Орел, Россия FSBSI All-Russian Research Institute of Fruit Crop Breeding, Orel ,Russia
E-mail: [email protected]
АННОТАЦИЯ
В статье рассматривается влияние теплового шока на процессы перекисного окисления липидов и активность антиоксидантной системы защиты Malus domestica L. Показано, что в условиях действия гипертермии в листьях сортов яблони Уэлси и Орлик, по сравнению с генотипами Ветеран и Имрус отмечается повышенное накопление малонового диальдегида, что свидетельствует об интенсивном развитии перекисного окисления липидов, а, следовательно, и большем нарушении структурно-функциональной целостности клеток. Менее интенсивное развитие процессов липопероксидации у сортов Имрус и Ветеран происходит на фоне значительного увеличения активности супероксиддисмутазы (СОД) и наименьшего накопления аминокислоты пролин. В сортах Орлик и Уэлси, напротив, отмечается существенное увеличение содержания пролина при незначительном увеличении активности СОД. На основе полученных данных делается вывод о наличии физиолого-биохимических признаков устойчивости генотипов Имрус и Ветеран к действию условий гипертермии.
ABSTRACT
The heat shock effect on the processes of lipid peroxidation and activity of antioxidant protection system of Malus domestica L. has been investigated. It is shown that under the hyperthermia effect an increased accumulation of malone dialdehyde is noted in the leaves of 'Wealthy' and 'Orlik' in comparison with 'Veteran' and 'Imrus', which is indicative of the intensive development of lipid peroxidation and, therefore, great disorder of structural and functional integrity of cells. The processes of lipid peroxidation in 'Imrus' and 'Veteran' are less intensive on the background of a substantial increase of superoxide dismutase (SOD) activity and the least accumulation of proline. On the contrary, the substantial increase of proline content with slight increase of SOD activity is noted in 'Orlik' and 'Wealthy'. On the basis of obtained data it is concluded that 'Imrus' and 'Veteran' have physiological and biochemical indications of resistance to hyperthermia effect.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА
супероксиддисмутаза, перекисное окисление липидов, пролин, гипертермия, устойчивость, яблоня.
KEY WORDS
superoxide dismutase, lipid peroxidation, proline, hyperthermia, resistance, apple.
В последние годы период летней вегетации сопровождается жесткими погодными аномалиями: продолжительная гипертермия и засуха. Многие сорта, отселектированные ранее, в годы относительной стабильности климата, реагируют на новые по срокам наступления и интенсивности абиотические стрессы резким снижением биологической продуктивности. В связи с этим, в ходе селекционной работы существует необходимость создания генотипов, сочетающих комплекс хозяйственно ценных признаков с высоким адаптационным потенциалом. При этом необходимо обращать внимание на механизмы
действия стрессовых факторов на растительные организмы, что без изучения физиолого-биохимических процессов сделать невозможно. Перспективным направлением является определение четко выраженных физиолого-биохимических реакций растений в ответ на искусственно-моделированное стрессовое воздействие.
Как известно, реакции растений на изменившиеся условия среды являются комплексными, включающими изменения биохимических и физиологических процессов, и в основном эти изменения, как правило, носят неспецифический характер [1]. Одной из таких неспецифических реакций на неблагоприятные воздействия, следует отнести изменение свойств мембран, что связано с перестройками в их структуре. Это в значительной мере касается липидов. Наблюдаются сдвиги в соотношении различных групп жирных кислот, изменяется степень их ненасыщенности, возрастает уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) [2]. Согласно литературным данным, независимо от вида растений в условиях действия различных стрессоров наблюдается развитие ПОЛ, что нарушает целостность клеток и снижает их функциональность, вплоть до гибели [3,4.]. Об интенсивности перекисного окисления липидов мембран можно судить по ряду образующихся при этом веществ: гидроперекиси, малоновый диальдегид, диеновые конъюгаты и др. [5].
Ограничение процессов окисления и поддержание структурно-функционального состояния мембран в основном осуществляется за счет работы антиоксидантной системы защиты: супероксиддисмутаза, пероксидаза, каталаза, полифенолоксидаза и др. [6]. Также мощным защитным механизмом, позволяющим растению адаптироваться к стрессу, является аккумуляция низкомолекулярных антиоксидантов, называемых еще совместными осмолитами: пролин, глутатион, аланин, бетаин, глицин-бетаин и др. [7,8]. В частности, при засухе пролин не только понижает водный потенциал клеток, восстанавливая тем самым водоснабжение, но и защищает ферменты от инактивации, обеспечивает целостность структурных белков, сохраняет функциональную активность клеточных мембран [9].
Цель исследований состояла в проведении оценки генотипов яблони на устойчивость к гипертермии на основе активности антиоксидантной системы защиты и интенсивности процессов липопероксидации.
Объектами изучения служили четыре генотипа яблони: Имрус, Ветеран, Орлик, Уэлси. Условия гипертермии создавали, помещая однолетние побеги указанных сортов в термостат Binder BD23 на один час при температуре +50°С. Контролем служили побеги растений без воздействия стресса. Для анализа отбирали пятые листья с апикальной части побега.
Содержание пролина определяли по реакции с нингидриновым реактивом [10]. Значение содержания аминокислоты рассчитывали с помощью калибровочной кривой, построенной для чистого пролина при длине волны А=520нм. Содержание пролина выражали в мг на кг сырой массы. Для анализа интенсивности перекисного окисления липидов определяли количество малонового диальдегида. Для этого использовали качественную реакцию с тиобарбитуровой кислотой [11]. Расчет проводили с использованием молярного коэффициента экстинции (1,56-105 М-1см-1) при длине волны А=535 нм. Содержание МДА выражали в мкМ/г сырой массы. Для определения активности супероксиддисмутазы использована методика с использованием нитросинего тетразолия [12].
В результате анализа по определению интенсивности ПОЛ мембран показано увеличение накопления в клетках малонового диальдегида, как конечного продукта липопероксидации. Согласно исследованиям других авторов увеличение ПОЛ мембран в условиях действия стресса происходит, как правило, за счет излишнего образования активных форм кислорода, которые инициируют свободно-радикальные процессы [4,13,14].
Наибольшую степень перекисного окисления мембранных липидов в условиях теплового шока имели генотипы Уэлси и Орлик. Содержание в листьях конечного продукта липопероксидации мембран - малонового диальдегида в этих сортах увеличивалось на 60 и 46%, соответственно, против бесстрессовых вариантов. Данные по изменению содержания малонового диальдегида представлены на рисунке 1.
1.8 1.6 § 1.4
(J
1 1.2
JS
О. 1.0
Д 0.8
§ 0.6
| 0.4
^ 0.2
5 0.0
I
□ Контроль
□ Гипертермия
i
Уэлси
Орлик Ветеран Имрус
Рисунок 1 - Содержание малонового диальдегида в листьях Malus domestica L
В то же время, в листьях растений яблони сортов Ветеран и Имрус количество МДА после часового воздействия повышенной температурой увеличивалось на 20 и 26%. Меньшее образование конечного продукта липопероксидации (МДА) у генотипов Имрус и Ветеран по сравнению с Орликом и Уэлси, возможно, связано с более интенсивным увеличением под воздействием стресса активности антиоксидантной системы защиты, ответственной за утилизацию активных форм кислорода. Анализ активности супероксиддисмутазы в листьях растений показал, что у генотипов Имрус и Ветеран, под влиянием гипертермии, активность СОД увеличилась в большей степени, чем у Уэлси и Орлика (рис.2). Так активность фермента в сортах Имрус и Ветеран под действием теплового шока по сравнению с контрольными вариантами увеличилась, соответственно, в 2 и 3 раза, тогда как у Орлика и Уэлси в 1.3 и 1,4 раза.
0.4
0.3
0.3
0.2
е
(J > 0.2
0.1
0.1
0.0
□ Контроль
□ Гипертермия
т Ш
Ветеран Имрус Уэлси Орлик
Рисунок 2 - Активность супероксиддимутазы (СОД) в листьях Malus domestica L
Более низкое увеличение значений СОД у Орлика и Уэлси, по-видимому, связано с частичным ингибированием активности данного фермента повышенной концентрацией АФК. При окислительном стрессе антиоксидантные ферменты могут инактивироваться высоким содержанием АФК и для восстановления их синтеза или работы требуется определенное время. В этом случае, на первый план выходят низкомолекулярные метаболиты и в частности пролин [8]. Так, среди совместимых метаболитов, аккумулирующихся в растениях при стрессах, только для пролина показан эффект «тушения» синглетного кислорода, образующегося в первые часы действия стрессора [15].
В наших исследованиях наибольшим накоплением аминокислоты пролин в условиях действия стресса характеризовались генотипы Уэлси и Орлик. Содержание пролина в данных сортах увеличилось на 43 и 70% по отношению к контролю, тогда как у Ветерана и
Имруса на 19,5 и 25%. Значительное увеличение пролина в сортах Уэлси и Орлик могут свидетельствовать о стрессовом состоянии растений, тогда как Ветеран и Имрус, по-видимому, еще не достигли «шокового» порога. Пролин под влиянием стресса накапливается, как правило, для нейтрализации активных форм кислорода [9]. Увеличивая биосинтез пролина, растение пытается уйти от воздействия стресса. Поэтому, чем интенсивней он накапливается, тем сильнее влияние стресса на организм. Исходя из этого, можно говорить о наличии некоторой устойчивости к гипертермии у генотипов Имрус и Ветеран (рис. 3).
Имеются также сведения, что при действии гипертермии пролин и его интермедиат (пирролин-5-карбоксилат) для растений токсичны [16].
0.6
0.5
0.4
0.3 -
0.2
0.1
0.0
1
□ Контроль
□ Гипертермия
Ветеран Имрус Уэлси Орлик
Рисунок 3 - Содержание свободного пролина в листьях Malus domestica L
В результате исследований по определению активности антиоксидантной системы и интенсивности процессов ПОЛ показано, что генотипы яблони Уэлси и Орлик обладают меньшей устойчивостью к действию теплового шока, чем Ветеран и Имрус. В связи с этим генотипы Имрус и Ветеран можно использовать в качестве доноров устойчивости при ведении селекции яблони на устойчивость к гипертермии.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Удовенко Г.В. Механизмы адаптации растений к стрессам / Г.В. Удовенко // Физиология и биохимия культурных растений. - 1979. - Т. 11. - №2. - С.99 - 107.
2. Mitteler, R. Oxidative Stress, Antioxidants, and Stress Tolerance / R. Mitteler // Trends Plant Sci., - 2002. - V.7. - P. 405 - 409.
3. Oliveira E. S. Implications of dealing with airborne substances and reactive oxygen species: what mammalian lungs, animals, and plants have to say? / E. S. Oliveira, J.T. Hancock, M. Hermes-Lima M. et al. // Integr. Compar., - Biology. - 2007. - Vol. 47. - P. 578591.
4. Курганова Л.Н. Прооксидантно-антиоксидантный статус хлоропластов гороха при действии стрессирующих абиотических факторов среды: 1. Продукция активных форм кислорода и липопероксидации / Л.Н. Курганова, И.В. Балалаева, А.П. Веселов, Ю.В. Синицына, ЕА. Васильева, М.И. Цыганова // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. - 2010. - № 2 (2). - С. 544-549.
5. Лукаткин А.С. О развитии повреждений у растений кукурузы при внезапном и постепенном охлаждении / А.С. Лукаткин // Сельскохозяйственная биология. - 2003. №5. - С. 63 - 68.
6. Blokhina O. Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress: a review / O. Blokhina, E. Virolainen, K.V. Fagerstedt // Ann. Bot. - 2003. - Vol. 91. - P.179-194.
7. Кения М.В. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе / М.В. Кения, А.И. Лукаш, Е.Г. Гуськов // Успехи современной биологии. - 1993. - Т.113. - №4. С. 456 - 471.
8. Mitteler, R. Oxidative Stress, Antioxidants, and Stress Tolerance / R. Mitteler // Trends Plant Sci. - 2002. - V.7. - P. 405 - 409.
9. Колупаев Ю.Е. Пролин: физиологические функции и регуляция содержания в растениях в стрессовых условиях / Ю. Е. Колупаев, А. А. Вайнер, Т. О. Ястреб // Вюник харювського нацюнального аграрного ушверситету серiя бюлогия. - 2014. - вип. 2 (32), - С. 6-22
10. Bates L. S. Rapid determination of free proline for water-stress studies /L.S Bates, R.P. Waldren and I.D. Teare // Plant and Soil. - 1973. - Vol. 39. - P. 205-207.
11. Стальная, И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты / И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили - В кн.: В.Н. Ореховича (ред.) Современные методы в биохимии. М.: Медицина. 1977. - С. 66 - 68.
12. Giannopolities C.N., Ries S.K. Superoxid dismutase. I. Occurrence in higher. / C.N. Giannopolities, S.K. Ries // Plant Physiol., - 1977. - V. 59. - P.309-314.
13. Лихачева А. В. Роль перекисного окисления липидов в регуляции систем поддержания клеточного гомеостаза у растений при стрессовых воздействиях: Диссертация ... кандидата биологических наук / А.В. Лихачева - Нижний Новгород. -2002. - 152 с.
14. Прудников П.С. Особенности действия гипертермии на гормональную систему и антиоксидантный статус Prunus armeniaca L. / П.С. Прудников, А.А. Гуляева // Селекция и сорторазведение садовых культур: сб.н.р. Т.2. Конкурентоспособные сорта и технологии для высокоэффективнного садоводства: материалы междунар. Науч.-практ. Конф., посвящ. 170-летию ВНИИСПК. Орел: ВНИИСПК. - 2015. - С.151-154.
15. Alia, S. Involvement of proline in protecting thylakoid membranes against free radical-induced photodamage / S. Alia, P.P. Saradhi, P. Mohanty. // J. Photochem. Photobiol. - 1997. -T. 38. - P. 253-257.
16. Кошкин Е.И. Физиология устойчивости сельскохозяйственных культур / Е.И. Кошкин. -М.: Дрофа. - 2010 - 638 с.
