CC BY
78
Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2011. Вып. 2. С. 315-324
Биология
УДК 581.17: 581.19: 581.52
Оценка устойчивости Betula pendula Roth. при произрастании на техногенно загрязненных территориях
А. Р. Гарифзянов, В. В. Иванищев, Е. Н. Музафаров
Аннотация. Приводятся результаты оценки устойчивости Betula pendula Roth., используемой для создания санитарно-защитных насаждений металлургических предприятий г. Тула по комплексу физиолого-биохимических показателей. Показано, что аккумуляция Zn, Cd, Mn и Ni листьями B. pendula сопряжена с развитием окислительного стресса, происходящим на фоне снижения количества низкомолекулярных метаболитов и увеличения активности гваяколовой пероксидазы и каталазы.
Ключевые слова: Betula pendula, устойчивость, фиторемедиация, поллютанты, активные формы кислорода, окислительный стресс, антиоксидантная система.
Введение
В настоящее время ремедиация промышленно загрязненных территорий является приоритетной задачей во многих странах вследствие рисков для здоровья человека и потребности расширения земельных участков, пригодных для жизни. Как известно, использование растений для ремедиации определяется скоростями накопления металлов и биомассы, а также зависит от глубины корневой системы [9]. В соответствии с этим перспективными становятся приемы фиторемедиации с помощью видов древесных растений [7].
Важным критерием в подборе видов для «зеленого строительства» является их устойчивость к поллютантам, а также способность аккумулировать загрязнители в большей степени [17]. При этом на фоне широкого распространения практики создания санитарно-защитных лесополос механизмы устойчивости растений к поллютантам и их адаптационный потенциал оказываются недостаточно исследованными. Это обуславливает необходимость проведения исследований физиологобиохимических механизмов, лежащих в основе устойчивости, используемых для озеленения видов, в частности, повсеместно внедренной в практику защитного лесоразведения Betula pendula Roth.
1. Методика эксперимента
Для исследования были выбраны 3 постоянные модельные площадки, 2 из которых располагаются в пределах санитарно-защитных насаждений (СЗН) крупнейших металлургических предприятий г. Тула: I точка пробоотбора — ОАО «Косогорский металлургический завод»; II точка пробоотбора — комплекс предприятий ОАО СП АК «Тулачермет», ОАО «Ванадий-Тулачермет», ОАО «Палема». Ранее проведенное исследование позволило установить в почвах санитарно-защитных насаждений превышение ПДК (или ОДК) по Mn (в 4,7 раза), Pb (в 1,5 раза) и Zn (в 2 раза) и фонового уровня по Fe, Mn, Ti, Sc, V, Cr, Co, Ni, Cu, Zn, Cd, Rb, Sr, Zr, Ba, Pb [3]. За условно контрольную (чистую или фоновую) зону была принята территория Центрального парка культуры и отдыха (ЦПКиО) им. П.П. Белоусова (контроль).
Листья B. pendula отбирали во второй декаде июля с ветвей 1-2 года жизни на расстоянии 2 - 3 м от поверхности грунта по периметру кроны деревьев типичного габитуса одного возраста. Содержание перекиси водорода оценивали по количеству образующегося окрашенного комплекса пероксида титана [15]. Степень перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли по методу, основанному на определении количества соединений, взаимодействующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-реагирующих соединений), в пересчете на малоновый диальдегид (МДА) [12]. Содержание фотосинтетических пигментов (хлорофиллов
a, b и каротиноидов) определяли спектрофотометрически в этанольных экстрактах [16]. Определение показателей водного обмена, содержания аскорбиновой кислоты и восстановленного глутатиона вели согласно общепринятым рекомендациям [4]. Содержание фенольных соединений оценивали спектрофотометрически в этанольных экстрактах: с реактивом Фолина-Дениса (сумма водорастворимых фенольных соединений) и 2%-ным спиртовым раствором хлорида алюминия (флавоноиды) [5]. Количество свободного пролина в листьях определяли по общепринятому методу L.S. Bates et al. [11]. Определение активности ферментов (гваяколовой пероксидазы и каталазы) проводили в фосфатно-буферных экстрактах по методам, описанным ранее [2].
Каждый опыт проводили в трех биологических по три аналитические повторности. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета прикладных компьютерных программ MS Excel 2003 и SigmaStat 3.1. В таблицах и на рисунках представлены средние арифметические значения определяемых величин и их стандартные ошибки (Р > 0,95). К полученным данным применен стандартный однофакторный дисперсионный анализ с использованием для оценки достоверности при множественном сравнении фактического значения ^-критерия Ньюмена-Кейлся (критическое значение критерия при уровне значимости 0,05 в нашем исследовании равнялось 3,461).
2. Результаты и обсуждение
2.1. Индукция окислительного стресса поллютантами.
Произрастание древесных растений в условиях повышенного содержания тяжелых металлов обуславливает процессы их сорбции, перераспределения, а также аккумуляции в различных тканях и органах. Ранее проведенное исследование показало, что в листьях B. pendula в значительном количестве аккумулируются Zn (86-180 мг/кг сухого вещества), Cd (0,14-0,15 мг/кг), Mn (240-340 мг/кг) и Ni (5,0-7,2 мг/кг) [3]. При этом аккумуляция токсичных тяжелых металлов сопряжена с развитием широкого спектра индуцированных изменений, затрагивающих разные уровни организации растения.
Универсальной стресс-реакцией растений является интенсивная генерация в клетках активных форм кислорода (АФК), в том числе относительно стабильной и способной диффундировать от места образования перекиси водорода [18]. Проведенное исследование показало, что в листьях B. pendula, произрастающей в условиях техногенного загрязнения, содержание H2O2 было в 1,4-1,6 раз больше, чем в контроле (рис. 1).
Рис. 1. Содержание перекиси водорода в листьях B. pendula
Количество МДА, являющегося продуктом перекисного окисления (ПОЛ) фосфолипидов мембран, в листьях B. pendula также было больше контрольного значения в 2 раза (рис. 2). Полученные результаты свидетельствуют о том, что в листьях B. pendula развивается окислительный стресс, который, как известно, является мощным фактором повреждения
растительного организма, выражающегося в нарушении интенсивности и направленности многих метаболических путей.
Рис. 2. Содержание малонового диальдегида в листьях B. pendula
При этом одним из наиболее чувствительных к индуцированному окислительному стрессу аппаратов растений является фотосинтетический. Проведенное исследование (табл. 1) показало, что в условиях промышленного загрязнения содержание хлорофилла а, Ь и каротиноидов в листьях B. pendula было ниже, чем в контроле в 2-2,4 раза, 23% и 25-30% соответственно. В настоящее время хорошо известно, что по своим функциональным свойствам молекулы пигментов различаются, поэтому критичным для поддержания нормального уровня фотосинтеза и сопряженных энергетических процессов является соотношение разных фотосинтетических пигментов [8].
Проведенное исследование показало, что соотношение количества двух форм хлорофилла («Хла/ХлЬ») в листьях B. pendula, а также количества общего хлорофилла (Хл(а + b)) и содержания каротиноидов в контроле было в пределах 2,5 и 5,54 соответственно. Такое соотношение фотосинтетических пигментов является типичным для здоровых, хорошо функционирующих зеленых растений [10]. Однако в условиях техногенного загрязнения соотношение пигментов (табл. 1) в листьях B. pendula оказывалось ниже контрольного значения: «Хла/ХлЬ» — в 1,5 раза, «Хл(а + Ь)/Кар» — на 16-20%. Разбалансировка между количеством фотосинтетических пигментов в листьях свидетельствует о неблагоприятных изменениях активности фотосинтетического аппарата B. pendula.
Таблица 1
Показатели поврежденности B. pendula в условиях индуцированного поллютантами окислительного стресса
о tJ о о ч р бК о а о - Содержание пигментов, мг/г свежей массы Показатели водного обмена
Хл a Хл b Кар Относитель- ное содержание воды, % Осмотичес- кий потенциал, МПа ±а Интенсивность транспирации, мг/г*час ±а
Контроль 1,89± ±0,23 0,77± ±0,07 0,48± ±0,09 77,2 -1,21±0,10 234±15
I 0,96± ±0,13 0,59± ±0,09 0,35± ±0,09 64,8 -1,83±0,14 432±17
II ± , 0 00 1 8 0,57± ±0,06 0,32± ±0,07 65,7 -1,68±0,19 404±13
Поллютанты в значительной мере влияют и на другие сопряженные энергетические процессы, в том числе водный обмен. Проведенное нами исследование показало, что под влиянием промышленного загрязнения происходило изменение основных показателей водного обмена B. pendula (см. табл. 1). В частности, в листьях величины содержания воды и осмотического потенциала клеточного сока были меньшими, чем в контроле, в среднем на 15% и 40% соответственно.
Снижение осмотического потенциала клеточного сока свидетельствует о поддержание высокой водопоглотительной способности клеток. Однако высокая водопоглотительная способность не позволяет удерживать в тканях воду, что подтверждается снижением относительного содержания воды. Причина этого, как показало исследование, кроется в увеличении интенсивности транспирации. В частности, было установлено увеличение интенсивности транспирации в техногенно загрязненной среде в 1,8 раз по сравнению с контролем (см. табл. 1). Увеличение интенсивности транспирации, происходящее на фоне снижения относительного содержания воды и осмотического потенциала клеточного сока, может быть связано с повреждением механизмов устьичной и внеустьичной регулировки транспирации, что в свою очередь обусловлено накоплением в клетках
B. pendula избыточных количеств перекиси водорода и интенсификацией ПОЛ. В частности, прослеживается тесная взаимосвязь между относительным содержанием воды в тканях B. pendula и интенсивностью ПОЛ (по накоплению МДА), которая подтверждается отрицательным коэффициентом корреляции (r), равным -0,94.
2.2. Антиоксидантная система B. pendula в стрессовых условиях. Известно, что в стрессовых условиях судьба растений зависит, с одной стороны от силы стрессового воздействия, с другой — от устойчивости
растений к данному виду стрессора. Важнейшим механизмом устойчивости в условиях промышленного загрязнения является активизация биохимической многоуровневой и многокомпонентной системы антиоксидантной защиты (АОС). Важнейшим компонентом АОС являются низкомолекулярные протекторные метаболиты, в ряде случаев способные более эффективно осуществлять защиту организма от образующихся АФК [12].
Проведенное исследование показало, что воздействие поллютантов приводит к изменению количества накопленных в листьях низкомолекулярных соединений, проявляющих антиоксидантные свойства (табл. 2). В частности показано, что в листьях B. pendula, произрастающей в условиях промышленного загрязнения, содержание аскорбиновой кислоты и суммы водорастворимых фенольных соединений было ниже контрольного значения на 26-37%, а флавоноидов — в 1,5-2,6 раз. Одновременно с этим количество восстановленного глутатиона в листьях B. pendula I точки пробоотбора оказалось большим, чем в контроле в 1,5 раза.
Таблица 2
Компоненты антиоксидантной системы B. pendula в условиях промышленного загрязнения
Точка пробоот- бора Содержание Активность, мкмоль/мин*г
аскорби- новой кислоты, мг/г свежей массы глута- тиона, мг/г свежей массы суммы феноль- ных соединений, мг/г сухой массы флавоноидов, мг/г сухой массы гваяко- ловой перокси- дазы каталазы
Контроль 1,43±0,10 0,87±0,06 33,1±0,6 32,4±0,2 0,009± ±0,003 85±4
I 1,05±0,08 1,27±0,06 18,9±0,6 12,6±0,5 0,044± ±0,027 107±3
II 0,90±0,07 0,82±0,07 24,6±0,9 21,5±0,3 0,054± ±0,006 116±3
Кроме того, в листьях B. pendula, произрастающей на территории I точки пробоотбора, содержалось в 2 раза больше пролина, чем в контроле (рис. 3). Однако, поскольку аккумуляция метаболита не способствовала снижению негативных проявлений окислительного стресса (накопление в листьях H2O2 и МДА, нарушения в работе фотосинтетического аппарата и водного обмена (табл. 1)), то можно предположить, что для B. pendula пролин не вносит существенного вклада в формирование общего антиоксидантного потенциала.
Рис. 3. Содержание пролина в листьях B. pendula
Вл.В. Кузнецов и Н.И. Шевякова [6] высказали точку зрения, что защитные эффекты пролина при стрессе могут быть связаны не столько с его прямым антиоксидантным действием, сколько со способностью уменьшать осмотические и токсические эффекты стрессоров. Данное утверждение получило свое подтверждение. В частности, был обнаружен высокий отрицательный коэффициент корреляции между величиной осмотического потенциала и концентрацией пролина в листьях B. pendula, равный -0,73.
Несмотря на значительную роль низкомолекулярной АОС при стрессе специфическими молекулами, эволюционно сформированными для «тушения» АФК, прежде всего, супероксидного анион-радикала и, особенно, перекиси водорода, являются антиоксидантные ферменты. Во многих публикациях показана корреляция между устойчивостью растений к стрессам различной природы и эффективностью работы антиоксидантных ферментов [13]. Проведенное исследование показало, что в условиях техногенного загрязнения в листьях B. pendula происходила активация гваяколовой пероксидазы и каталазы (табл. 2). В частности, активность гваяколовой пероксидазы была выше в 5-6 раз, а каталазы — на 25% по сравнению с контролем. При этом повышение активности ферментов и интенсивность окислительного стресса в клетках B. pendula соотносятся неоднозначно.
Несмотря на кратное увеличение активности пероксидазы и каталазы в клетках B. pendula интенсивно идут процессы ПОЛ (рис. 1, 2). Это приводит к нарушениям в работе фотосинтетического аппарата и процессов водного обмена (табл. 1). В соответствии с этим можно предположить, что даже увеличение активности антиоксидантных ферментов не позволяет B. pendula
справиться с возрастающим количеством образующейся перекиси водорода (см. рис. 1). Возможно, это связано с недостатком восстанавливающих субстратов, в частности, флавоноидов (для гваяколовой пероксидазы), содержание которых в клетках было ниже в условиях промышленного загрязнения, чем в контроле (см. табл. 2). Содержание флавоноидов в данном случае оказывается критическим звеном для использования в реакции восстановления перекиси водорода пероксидазой.
Резюмируя вышеизложенное, можно заключить, что, аккумуляция Zn, Cd, Mn и Ni листьями B. péndula сопряжена с развитием в клетках окислительного стресса, сопровождающегося генерацией избыточных количеств перекиси водорода и индицированных ее процессов ПОЛ, снижением количества и изменением соотношения основных групп фотосинтетических пигментов, нарушениями водного обмена. Данные процессы происходят на фоне снижения количества низкомолекулярных метаболитов и увеличения активности гваяколовой пероксидазы и каталазы.
Заключение
Принято считать, что устойчивость — это, в значительной степени, потенциальное свойство растения, и оно может быть реализовано в полной мере в экстремальных ситуациях [1]. Разумно отдельные виды устойчивости рассматривать как частные проявления общих принципов надежности живой системы. Однако при выделении физиолого-биохимических критериев устойчивости возникает ряд проблем. В частности, следует учитывать, что виды, произрастающие в условиях действия стрессовых факторов, помимо защитно-приспособительных признаков проявляют и признаки повреждения. В рамках данного исследования проведена комплексная оценка ответных физиолого-биохимических реакций B. péndula, используемой для создания санитарно-защитных насаждений предприятий металлургической промышленности. При этом изучен комплекс признаков, включающий показатели поврежденности вида в условиях загрязнения, а также защитно-приспособительные реакции на уровне энзиматических и неэнзиматических компонентов АОС.
Список литературы
1. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Чернавский Д.С. Стресс у растений (Биофизический подход). М.: МГУ, 1993. 144 с.
2. Сравнительный анализ активности компонентов антиоксидантной системы древесных растений в условиях техногенного стресса / А.Р. Гарифзянов [и др.] // Изв. ТулГУ. Естественные науки. 2009. Вып.1. С.45-48.
3. Оценка возможности использования древесных растений для биоиндикации и биомониторинга выбросов предприятий металлургической промышленности / С.В. Горелова [и др.] // Проблемы биогеохимии и геохимической экологии. 2010. № 1(12). С.155-163.
4. Грязнов В.П. Руководство к лабораторным и экспериментальным работам по физиологии растений. Белгород: БелГУ, 2006. 120 с.
5. Запрометов М.Н. Фенольные соединения и методы их исследования // Биохимические методы в физиологии растений. М., 1971. С.185—197.
6. Кузнецов Вл.В, Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция // Физиология растений. 1999. Т.46. №4. С.321-336.
7. Кулагин А.А., Шагиева Ю.А. Древесные растения и биологическая консервация промышленных загрязнителей. М.: Наука, 2005. 190 с.
8. Попова И.А., Маслова Т.Г., Попова О.Ф. Особенности пигментного аппарата растений различных ботанико-географических зон. Эколого-физиологические исследования фотосинтеза и дыхания растений. Л.: Наука, 1989. С.115—129.
9. Пра,сад М.Н. Практическое использование растений для восстановления экосистем, загрязненных металлами // Физиология растений. 2003. Т.50, №5.
С.764-780.
10. Сариева Г.Е., Кенжебаева С.С., Лихтенталер Х.К. Адаптационный потенциал фотосинтеза у сортов пшеницы с признаком «свернутый лист» при действии высокой температуры // Физиология растений. 2010. Т.57, №1. С.32-41.
11. Bates L.S., Waldren R.P., TeareI.D. Rapid Determination of Free Proline for Water Stress Studies // Plant Soil. 1973. V.39. P.205-207.
12. Blokhina O., Virolainen E, Fagerstedt K.V. Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivative stress: a review // Annals of Botany. 2003. V.91. P.179-194.
13. Comparative Lipid Peroxidation, Antioxidant Defense Systems and Proline Content in Roots of Two Rice Cultivars Differing in Salt Tolerance / W.B. Lee [et al.] // Environ. Exp. Bot. 2005. V.53. P.247-257.
14. Heath R.L., Packer L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts. I. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation // Arch. Biochem. Biophys. 1968. V.125(1). P.189-198.
15. Kumar G.N., Knowles N.R. Changes in Lipid Peroxidation and Lipolytic and Free-Radical Scavenging Enzyme during Aging and Sprouting of Potato (Solanum tuberosum L.) Seed-Tubers // Plant Physiol. 1993. V.102. P.115-124.
16. Lichtentaller H.K., Welburn A.R. Determinations of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvents // Biochem. Soc. Trans. 1983. V.11, №6. P.591-592.
17. Markert B. Plants as biomonitors: indicators for heavy metals in the terrestrial environment. Weinheim, 1993. P.12-16.
18. Scandalios J.G. The rise of ROS // Trends Biochem. Sci. 2002. V.27. P.483-486.
Гарифзянов Андрей Рузильевич (Garifzyanov86@yandex.ru), к.б.н., зам.
декана, факультет естественных наук, физической культуры и туризма,
Тульский государственный педагогический университет им. Л.Н. Толстого.
Иванищев Виктор Васильевич (avdey_vv@mail.ru), д.б.н., профессор,
зав. кафедрой, кафедра ботаники и технологии растениеводства, Тульский
государственный педагогический университет им. Л.Н. Толстого.
Музафаров Евгений Николаевич (enmuzafarov@mail.ru), д.б.н., профессор, Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино.
Estimation of stability Betula pendula Roth. at growth in industrially polluted territories
A.R. Garifzyanov, V. V. Ivanishchev, E. N. Muzafarov
Abstract. In article results of stability Betula pendula Roth. an estimation are resulted, used for creation of the metallurgical enterprises Tula sanitary-protective plantings, on a complex of physiological and biochemical indicators. In work it is shown that, despite high accumulative ability concerning Zn, Cd, Mn and Ni, in leaves B. pendula the oxidizing stress accompanied by superfluous quantities H2O2 generation and its displayed processes oxidation of lipids. The given processes occur against decrease in quantity low-molecular antioxidizing metabolites and activity increase peroxidases and catalases.
Keywords: Betula pendula, phytoremediation, stability, pollutants, active forms of oxygen, oxidizing stress, antioxidizing system.
Garifzyanov Andrey (Garifzyanov86@yandex.ru), candidate of biological sciences, assistant to the dean, faculty of natural sciences, physical training and tourism , Tolstoy Tula State Pedagogical University.
Ivanishchev Victor (avdey_vv@mail.ru), doctor of biological sciences, professor, head of department, department of botany and plant growing, Tolstoy Tula State Pedagogical University.
Muzafarov Eugenie (enmuzafarov@mail.ru), doctor of biological sciences, professor, Institute of basic biological problems of RAS, Pushchino.
Поступила 07.06.2011
