CC BY
10
ОЦЕНКА УРОВНЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК И ЭФФЕКТИВНОСТИ СИСТЕМ РЕПАРАЦИИ ДНК ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ РАЗЛИЧНЫХ ДОЗ ОЗОНА IN VITRO
А.Б. Гапеев1,2, Е.С. Жукова3, Т.Г. Щербатюк2,3,4
1Институт биофизики клетки Российской академии наук - обособленное подразделение ФГБУН «Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук», Пущино Московской области
ГОУ ВО Московской области «Московский государственный областной университет», Мытищи Московской области
ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт гигиены и профпатологии» Роспотребнадзора, Нижний Новгород
4ФГБОУ ВО «Пущинский государственный естественно-научный институт», Пущино Московской области
Возникающие при использовании медицинского озона свободные радикалы способны нанести определенный вред нормальным тканям организма. В связи с этим актуальной является оценка повреждений биологических макромолекул, в частности ДНК, при действии различных доз озона. Цель: определение доз озона, способных оказывать генотоксическое действие на различные типы нормальных и опухолевых клеток, оценка эффективности озона по генотоксическому действию и репарации ДНК. Методы: Эксперименты выполнены с использованием метода современной генотоксикологии «комета-теста» (метод ДНК-комет, Comet Assay), уникального аппаратно-программного комплекса "Комет Эксперт" для измерения флуоресценции ДНК нуклеоида индивидуальных клеток и лейкоцитов периферической крови интактных лабораторных животных (крысы) и животных-опухоленосителей, а также культивируемых клеток лейкемии человека HL-60. Исследованы уровни спонтанных и индуцированных повреждений ДНК и эффективность систем репарации ДНК при воздействии различных концентраций озона в озонированном физиологическом растворе in vitro. Результаты: Установлено, что уровень повреждений ДНК практически линейно зависит от концентрации озона в озоно-кислородной смеси для всех типов использованных клеток. Оптимальная длительность инкубации клеток с озонированным физиологическим раствором in vitro для достижения значимого генотоксического эффекта составляет около 20 мин. Индекс репарации ДНК в лейкоцитах периферической крови животных-опухоленосителей снижается при
действии озона в концентрации 1 мг/л. Заключение: Показано, что озон в концентрациях до 1 мг/л в озоно-кислородной смеси не обладает специфическим действием и дозозависимо увеличивает уровень повреждений ДНК в различных клетках. Оптимальная длительность инкубации клеток с озонированным физиологическим раствором in vitro, вероятно, определяется временем жизни озона и продуктов озонолиза. Эффективность систем репарации ДНК при действии озона в концентрации 1 мг/л in vitro в лейкоцитах крови животных -опухоленосителей оказывается сниженной приблизительно на 30% по сравнению с лейкоцитами крови интактных животных.
Ключевые слова: повреждения ДНК, репарация ДНК, метод ДНК-комет, озонотерапия, озон
Abstract
Free radicals arising from the use of medical ozone can cause some damage to normal tissues. In this regard, the assessment of damage to biological macromolecules, in particular to DNA, under the action of various doses of ozone is relevant. Purposes: To determine the ozone doses that are capable of exerting a genotoxic effect on various types of normal and tumor cells, to assess the effecacy of ozone in terms of genotoxic action and DNA repair. Methods: Experiments were performed using the modern genotoxicology method Comet Assay, an unique hardware-software complex "Comet Expert" for measuring the fluorescence of DNA nucleoids of individual cells and peripheral blood leukocytes of intact laboratory animals (rats) and tumor-bearing animals, as well as cultured human leukemia cells HL-60. The levels of spontaneous and induced DNA damage and the efficacy of DNA repair systems under the influence of various concentrations of ozone in an ozonized saline solution in vitro were investigated. Results: It was found that the level of DNA damage for all types of cells used almost linearly depends on the concentration of ozone in the ozone-oxygen mixture. The optimal duration of in vitro incubation of cells with ozonized saline solution to achieve a significant genotoxic effect is about 20 minutes. The DNA repair index in peripheral blood leukocytes of tumor-bearing animals decreases when treated with ozone at a concentration of 1 mg/L. Conclusion: It has been shown that ozone in concentrations up to 1 mg/L in an ozone-oxygen mixture does not have a specific effect and dose-dependently increases the level of DNA damage in various cells. The optimal duration of in vitro incubation of cells with ozonized saline is probably determined by the lifetime of ozone and ozonolysis products. The efficacy of DNA repair systems under the action of ozone at a concentration of 1 mg/L in vitro in the blood leukocytes of tumor-bearing animals is reduced by approximately 30% compared to the blood leukocytes of intact animals.
Key words: DNA damage, DNA repair, comet assay, ozone therapy, ozone
В настоящее время не ослабевает интерес к физиологической роли свободных радикалов, их значению в опухолевой трансформации клеток и поиску методов управления интенсивностью и направленностью окислительных процессов при опухолевом росте [1]. В экспериментальных работах основоположников свободнорадикальной биологии было показано, что
концентрация активных форм кислорода (АФК) и активность процессов, инициируемых ими, при развитии и росте злокачественных новообразований как в тканях опухолей, так и в тканях организма носят фазный характер [2]. По мере прогрессии бластотрансформированные клетки становятся более устойчивыми к АФК и другим свободным радикалам по сравнению с окружающими их нормальными клетками. Это дает опухолевым клеткам преимущество в выживании в условиях микроокружения с большим содержанием продуктов гибнущих интактных клеток [2].
Использование озона в высоких концентрациях при интра- и паратуморальном введении может приводить к регрессии опухоли. Радикалы кислорода являются слабыми инициаторами процесса трансформации нормальных клеток в опухолевые, но достаточно сильными промоторами этого процесса [3]. Комбинированные экспериментальные схемы озонотерапии с ионизирующим излучением [4] и химиопрепаратами повышают эффективность противоопухолевой терапии [5]. Однако действие озонированного физиологического раствора (ОФР) избирательно в зависимости от срока роста опухоли и концентрации озона [4]. На этом основании озонотерапия злокачественных новообразований должна пройти эшелонированный контроль доклинических испытаний. Терапевтическое окно любого противоопухолевого подхода определяется генотоксическим эффектом в отношении нормальных клеток. В связи с этим цель исследования состояла в определении доз озона, способных оказывать генотоксическое действие на различные типы нормальных и опухолевых клеток in vitro.
Материалы и методы
Эксперименты проведены с применением уникального аппаратно-программного комплекса "Комет Эксперт" (ООО "ГенЭксперт", г.Пущино Московской обл.) для измерения флуоресценции ДНК нуклеоида индивидуальных клеток. Экспериментальная установка снабжена приспособлениями для приготовления агарозных слайдов [6], лизиса клеток, электрофореза индивидуальных клеток в геле агарозы (камера SE-1/S-1N, Хеликон, Москва) и твердотельными термостатами (Biosan CH-100/CH-1, Латвия). Видео изображения "комет" фиксируются с помощью высокочувствительных цифровых камер (WAT-902B, LCL-902HS, Watec, Япония) и обрабатываются с применением специализированных компьютерных программ [7]. Разработанная методика проведения анализов позволяет получать статистически значимые результаты на микроколичествах цельной крови (1-5 мкл). Применение высокочувствительных модификаций "комета-теста" позволяет определять характер изменений состояния хроматина (конформационные изменения нуклеоида, разрывы молекулы ДНК и щелочелабильные сайты), а также скорость репарации ДНК в различных условиях.
Для оценки уровня повреждений ДНК в лейкоцитах периферической крови интактных крыс, крыс-опухоленосителей и в культивируемых клетках HL-60 после воздействия озона in vitro с различными концентрациями (инкубация в течение 10 мин при 4оС) определяли уровень спонтанных и индуцированных
повреждений ДНК [8]. Лабораторные крысы содержались в стандартных условиях вивария ad libitum и выводились из эксперимента декапитацией. Все манипуляции проводились с соблюдением этических принципов и рекомендаций.
ОФР получали путем барботирования изотонического 0,9% раствора хлорида натрия озоно-кислородной смесью, которую производили из медицинского сверхчистого кислорода с помощью озонатора «ТЕОЗОН» (РФЯЦ-ВНИИЭФ, г. Саров, Россия) [9].
Все эксперименты проведены по протоколу "слепого контроля", когда экспериментатор, проводивший измерения, не знал, какие воздействия были использованы.
Статистический анализ данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента (p < 0.05).
Результаты и их обсуждение
Обнаружено, что чувствительность различных клеток (лейкоциты периферической крови интактных крыс и крыс-опухоленосителей, культивируемые клетки лейкемии человека HL-60) при действии ОФР in vitro не различается (табл.1, рис.1). Уровень повреждений ДНК практически линейно зависел от концентрации озона в озоно-кислородной смеси для всех типов использованных клеток (рис.1). Однако повышенный уровень спонтанных повреждений ДНК в культивируемых клетках HL-60 и в лейкоцитах крови опухоленосителей определяет более высокий уровень повреждений ДНК при действии озона в различных концентрациях (табл.1). Таким образом, воздействие ОФР с концентрациями озона в озоно-кислородной смеси в диапазоне до 1 мг/л не обладает специфическим действием, дозозависимо увеличивает уровень повреждений ДНК в различных клетках.
Таблица 1. Уровень повреждений ДНК в лейкоцитах крови интактных крыс и животных-опухоленосителей и в культивируемых клетках HL-60 после воздействия озона in vitro с различными концентрациями в течение 10 мин __при 4оС__
Концентрация озона, мкг/л Лейкоциты крови интактных крыс Лейкоциты крови животных-опухоленосителей Культивируемые клетки HL-60
0 3.4 ± 0.5 5.4 ± 0.3 4.3 ± 0.4
300 5.5 ± 0.4* 7.8 ± 0.9* 6.5 ± 0.5*
500 7.0 ± 0.5* 9.0 ± 0.7* 8.3 ± 0.6*
1000 10.7 ± 1.0* 12.0 ± 1.0* 11.3 ± 0.8*
Примечание. Представлены средние значения и величины стандартных ошибок. * р < 0.02 - достоверные отличия по сравнению с уровнем спонтанных повреждений ДНК по /-критерию Стьюдента (я>7).
.а
I-
(D ^
О ^
(D I-
О
о ш
_х
ш ^
X
d
(D S X
СО
*
(D О
О
14
12 -
10
8 -
6 -
4
2
Интактные Опухоленосители
0
200
400
600
800
1000
Концентрация озона в озоно-кислородной смеси, мкг/л
Рис. 1. Зависимость уровня повреждений ДНК в лейкоцитах крови интактных крыс и животных-опухоленосителей и в культивируемых клетках HL-60 от концентрации озона в ОФР (инкубация in vitro в течение 10 мин при 4оС). Представлены средние значения и величины стандартных ошибок. * p < 0.02 -достоверные отличия по сравнению с уровнем спонтанных повреждений ДНК по
/-критерию Стьюдента («>7)
*
Принимая во внимание различное время жизни озона в озонированном изотоническом 0.9% растворе хлорида натрия, исследовали уровень повреждений ДНК в лейкоцитах крови интактных крыс в зависимости от длительности инкубации клеток in vitro в присутствии озона в концентрации 300 мкг/л при 4оС. Было показано, что уровень повреждений ДНК в лейкоцитах крови крыс растет с увеличением длительности инкубации (табл.2, рис.2). Следует отметить нелинейный рост зависимости представленного показателя от длительности инкубации, который, вероятно связан с уменьшением концентрации озона в озоно-кислородной смеси при инкубации более 20 мин. Таким образом, проведенные исследования показали, что оптимальный длительностью инкубации клеток с ОФР in vitro для достижения значимого генотоксического эффекта является время до 20 мин, что, вероятно, связано со временем жизни озона и продуктов озонолиза.
Таблица 2. Уровень повреждений ДНК в лейкоцитах крови интактных крыс при
различном времени инкубации клеток in vitro в присутствии озона в _концентрации 300 мкг/л при 4оС_
Длительность инкубации, мин Содержание ДНК в «хвосте кометы», %
0 3.4 ± 0.5
10 5.5 ± 0.4*
20 7.4 ± 0.9*
30 8.4 ± 1.2*
Примечание. * р < 0.01 - достоверные отличия по сравнению с уровнем спонтанных повреждений ДНК по /-критерию Стьюдента (и>7)
.о
I-
(D ^
О ^
Q) I-
О О ш
_х
ш ^
X
d
(D S X
СО
*
а.
(D
о О
10
9
8
6
5
4
3
2
0
10
20
30
Длительность инкубации клеток в присутствии озона, мин
Рис. 2. Зависимость уровня повреждений ДНК в лейкоцитах крови интактных крыс от длительности инкубации клеток in vitro в присутствии озона в концентрации 300 мкг/л при 4оС. * p < 0.01 - достоверные отличия по сравнению с уровнем спонтанных повреждений ДНК по /-критерию Стьюдента (и>7)
7
Отдельной задачей являлась оценка репарации ДНК в различных клетках при действии ОФР in vitro. В ходе проведенных исследований было показано, что эффективность систем репарации ДНК совпадает в лейкоцитах периферической крови интактных крыс и культивируемых клетках HL-60 (табл.3), но оказывается сниженной приблизительно на 30% при действии озона в концентрации 1 мг/л в лейкоцитах периферической крови животных-опухоленосителей. Наблюдаемый
эффект, вероятно, связан со снижением активности ферментов репарации ДНК в лейкоцитах крови животных-опухоленосителей.
Таблица 3. Оценка эффективности систем репарации ДНК в лейкоцитах крови интактных крыс и животных-опухоленосителей и в культивируемых клетках HL-60 после воздействия озона in vitro с различными концентрациями в течение 10 мин при 4оС и дополнительной инкубации клеток в физиологическом растворе в _течение 15 мин при 37оС_
Лейкоциты крови Лейкоциты крови Культивируемые
интактных крыс животных- клетки HL-60
опухоленосителей
Концент Инду После Индек Инду После Индек Инду После Индек
рация ци- инкуб с ци- инкуб с ци- инкуб с
озона, рован ации репар рован ации репар рован ации репар
мкг/л ные ации ные ации ные ации
300 5.5 ± 4.6 ± 0.180 7.8 ± 6.5 ± 0.165 6.5 ± 5.3 ± 0.185
0.4 0.6 0.9 0.7 0.5 0.4
500 7.0 ± 5.8 ± 0.258 9.0 ± 7.5 ± 0.169 8.3 ± 6.5 ± 0.217
0.5 0.4* 0.7 0.6 0.6 0.5*
1000 10.7 7.4 ± 0.306 12.0 9.5 ± 0.208л 11.3 8.0 ± 0.292
± 1.0 0.6* ± 1.0 0.8 ± 0.8 0.7*
Примечание. Представлены средние значения и величины стандартных ошибок. * p < 0.02 - достоверные отличия по сравнению с уровнем индуцированных повреждений ДНК, Аp < 0.05 - достоверные отличия по сравнению с интактными животными по /-критерию Стьюдента (я>7).
Заключение
Таким образом, показано, что озон в концентрациях до 1 мг/л в озоно-кислородной смеси не обладает специфическим действием и дозозависимо увеличивает уровень повреждений ДНК в различных клетках. Оптимальная длительность инкубации клеток с ОФР in vitro для достижения значимого генотоксического эффекта составляет 20 мин, что, вероятно, связано с временем жизни озона и продуктов озонолиза. Эффективность систем репарации ДНК при действии озона в концентрации 1 мг/л in vitro в лейкоцитах крови животных-опухоленосителей оказывается сниженной приблизительно на 30% по сравнению с лейкоцитами крови интактных животных.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 19-0200667).
Список литературы
1. Щербатюк Т.Г., Жукова (Плеханова) Е.С., Никитина Ю.В., Гапеев А.Б. Окислительная модификация белков в тканях крыс при опухолевом росте в условиях озоно-фотодинамического воздействия // Биофизика. 2020. Т. 65, № 2. С. 367-375. DOI: 10.31857/S0006302920020209 DOI: 10.1134/S0006350920020219
2. Эмануэль НМ. Химическая и биологическая кинетика. - М.:Наука, 2006.
3. Сидорик Е.П., Баглей Е.А., Данко М.И. Биохемилюминесценция клеток при опухолевом процессе. Киев: Наукова думка; 1989
4. Щербатюк Т.Г. Озонотерапия злокачественных новообразований: за и против. // Современные технологии в медицине. 2003. №1. С. 52-56.
5. Патент РФ на изобретение №2361590/24.05.2007. Бюл. №20. Щербатюк Т.Г., Селемир В.Д., Клинцова Е.С. Способ повышения противоопухолевого эффекта химиотерапии. Доступно по: https://www.elibrary.ru/download/elibrary_37687829_39051644.pdf. Ссылка активна на 06.10.2020.
6. Патент РФ на изобретение №2558229С2/ 27.07.15. Бюл. №21. Сирота Н.П., Гапеев А.Б. Набор и способ для приготовления многослойных агарозных блоков на поверхности мини-стекол для микроскопии. Доступно по: https://yandex.ru/patents/doc/RU2558229C2_20150727. Ссылка активна на 05.10.2020.
7. Gapeyev AB, Lukyanova NA, Gudkov SV. Hydrogen peroxide induced by modulated electromagnetic radiation protects the cells from DNA damage. Cent. Eur. J. Biol. 2014;(9):915-921.
8. Чернигина И.А., Щербатюк Т.Г. Новая версия метода ДНК-комет // Современные технологии в медицине. 2016. Т.8. №1. С. 20-27. DOI: 10.17691/stm2016.8.1.03
9. Патент РФ на изобретение №2249445/10.04.053. Бюл. №10. Буранов С.Н., Горохов В.В., Карелин В.И., Селемир В.Д. Устройство для озонотерапии. Доступно по: https://yandex.ru/patents/doc/RU2249445C2_20050410. Ссылка активна на 05.10.2020.
