CC BY
41
Проблемы стоматологии The problems of dentistry
2017, т. 13, № 3, стр. 10-13 Терапевтическая стоматология / Therapeutic dentistry 2017, v. 13, № 3 pp. 10-13
© 2017, Екатеринбург, УГМУ Оригинальные исследования / Original research papers © 2017, Ekaterinburg, USMU
DOI: 10.18481/2077-7566-2017-13-3-10-13 УДК: 616.314-002-08
оценка цитотоксичности коллоидного раствора серебра, являющегося компонентом протравочного геля etchmaster ас
Згожиньска Э., Вальчевска А.
Лодзинский медицинский университет, г. Лодзь, Польша
Аннотация
Предмет. Проблема лечения вторичного кариеса постоянных зубов остается, несмотря на достигнутый в последние годы прогресс восстановительных технологий. Активную роль в патогенезе вторичного кариеса играют бактерии, обладающие протеолитическим действием, которые разжижают коллагеновые волокна в дентинной матрице. Актуальность изучения цитотоксичности серебра, входящего в состав стоматологического протравочного геля, продиктована клиническими потребностями врачей-стоматологов. Исследование проведено с целью определения концентрации, которая безопасна и дает терапевтический эффект.
Цель работы — определить in vitro на фибробластах десны человека цитотоксичность коллоидного раствора серебра, являющегося компонентом протравочного геля ETCHMASTER Ag.
Методология. В эксперименте использовали линию десневых фибробластов человека, полученных во время хирургического удаления гипертрофированной части десны у пациентов с затруднением прорезывания нижних зубов мудрости. В качестве исследуемого материала использовали наноколлоидный раствор серебра, содержащий 250 ppm nAg, имеющего размер частиц в диапазоне от 6 до 12 нм. Его цитотоксичность оценивали по стандартам: PN-EN ISO 10993-1, 2010 «Биологическая оценка медицинских изделий: оценка и тестирование в процессе управления рисками»; PN-EN IS010993-5, 2009 «Исследование цитотоксичности in vitro"; PN-EN ISO 10993-12, 2012 «Подготовка образца и сравниваемых материалов».
Результаты. Линия фибробластов, полученная непосредственно с десны человека, больше, чем коммерческие линии клеток, подходит для тестирования цитотоксичности стоматологической продукции, так как наиболее близка цитофи-зиологически в условиях in vitro к натуральным клеткам организма.
Из графика, представляющего зависимость ингибирования редукции МТТ от концентрации nAg, видно, что 9,4 ppm nAg тормозит редукцию соли тетразолия на 50% (EC50) во время инкубации клеток с испытуемыми растворами nAg в течение 24 часов.
Выводы данного исследования раствора nAg показали, что в течение 24-часового контакта с клетками цитотокси-ческая концентрация составляет > 8,3 ppm.
Ключевые слова: эмаль, дентин, кариес, протравочный гель, серебро.
assessment of cytotoxicity of colloidal silver solution is a component ofgel etchmaster ag
E. Zgozhinska, A. Valchevska
Medical University of Lodz (Poland, Lodz)
Abstract
Background The problem of treatment of permanent teeth's secondary caries remains topical, despite of the progress of the recovery technologies in recent years. An active role in the pathogenesis of secondary caries is played by bacteria that have a proteolytic effect and that dilute collagen fibers in the dentine matrix.
Адрес для переписки:
АБДУЛИНА Юлия Николаевна
620109, г. Екатеринбург, ул. Токарей, д. 31. Тел. +7 912 223 92 75 E-mail: asjn28@rambler.ru
Образец цитирования:
Згожиньска Э., Вальчевска А.
ОЦЕНКА ЦИТОТОКСИЧНОСТИ КОЛЛОИДНОГО
РАСТВОРА СЕРЕБРА, ЯВЛЯЮЩЕГОСЯ КОМПОНЕНТОМ
ПРОТРАВОЧНОГО ГЕЛЯ ETCHMASTER Ag
Проблемы стоматологии, 2017, т. 13, № 3, стр. 10-13
© Згожиньска Э. и др. 2017
Correspondence address: ABDULINA Yulia N.
«Urals State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation. 620028, Ekaterinburg, str. Tokarey, 31 + 7 912 223 92 75 E-mail: asjn28@rambler.ru
For citation:
Emilia Zgozhinska, Anna Valchevska
ASSESSMENT OF CYTOTOXICITY OF COLLOIDAL SILVER
SOLUTION IS A COMPONENT OFGEL ETCHMASTER AG
The problems of dentistry,
2017. Vol. 13, № 3, pp. 10-13
Згожиньска Э. и др. Zgozhinska Е. et al.
Проблемы стоматологии The problems of dentistry (Russia)
Relevance of this study is dictated by the clinical needs of dentists. A study of the cytotoxicity of silver nanocolloid as a component with which a dental etching gel was enriched, was conducted to determine the concentration that is safe and gives a therapeutic effect.
objective was to determine the cytotoxicity of the colloidal silver solution, which is a component of etchmaster Ag etching gel, in vitro on human gingival fibroblasts.
Methods. The experiment used a line of human gingival fibroblasts obtained during the surgical removal of the gingival's hypertrophied part of the patients which have a difficulty in eroding the lower wisdom teeth. A nanocolloid silver solution containing 250 ppm nAg and having a particle size in the range of 6 to 12 nm was used as the test material. The cytotoxicity of the silver nanocolloid solution was evaluated in accordance with the following standards: PN-EN ISO 10993-1: 2010 "Biological evaluation of medical devices: Evaluation and testing in the risk management process"; PN-EN IS010993-5: 2009 "In vitro cytotoxicity study"; PN-EN ISO 10993-12: 2012 "Preparation of sample and compared materials".
Results. The fibroblast line obtained directly from the human gingiva is more suitable than commercial cell lines, for testing the cytotoxicity of dental products, as it is cytophysiologically closer to the natural cells of the body in the condition in vitro.
According to the graph representing the inhibition of MTT reduction from nAg concentration, it is evident that 9.4 ppm nAg inhibits the reduction of the tetrazolium salt by 50% (EC50) during the incubation of the cells with the test nAg solutions for 24 hours.
Conclusions of this study of the nAg solution showed that during a 24-hour exposure to cells, the cytotoxic concentration is > 8.3 ppm.
Keywords: enamel, dentin, cavity, etching gel, silver.
Введение
Проведено исследование цитотоксичности стоматологического протравочного геля, производителем которого является лаборатория стоматологической фармакологии «АРКОНА» под руководством Гжегожа Кальбарчик. Стоматологический протравочный гель ETCHMASTER Ag — единственный стоматологический материал на рынке, обладающий особенностью снижения скорости появления вторичного кариеса за счет уменьшения количества микроорганизмов в кариозной полости. Улучшенная формула протравочного геля нано-частицами серебра размером от 6 до 12 нм при концентрации 5 ppm оказывает влияние на эффективность предотвращения образования краевой щели между тканями зуба и пломбой благодаря бактериостатическому действию на микроорганизмы, вызывающие кариес.
Цель проведенных исследований цитотоксичности наноколлоида серебра в качестве компонента протравочного геля — определение концентрации, которая безопасна и выше которой наноколлоидный раствор действует цито-токсично на клетки фибробластов десны человека.
материалы и методы
В эксперименте использована линия фибробластов десны человека. Клетки выращивали в DMEM Дуль-бекко в модификации Дульбекко [Dulbecco's Modified Eagle Medium с 4,5 г/л D-глюкозы, 3,7 г/л NaHCO3, пирувата натрия и стабильного глютамина (Biochrom AG)] с 10% FBS (эмбриональной бычьей сыворотки) и антибиотиков [пенициллин / стрептомицин (100 МЕ/ мл /100 мг/мл) (Biochrom AG)] при температуре 37° С в инкубаторе для выращивания клеток в атмосфере с 5% CO2. Среду в пластинах меняли каждые 2-3 дня. Через 8-10 дней, прошедших после помещения секции в чашки, фибробласты мигрировали из десневой ткани благодаря адгезии к поверхности используемого сосуда. Когда клетки покрыли приблизительно 50% поверхности используемого сосуда, ткань десны перенесли в новую чашку для культивирования, содержащую DMEM, 10% FBS и антибиотики, а клетки обработали трипсином с использованием камеры Бюркера и перенесли в колбы для инкубации. Перед введением кле-
точной линии в соответствии с PN-EN ISO 10993-5 (раздел 5) провели испытание на наличие микоплазм (MycoProbe Mycoplasma Detection Kit (R&DSystem)).
Анализ МТТ проводили на фибробласты десны прохода от 2 до 4, были получены от одного пациента и показали логарифмическую скорость деления. Регулярно проверяли морфологию клеток, измеряли поглощение при длине волны 570 нм в планшет-ридере. Жизнеспособность клеток (Х) рассчитали в соответствии со следующей формулой:
X = (Ар/Ak) х 100%,
где Ар — среднее поглощение испытуемого образца; Ак — среднее поглощение контрольного образца.
МТТ-анализ проводили в соответствии с PN-EN ISO 10993-5 (приложение С), инкубируя фибробласты с испытуемыми растворами в течение 24 часов. Данные рассчитывали с использованием статистической программы GraphPad v6 с минимум 6 повторениями для каждой концентрации NAG.
Результаты и их обсуждение
Протравочный гель ETCHMASTER Ag содержит наночастицы серебра размером от 6 до 12 нм, имеет форму геля с содержанием фосфорной кислоты 36-37% по массе. Окрашен в интенсивно синий цвет для того, чтобы был хорошо виден. Изделие содержит в своем составе коллоидное серебро в количестве 5 ppm.
Проведены многочисленные исследования in vitro и клинические испытания, направленные на проверку соответствия свойств и действий медицинского изделия основным требованиям и определение побочных действий, а также на оценку приемлемости создаваемого риска, учитывая назначение изделия и пользу для пациентов. Наносеребро добавлено в состав из-за его бак-териостатического действия и это единственное изменение в составе по сравнению с исходной формулой геля, присутствующего на рынке с 1997 г.
В ходе проведенных исследований с использованием геля ETCHMASTER Ag 5 ppm не обнаружено никаких побочных реакций ни в пульпе, ни в мягких тканях, поверхность пломбы и краевое прилегание остались без изменений. Не обнаружены также побочные/
Проблемы стоматологии 2017, Т. 13, № 3, стр. 10-13 © 2017, Екатеринбург, УГМУ
Терапевтическая стоматология / Therapeutic dentistry Оригинальные исследования / Original research papers
Рис. 1. График зависимости жизнеспособности десневых фибробластов от концентрации перекиси водорода, воздействующей на клетки в течение 2 часов (Zywotnosc fibroblastow - жизнеспособность фибробластов, Stezenie - концентрация).
Fig. 1. The graph of dependence of gingival fibroblasts' viability on the concentration of hydrogen peroxide which acts on the cells for 2 hours (Zywotnosc fibroblastow - the viability of fibroblasts, Stezenie - the concentration).
100 e 90 y 80 e 70 : 60 ! 50 % 40 ! 30
I 20-f 10 0
"4
7.9
15.8
mil I Stezenie 31.6 nAg [ppm]
Рис. 2. Кривая зависимости концентрации nAg в диапазоне от 4,2 до 25 ppm и ингибирование редукции МТТ после 24-часовой инкубации
фибробласты десны с растворами nAg. Fig. 2. The curve of the dependence of the nAg concentration in the range from 4,2 to 25 ppm and the inhibition of MTT reduction after the 24-hour incubation of gingival fibroblasts with nAg solutions.
аллергические реакции ни у одного из исследователей, персонала или пациентов, имеющих контакт с протравочным гелем ETCHMASTER Ag. На основании критерия значимости (испытание разумной разности Тьюки, на уровне значимости р<0,05) среднее число микроорганизмов после применения геля снизилось более чем в 7 раз.
Поэтому протравочный гель ETCHMASTER Ag по полученным данным является единственным продуктом на рынке, имеющим признак снижения скорости появления вторичного кариеса за счет уменьшения количества микроорганизмов.
Как известно, по биологическим свойствам нано-частиц серебра (цитотоксичность, бактерицидность) определяют такие характеристики, как размер, форму,
концентрацию и способность связываться друг с другом или другими частицами материала. Считается, что концентрация наночастиц является одним из факторов, влияющих на их антибактериальные и цитотоксические действия, которые проявляются изменениями в структуре ДНК или клеток [1, 2]. Наночастицы, имеющие малые размеры, распознаются рецепторами, присутствующими на поверхности клеток, в качестве собственных белков и с помощью эндоцитоза всасываются в клетку, где аккумулируются, вызывая хроническое воспаление [3, 4]. Этот же механизм имеет положительный эффект, приводящий к гибели бактерий [2].
Обзор имеющихся публикаций показывает, что цито-токсичность наночастиц серебра зависит от их размера. Исследование Хуссейна и др. [5] на клетках печени крысы показало, что концентрация Ag, которая снижает на 50% сокращение МТТ (ЕС50) частиц, имеющих размер 15 нм, составляет 24 ± 7,3 мг/мл. Кроме того, не обнаружено большой цитотоксичности полимеров polyvinylpyrrolidyny, покрытых слоем NAG, с размером частиц 8 и 38 нм на nicienie Caenorhabditis elegant по сравнению с цитотоксичностью металлического серебра и ионами серебра [6].
В качестве исследуемого материала использован наноколлоидный раствор серебра, имеющий начальную концентрацию 250 ppm nAg с величиной частиц в диапазоне от 6 до 12 нм. Раствор хранили в стеклянном контейнере, в защищенном от света месте, чтобы предотвратить окисление частиц серебра. Этот коллоид был предназначен для добавления к протравочному гелю, используемому в медицинских процедурах до 60 секунд. Таким образом, в соответствии с PN-EN ISO 10993-1 коллоид серебра имеет наружный контакт с твердыми тканями зуба.
Поскольку коллоид nAg представляет собой раствор, в соответствии с нормой PN-EN ISO 10993-12 проведено непосредственное исследование его цитотоксичности с помощью кривой биологической реакции фибробластов десны (кривая доза-эффект). В соответствии с этим же стандартом для определения цитотоксич-ности медицинских материалов, как и для правильного выполнения кривой доза-эффект, следует использовать отрицательный и положительный контроль. PN-EN ISO 10993-12 (приложение A) содержит справочный материал для отрицательного и положительного контроля, который может быть использован для выполнения цито-токсичности прямых и косвенных твердых веществ. В случае растворов, которые применяются непосредственно к клеткам (см. разделы 3.11 и 3.12 PN-EN ISO 10993-12), были использованы в качестве отрицательного контроля биологические реакции клеток, выращенных в чистой культуральной среде Игла (DMEM), что дает лучшие условия для роста клеток и воспроизводимые результаты. В качестве положительного контроля — перекись водорода (H2O2) в концентрации 7,5 тМ. Ранее определена ее 100-процентная эффективность в уничтожении фибробластов [7]. Ниже приведен график зависимости жизнеспособности десневых фибробластов от концентрации перекиси водорода, воздействующей на клетки в течение 2 часов, на основе ингибирования редукции соли тетразолия (МТТ).
Згожиньска Э. и др. Zgozhinska Е. et al.
Обозначенная кривая — зависимость доза-эффект исследуемого раствора nAg при использовании метода МТТ. Анализ МТТ основан на преобразовании 3- [4,5 -диметилтиазол-2 -ил]-2,5 -дифенилтетразолийбро -мида слегка желтого цвета до нерастворимого в воде фор-мазана фиолетового цвета. Редукция МТТ до формазана происходит пропорционально активности окислительно-восстановительных клеточных ферментов, зависимых от коферментов НАД+, НАДФ+ и ФАД, в том числе мито-хондриальной сукцинатдегидрогеназы. Этот тест точно отражает метаболические изменения в клетках, вызванные как изменениями внутренней среды клеток, так и внешней питательной среды (нехватка кислорода или глюкозы, не соответствующее рН, а также присутствие посторонних веществ, добавленных в питательную среду).
Выводы
Параметр ЕС50 — медиальная эффективная концентрация (статистически рассчитанная концентрация), которая индуцирует в медиум среды определенный эффект у 50% населения в определенных условиях (ингибирующее или стимулирующее физиологические процессы, такие как ферментативную активность, биолюминесценцию и т. д.). Этот параметр является наиболее надежным и сопоставимым между результатами цитоток-сичности, полученными в разных лабораториях, потому что он рассчитан по кривой доза-реакция в клетках. Тем не менее надо принимать во внимание различия в процессе самого измерения, например тип клеток, на которых изучали цитотоксичность. Линия фибробла-стов, полученная непосредственно с десны человека, больше, чем коммерческие линии клеток, подходит для тестирования цитотоксичности стоматологической продукции, так как наиболее близка цитофизиологически в условиях in vitro к натуральным клеткам организма.
Из графика, представляющего зависимость ингиби-рования редукции МТТ от концентрации nAg, видно,
Проблемы стоматологии The problems of dentistry (Russia)
Таблица
Жизнеспособность фибробластов в тесте МТТ после 24-часовой инкубации с коллоидом nAg
Table
The vitality of fibroblasts in MTT-test after 24-hour incubation with colloid nAg
Исследуемый Средняя продолжительность жизни фибробластов +/- SEM, ARE
раствор (% по отношению к отрицательному контролю)
Отрицательный контроль 99,9 +/- 0,36
nAg 4,2 ppm 94,8 +/- 1,48
nAg 5,0 ppm 89,0 +/- 1,02
nAg 6,2 ppm 82,8 +/- 1,84
nAg 8,3 ppm 69,9 +/- 2,37
nAg 10,0 ppm 41,9 +/- 4,14
nAg 12,5 ppm 12,9 +/- 5,15
nAg 16,7 ppm 11,9 +/- 4,21
nAg 25,0 ppm 14,3 +/- 3,82
Положительный
контроль (7,5 mM H2O2) 2,5 +/- 0,28
что 9,4 ppm nAg тормозит редукцию соли тетразолия на 50% (EC50) во время инкубации клеток с испытуемыми растворами nAg в течение 24 часов.
Стандарт PN-EN ISO 10933-5 в качестве цитотокси-ческой концентрации тестируемого соединения определяет такую, которая снижает жизнеспособность клеток по меньшей мере на 30%. Таким образом, данное исследование раствора nAg показало, что в течение 24-часового контакта с клетками цитотоксическая концентрация составляет > 8,3 ppm.
Литература (References)
1. Hamouda I. M. Current perspectives of nanoparticles in medical and dental biomaterials. J. Biomed. Res, 2012, vol. 26, pp. 143-151.
2. Pal S., Tak Y. K., Song J. M. Does the antibacterial activity of silver nanoparticles depend on the shape of the nanoparticle? A study of the Gram-negative bacterium Escherichia coli. App. Environ. Microbiol, 2007, vol. 73, pp. 1712-1720.
3. Pan Y., Neuss S., Leifer A., Fischler M., Wen F., Simon U., Schmid G., Brandau W., Jahnen-Dechent W. Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles. Small, 2007, vol. 3, pp. 1941-1949.
4. Coradeghini R., Gioria S., Garcia C. P., Nativo P., Franchini F., Gilliland D., Ponti J., Rossi F. Size-de-pendent toxicity and cell interaction mechanisms of gold nanoparticles on mouse fibroblasts. Toxicol. Lett, 2013, vol. 217, pp. 205-216.
5. Hussain S. M., Hess K. L., Gearhart J. M., Geiss K. T., Schlager J. J. In vitro toxicity of nanoparticles in BRL 3A rat liver cells. Toxicol. in Vitro, 2005, vol. 19, pp. 975-983.
6. Yang X., Gondikas A. P., Marinakos S. M., Auffan M., Liu J., Hsu-Kim H., Meyer J. N. Mechanism of Silver Nanoparticle Toxicity Is Dependent on Dissolved Silver and Surface Coating in Caenorhabditis elegans. Environ. Sci. Technol, 2012, vol. 46, pp. 1119-1127.
7. Zgorzynska E., Wierzbicka-Ferszt A., Dziedzic B., Witusik-Perkowska M., Zwolinska A., Janas A., Walczewska A. Docosahexaenoic fatty acid attenuates oxidative stress and protects human gingival fibroblasts against cytotoxicity induced by hydrogen peroxide and butyric acid.
Arch Oral Biol, 2015, vol. 60, pp. 144-153.
Авторы: Authors:
Згожиньска Эмилия ZGOZHINSKA Emilia
prof. UMLodziDr n. med., г. Лодзь, Польша Medical University of Lodz, prof. UM
Вальчевска Анна Lodzi Dr n. med., Lodz, Poland
prof. UM Lodzi Dr hab. n. med., г. Лодзь, Польша VALCHEVSKA Anna
Medical University of Lodz, prof. UM Lodzi
Dr hab.n.med., Lodz, Poland
Поступила 23.07.2017 Received
Принята к печати 15.08.2017 Accepted
