CC BY
16© Коллектив авторов, 2021 https://doi.org/10.29296/24999490-2021-03-08
ОЦЕНКА ЦИТОКИНОВОГО СОСТАВА СЫВОРОТКИ КРОВИ И ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ТРОМБОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА
Н.В. Боровкова, М.С. Макаров, Ю.В. Андреев, М.В. Сторожева, И.Н. Пономарев
ГБУЗ «Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения города Москвы», Российская Федерация, 129090, Москва, Б. Сухаревская пл., д. 3 Е-mail: mcsimmc@yandex.ru
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Боровкова Наталья Валерьевна — заведующая научным отделением. ГБУЗ «НИИ СП им. Н.В. Склифосовского ДЗМ». Доктор медицинских наук. Тел.: +7(916) 654-37-69. E-mail: BorovkovaNV@sklif.mos.ru. ORCID: 0000-0002-8897-7523
Макаров Максим Сергеевич — старший научный сотрудник. ГБУЗ «НИИ СП им. Н.В. Склифосовского ДЗМ». Кандидат биологических наук. Тел.: +7 (968) 473-91-05. E-mail: mcsimmc@yandex.ru. ORCID: 0000-0002-2184-2982
Андреев Юлий Вадимович — старший научный сотрудник отделения биотехнологий и трансфузиологии. ГБУЗ «НИИ СП им. Н.В. Склифосовского ДЗМ». Кандидат медицинских наук. Тел.: +7 (977) 788-14-66. E-mail: AndreevUV@sklif.mos.ru. ORCID: 0000-0001-8151-940X
Сторожева Майя Викторовна — научный сотрудник отделения биотехнологий и трансфузиологии. ГБУЗ «НИИ СП им. Н.В. Склифосовского ДЗМ». Тел.: +7 (903) 562-67-96. E-mail: StorozhevaMV@sklif.mos.ru. ORCID: 0000-0003-1927-2404
Пономарев Иван Николаевич — научный сотрудник отделения биотехнологий и трансфузиологии. ГБУЗ «НИИ СП им. Н.В. Склифосовского ДЗМ». Кандидат медицинских наук. Тел.: +7 (926) 281-12-40. E-mail: PonomarevIN@sklif.mos.ru. ORCID: 0000-0002-2523-6939
Введение. Тромбоциты человека потенциально обладают высоким репаративным и регенеративным потенциалом. Биохимический состав препаратов на основе тромбоцитов сильно зависит от способа его получения.
Цель исследования. Оценка цитокинового состава тромбоцитарных лизатов, полученных различными способами.
Метод. Из консервированной крови доноров-добровольцев получали 5 препаратов: богатую тромбоцитами плазму (БТП), БТПс высоким содержанием лейкоцитов (БТПВСЛ), бедную тромбоцитами плазму (БеднТП), плазму, выделенную путем пассивной седиментации клеточных компонентов (ППСКК); суспензию тромбоцитов, отмытых от плазмы (СТОП). Кроме того, у доноров забирали неконсервированную кровь для получения сыворотки. Тромбоцитарный лизат готовили путем криодеструкции клеток при -40/-80°С с последующей разморозкой проб при +2/+4°С в течение 12 ч и центрифугированием при 3000g.
Результаты. Показано, что лизаты БТП, БТП ВСЛ, СТОП имеют заметно более высокий уровень ростовых факторов по сравнению с сывороткой. В БеднТП концентрация IL 1alfa, VEGF и TGFa была выше, чем в БТП. На фоне высокой концентрации лейкоцитов в БТП ВСЛ значимо повышался уровень PDGF, а также провоспалительных интерлейкинов IL 6 и IL8, при этом уровень VEGF был снижен по сравнению с БТП. В лизатах ППСКК концентрация VEGF и FGF не отличалась от аналогичных значений в сыворотке и была ниже, чем в БТП и БеднТП. Отмывание тромбоцитов от плазмы увеличивало содержание PDGF, EGF, VEGF, FGF в тромбоцитарном лизате в 2,3—4,9раза. Выявлена сильная корреляционная связь между уровнем PDGF и EGF и общим содержанием тромбоцитов с гранулами в препаратах до криодеструкции. Общая концентрация тромбоцитов в БТП не коррелировала с концентрацией ни одного из исследованных цитокинов в лизате.
Заключение. Факторы роста могут быть получены как в составе БТП, так и БеднТП. Отмывание тромбоцитов от плазмы заметно повышает уровень факторов роста в конечном лизате.
Ключевые слова: тромбоциты, гранулы, цитокины, факторы роста, концентрация
COMPARING OF CYTOKINE CONTENT IN SERUM AND PLATELET SOLUBLE PREPARATIONS, PRODUCED IN DIFFERENT WAYS N.V. Borovkova, M.S. Makarov, Yu.V. Andreev, M.V. Storozheva, I.N. Ponomarev
N.V. Sklifosovsky Research Institute for Emergency Medicine of Moscow Healthcare Department, B. Sukharevskaya square, 3, Moscow, 129090, Russian Federation Е-mail: mcsimmc@yandex.ru
INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Borovkova Natalya Valer'evna — Head of scientific department. N.V. Sklifosovsky Research Institute for Emergency Medicine of Moscow Healthcare Department. PhD. Те1: +7(916) 654-37-69. E-mail: BorovkovaNV@sklif.mos.ru. ORCID: 0000-0002-8897-7523
Makarov Maksim Sergeevich — Senior scientific researcher. N.V. Sklifosovsky Research Institute for Emergency Medicine of Moscow Healthcare Department. PhD. Tel.: +7(968) 473-91-05. E-mail: mcsimmc@yandex.ru. ORCID: 0000-0002-2184-2982
Andreev Yuli Vadimovich — Senior scientific researcher. N.V. Sklifosovsky Research Institute for Emergency Medicine of Moscow Healthcare Department. PhD. Tel.: +7(977) 788-14-66. E-mail: AndreevUV@sklif.mos.ru. ORCID: 0000-0001-8151-940X
Storozheva Maya Vktorovna — Scientific researcher. N. V. Sklifosovsky Research Institute for Emergency Medicine of Moscow Healthcare Department. Tel.: +7(903) 562-67-96. E-mail: StorozhevaMV@sklif.mos.ru. ORCID: 0000-0003-1927-2404
Ponomarev Ivan Nikolaevich — Scientific researcher. N. V. Sklifosovsky Research Institute for Emergency Medicine of Moscow Healthcare Department. PhD. Tel.: +7(926) 281-12-40. E-mail: PonomarevIN@sklif.mos.ru. ORCID: 0000-0002-2523-6939
Introduction. Human platelets maintain big reparative and regenerative potential. The biochemical content of platelet preparations seriously depends on methodic features.
The aim of the study. To study cytokine content in different types of platelet soluble preparations and serum, harvested from donors-volunteers.
Methode. Conserved donors' blood was performed into 5 types of preparations: platelet-rich plasma (PRP), platelet-rich plasma with a high concentration of leucocytes (L-PRP), platelet-poor plasma (PPP), passively sedimented plasma (PasSP), platelet-rich suspension in non-plasmatic solution (PRS). We also harvested non-conserved blood for serum extraction. Platelet lysates were produced by cell cryodestruction at -40/-80C, followed by defrosting at +2/+4°C during 12 hours and 3000g centrifugation.
Results. Lysates of PRP, L-PRP, and PRS were shown to have an intensively higher level of growth factors, comparing to serum. Curiously, in PPP concentration of IL 1alfa, VEGF and TGFa were higher, than in PRP. The presence of leukocytes in PRP enhanced the level of PDGF and pro-inflammatory cytokines IL 6, IL 8 in lysates, whereas the level of VEGF in L-PRP was significantly decayed. In PasSP-lysates concentration of VEGF and FGF was similar to serum values and was rather lower, than in PRP and PPP. Platelet re-washing from plasma led to 2,3—4,9 times rise of PDGF, EGF, VEGF, FGF concentrations in PRS-lysates. We found a strong correlation between PDGF and EGF, VEGF, and TNFa in lysates, PDGF and EGF level also correlated with the concentration of platelets with granules in samples before cryodestruction. Common platelet concentration in PRP did not correlate with any one of the cytokines in the lysate.
Conclusion. Growth factors could be both elevated in PRP and PPP. Platelet rewashing significantly enhanced the volume of growth factors in the lysate.
Key words: platelets, granules, cytokines, growth factors, concentration
ВВЕДЕНИЕ
Биопрепараты на основе тромбоцитов человека представляют большой интерес для регенеративной медицины. Это обусловлено, в первую очередь, доступностью и легкостью получения данного вида биоматериала, а также широким спектром его возможного применения. Известно, что тромбоциты — это высоко дифференцированные клетки крови, основной функцией которых является участие в системе гемостаза [1]. Кроме того, тромбоциты играют значимую роль в регулировке многих биологических процессов в организме и репарации поврежденных тканей. Многофункциональность тромбоцитов обусловлена наличием большого количества биологически активных веществ (цитокинов), содержащихся в составе их гранул. К ним относятся факторы роста и дифференцировки клеток, про- и противовоспалительные цитокины и др. [2, 3]. Препараты на основе биологически активных компонентов тромбоцитов нашли широкое применение в травматологии, ортопедии, челюстно-лицевой хирургии, стоматологии, спортивной медицине, офтальмологии, косметологии [4—6]. Приоритет отдается препаратам, получаемым из аутологичных тромбоцитов, поскольку они обеспечивают лучшую биосовместимость и безопасность для пациента. В настоящее время для клинического применения рекомендованы богатая тромбоцитами плазма (БТП) и ее лизат, тромбофибриновый гель, богатая тромбоцитами и лейкоцитами плазма. Однако до сих пор остаются вопросы, связанные с оптимизацией методик приготовления препаратов
на основе тромбоцитов, а также выбором эффективной дозы препарата. Тромбоциты обладают высокой чувствительностью и реактивностью, поэтому в процессе подготовки биологического материала к клиническому применению может происходить разрушение тромбоцитов, а также их дегрануляция [1— 4]. Выделенные тромбоцитами цитокины являются весьма нестойкими соединениями и под воздействием внешних факторов способны быстро терять свою активность. Следовательно, до клинического применения необходима оценка качества препаратов на основе тромбоцитов, которая должна включать как морфофункциональные, так и биохимические характеристики. Целью данной работы было оценить ци-токиновый состав (уровень репаративных факторов), тромбоцитарных лизатов полученных различными способами.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В качестве источника тромбоцитов человека использовали венозную кровь доноров-добровольцев (возраст 28—50 лет), забранную из кубитальной вены и консервированную с ЭДТА. Также у доноров забирали неконсервированную кровь с целью выделения сыворотки. Сыворотку крови получали стандартным способом путем центрифугирования цельной неконсервированной крови доноров-добровольцев с ускорением 3000 % в течение 20 мин. Для пассивного выделения плазмы с тромбоцитами (ППСКК) консервированную кровь доноров-добровольцев экспонировали в вертикальном столбе жидкости в
течение 1 ч, с последующим отбором супернатант-ной плазмы.
Для получения богатой тромбоцитами плазмы (БТП) использовали базовую методику, включающую два этапа [7]. На первом этапе консервированную кровь центрифугировали 5 мин с ускорением 300 g и отбирали супернатантную плазму с тромбоцитами. На втором этапе отобранную плазму с тромбоцитами центрифугировали 17 мин с ускорением 700 g, в результате чего на дне формировался осадок тромбоцитов. Из пробирки отбирали верхнюю часть плазмы (плазма, бедная тромбоцитами, БеднТП), затем ресуспендировали осадок тромбоцитов в оставшемся объеме плазмы (БТП). Для получения БТП с высоким содержанием лейкоцитов (БТП ВСЛ) су-пернатантную плазму с тромбоцитами, выделенную после центрифугирования крови с ускорением 300 g, отбирали вместе с фракцией лейкоцитов. Помимо препаратов с тромбоцитами в плазме, получали препараты с высокой концентрацией тромбоцитов в бесплазменной среде. Для этого после центрифугирования плазмы при 700 g из полученных проб удаляли всю жидкую фракцию, а оставшийся осадок тромбоцитов ресуспендировали фосфатно-солевым раствором PBS (pH=7,3) или изотоническим 0,9% раствором хлорида натрия. Объем среды, вносимой для ресуспендирования, был равен объему удаленной плазмы. Полученные препараты представляли собой высококонцентрированную суспензию тромбоцитов, отмытых от плазмы (СТОП).
Процедура изготовления тромбоцитарных лиза-тов включала заморозку и хранение проб с тромбоцитами при температуре -40/-80°С, дефростирование проб в медленном режиме при +2/+4°С в течение 12 ч, центрифугирование проб при 3000 g в течение 20 мин с целью удаления всех клеточных фрагментов и отбор надосадка. В процессе оценки клеточных компонентов плазмы определяли следующие параметры: общая концентрация тромбоцитов, 109/л; общая концентрация лейкоцитов, 109/л; содержание тромбоцитов с гранулами (биологически полноценные тромбоциты), % и 109/л, адгезивная активность тромбоцитов, ААТ (баллы). Морфофунк-циональный анализ тромбоцитов проводили с помощью оригинального метода основанного на исследовании витально окрашенных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии [8]. Содержание цитоки-нов оценивали с помощью мультиплексного анализа на платформе Luminex 200 (технология xMAP), используя набор EMD Millipore's MILLIPLEXmap HUMAN Cytokine/Chemokine
Magnetic Bead Panel Kit. Определяли концентрацию тромбоцитарного фактора роста (PDGF), фактора роста фибробластов (FGF), эпидермальный фактор роста (EGF), трансформирующего фактора роста альфа (TGFa), фактора некроза опухолей альфа (TNFa), интерлейкинов (IL)-ap 6 (IL6), 8 (IL8), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). Результат выражали в пг/мл.
Для оценки различий использовали U-критерий Манна—Уитни и критерий Уилкоксона для связанных выборок. Различия значений считали достоверными при уровне значимости >95% (р<0,05).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На начальном этапе проводили морфофункцио-нальный анализ клеток исходной крови доноров, а также образцов БТП, БТП ВСЛ, СТОП, БеднТП, ППСКК, из которых впоследствии были получены лизаты. Предложенная двухэтапная процедура центрифугирования не вызывала значимого снижения качества тромбоцитов в итоговой БТП (см. таблицу), при этом данный способ позволял получить высококонцентрированную суспензию тромбоцитов. В образцах БТП и БТП ВСЛ общая концентрация тромбоцитов и содержание среди них клеток с гранулами значимо не различались (р>0,05). В образцах БеднТП концентрация тромбоцитов была в среднем в 19,4 раза ниже по сравнению с БТП. После отмывания тромбоцитов от плазмы не происходило значимого нарушения их качества — в образцах с отмытыми тромбоцитами общая концентрация клеток и их морфофункциональный статус были сопоставимы с тем, что наблюдалось в БТП (см. таблицу). В образцах, полученных путем пассивной седиментации, общая концентрация тромбоцитов была снижена в 2,3 раза по сравнению с БТП, тогда как концентрация лейкоцитов, напротив, была повышена.
Анализ цитокинового состава показал, что в сыворотке крови уровень всех ростовых факторов, за исключением PDGF, был низким и не превышал 100 пг/мл. При сравнении цитокинового состава сыворотки и тромбоцитарных препаратов выявлено,
Морфофункциональный анализ клеток плазмы, богатой и бедной тромбоцитами Morphofunctional analysis of platelet-rich and platelet-poor plasma cells
Тип образца Концентрация тромбоцитов, 109/л Концентрация лейкоцитов, 109/л Уровень тромбоцитов с гранулами, % ААТ, баллы
Исходная кровь 303 [290; 333]* 5,4 [5,1; 5,9]* 46 [40; 50] 45 [40; 48]
БТП 1668 [1147; 1679] 0,5 [0; 4,9] 40 [32; 50] 40 [30; 50]
БТП ВСЛ 1773 [1263; 1882] 21 [11,2; 25,0]* 44 [38; 49] 44 [38; 49]
БеднТП 86 [69; 87]* 0* 30 [30; 40]* 30 [30; 40]*
СТОП 1431 [1358; 1602] 0 [0; 2,3] 38 [35; 49] 38 [33; 48]
ППСКК 714 [668; 719]* 5,9 [5,6; 8,2]* 44 [44; 50] 43 [40; 50]
Примечание. * — p<0,05. Note. * - p<0,05.
9000 8000 7000 6000 S000 4000 3000 2000 1000 О
&
что концентрация всех исследуемых цитокинов в препаратах БТП и БТП ВСЛ была значительно выше, чем в сыворотке (рис. 1). В образцах БеднТП уровень PDGF был в 3 раза ниже по сравнению с сывороткой, однако концентрация всех остальных факторов в лизатах БеднТП достоверно превышала аналогичные значения для сыворотки. Образцы ППСКК значимо не отличались от сыворотки по уровню 1Ьа1, 1Ь6 и VEGF, образцы ОтмТр имели сходный с сывороткой уровень 1Ьа1, 1Ь6 и TGFа (рис. 1, 2). Концентрация всех остальных факторов в ППСКК и СТОП были достоверно выше, чем в сыворотке. В целом, можно заключить, что препараты с исходно высоким содержанием тромбоцитов (БТП, БТП ВСЛ, СТОП) содержали гораздо больше ростовых факторов по сравнению с сывороткой. Таким образом, ростовые факторы более оправдано выделять, используя концентрированные тромбоцит-содержащие препараты, а не сыворотку крови.
Между лизатами БТП и БеднТП главное различие наблюдалось по уровню PDGF и EGF — концентрация этих факторов в БТП была выше в 7,4 раза и в 9,1 раз соответственно (р<0,05). Концентрации FGF-2, 1Ь6, 1Ь8, ТОТа в БТП и БеднТП достоверно не различались, концентрация 1Ьа1 в БеднТП была в 2,8 раз выше, чем в БТП. Это может быть связано с частичной де-грануляцией тромбоцитов в процессе двухэтапного центрифугирования и выходом части факторов из тромбоцитов в плазму еще до криодеструкции клеток. Особенно любопытно, что лизаты БеднТП также имели более высокую концентрацию факторов VEGF и TGFa по сравнению с БТП. В среднем, уровень VEGF и TGFа в БеднТП превышал аналогичные значения для БТП в 1,45 раз и 2,45 раз соответственно (р<0,05). С учетом того, что VEGF и TGFa играют значительную роль в неоангиогене-зе, можно предположить, что лизат БеднТП может быть использован для стимуляции роста сосудов, наряду с БТП.
В образцах лизатов БТП ВСЛ был значительно увеличен уровень 1Ь6 и 1Ь8 по сравнению с БТП. Одновременно была выявлена корреляционная зависимость между содержанием лейкоцитов в БТП и концентрацией 1Ь8 в конечном лизате (Я=0,638, р=0,000). Концентрация других провоспалительных цитокинов — 1Ьа1 и TNFa значимо не отличалась от аналогичных значений в БТП (рис. 2). При этом по мере увеличения общей концентрации лейкоцитов наблюдался рост концентрации PDGF (Я=0,383, р=0,005); общий уровень PDGF в лизатах БТП ВСЛ
EGF
1 1
г • * * ^
-♦-»-
2 6
С к
1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
! FGF-2
<
т
< ► 5 * *
L J
г
5
с;
TGFalfa
< »
*
i I
-
4
г о
600 500 400 300 200 100
VEGF
* >
T i ► *
< js J *
k-f-
2 >-
О
ёооо
5000
4000
3000
2000
1000
PDGF
4
T
I
a * *
I
£ >-
О
Рис. 1. Содержание факторов роста в сыворотке и лизатах тромбоцитных препаратов разных типов (пг/мл). Пределы значений для сыворотки показаны полосой
Примечание. * — различия достоверны относительно БТП (критерий Ман-на—Уитни, р<0,05).
Fig. 1. Concentration of growth factors in serum and different types ofplatelet lysates (pg/ml). Line shows limits for serum.
Note: * — differences are significant (Mann—Whitney test, p<0,05).
был в среднем в 1,9 раза выше, чем в лизатах БТП. Особенно интересным является то, что в образцах БТП ВСЛ была снижена концентрация фактора роста эндотелия сосудов VEGF. Таким образом, наличие в БТП ВСЛ большого числа лейкоцитов увеличивает содержание ростового фактора PDGF, провоспали-тельных хемокинов IL6 и IL8 и заметно снижает содержание VEGF в конечном лизате. Это стоит учитывать при использовании тромбоцитных препаратов для стимуляции ангиогенеза.
В плазме, полученной путем пассивной седиментации (ППСКК), содержание всех ростовых факторов, за исключением TGFa, было меньше, чем в БТП. В первую очередь, это может быть обусловлено тем, что до криодеструкции клеток общее содержание тромбоцитов с гранулами в БТП было достоверно выше (в среднем в 2,2 раза) по сравнению с ППСКК. При этом уровень PDGF и EGF в конечных лизатах БТП и ППСКК также различался в 2,2—2,3 раза. Это еще раз подтверждает наше наблюдение о том, что после двухэтапного центрифугирования основной объем PDGF и EGF остается в составе тромбоцитов с
ILdi
4
4 к
Т Т
!
s >-
о
160 140 120 100 so
50 40 20 О
60
so
40
30
20
10
ILS f
1 *
< t * < t
¥
i ё 1 Ê 1 о ci s Jj о LÛ à> f- У m о £ |
Рис. 2. Содержание провоспалительных цитокинов в сыворотке и лизатах тромбоцитных препаратов разных типов (пг/мл). Пределы значений для сыворотки показаны полосой.
Примечание. * — различия достоверны относительно БТП (критерий Ман-на—Уитни, р<0,05)
Fig. 2. Concentration of pro-inflammatory factors in serum and different types of
platelet lysates (pg/ml). Line shows limits for serum.
Note. * — differences are significant (Mann—Whitney test, p<0.05).
гранулами. Вместе с тем, лизаты ППСКК содержали очень небольшое количество VEGF и FGF — концентрации этих факторов были достоверно ниже, чем в образцах БеднТП (р<0,05), хотя общая концентрация тромбоцитов с гранулами в ППСКК изначально была выше в 11,9 раза по сравнению с БеднТП (табл. 1). Как уже было отмечено, уровень VEGF в ППСКК не отличался от аналогичного параметра в сыворотке. При этом до криодеструкции образцы ППСКК содержали большое количество лейкоцитов, сопоставимое с тем, что было в исходной крови (табл. 1), которую также использовали для получения сыворотки. Влияние лейкоцитарного материала на ростовые факторы изучено недостаточно подробно и требует дальнейшего исследования.
В лизатах, где тромбоциты ресуспендировали в бесплазменной среде (СТОП), концентрация большинства ростовых факторов была заметно выше, чем в БТП: PDGF - в 4,2 раза, FGF - в 2,5 раза, EGF -в 4,9 раза, VEGF — в 2,3 раза соответственно (р<0,05). Одновременно с этим концентрация цитокинов 1Ьа1 снижалась в 3 раза, 1Ь 6 — в 1,6 раза (р<0,05). Таким образом, отмывание тромбоцитов от плазмы после двух-этапного центрифугирования позволило заметно увеличить содержание ростовых факторов и одновременно с этим частично снизить содержание провоспалительных интерлей-кинов в конечном тромбоци-тарном лизате. В целом предложенный способ двухэтапного центрифугирования позволяет получать тромбоцитарные ли-заты с высоким содержанием ростовых факторов. В лизатах отмытых тромбоцитов концентрация факторов PDGF, FGF, EGF, VEGF была наибольшей среди всех обследованных групп, что делает этот препарат наиболее перспективным для использования в регенеративной медицине.
Корреляционный анализ показал, что существует достоверная прямая связь концентраций PDGF и EGF как между собой (Я=0,801, р=0,000), так и с количеством функционально полноценных тромбоцитов с гранулами (для EGF — Я=0,626, р=0,000, для PDGF -Я=0,419, р=0,001). Таким образом, основным источником EGF и PDGF в крови являются функционально полноценные тромбоциты с гранулами.
г IL 6
t
<
* >-
I
S é.
, TNFalfa
< >
<
При этом концентрация EGF и PDGF в лизатах не коррелировала с общим количеством тромбоцитов в исходных образцах. Это указывает на то, что общая концентрация клеток в БТП не позволяет адекватно оценить репаративный потенциал препарата на основе тромбоцитов и необходимо проводить комплексный морфофункциональный анализ исходных тромбоцитов.
В процессе исследования лизатов выявлена сильная корреляционная зависимость между уровнем VEGF и TNFa (Я=0,757, р=0,000). Также VEGF коррелировал с FGF (Я=0,562, р=0,000) и в меньшей степени с PDGF (Я=0,289, р=0,018), что характерно для стимуляции ангиогенеза в норме и при опухолевом росте. Концентрация VEGF в лизатах связана также с провоспалительными цитокинами 1Ьа1 (Я=0,511, р = 0,000) и 1Ь6 (Я=0,320, р=0,002). Интересными представляются также взаимосвязи TGFa с TNFa (Я=0,610, р=0,0001), с VEGF (Я=0,526, р=0,0001), с провоспалительными цитокинами 1Ьа1 (Я=0,689, р=0,0001), 1Ь6 (Я=0,629, р=0,0001), 1Ь8 (Я=0,367, р=0,0001). TGFa менее изучен по сравнению с TGF бета. Известно, что TGFa на 30% повторяет гомологию EGF и относится к семейству эпидермальных факторов роста. TGFa связывается с рецепторами EGF и действует аналогично ему. TGFa и EGF участвуют в репаративных процессах поврежденной легочной ткани, контролируют воспаление, стимулируя продукцию интерлейкина 8 [2]. В то же время какой либо связи TGFa и EGF в нашей работе выявить не удалось (Я=-0,055, р=0,605).
В настоящее время сыворотку крови человека продолжают использовать в качестве источника ростовых факторов как при работе с культурой диплоидных клеток, так и при изготовлении биопрепаратов для регенеративной медицины [2]. Однако наши данные показывают, что препараты, полученные на основе высоконцентрированных суспензий тромбоцитов, содержат заметно больше факторов роста и дифференцировки по сравнению с сывороткой. Примечательно, что уровень многих ростовых факторов в БеднТП также превышал аналогичные показатели в сыворотке, хотя общее число тромбоцитов в БеднТП было заметно ниже, чем в крови, из которой была получена сыворотка. Известно, что, по крайней мере, часть тромбоцитарных компонентов выделяется в составе цельных микровезикул, способных к адгезии на фибрине в процессе образования сгустка. Такие везикулы закрепляются внутри фибриновой сети и не попадают в конечную сыворотку [9]. С другой стороны, сам процесс получения сыворотки занимает определенное время. За этот период возможно разрушение большого числа тром-боцитарных компонентов, особенно тех, которые выделяются в растворимом виде. Таким образом, для получения секретируемых тромбоцитами ростовых факторов представляется более оправданным использовать тромбоцит-содержащие препараты, а не сыворотку крови.
В процессе исследования было установлено, что двухэтапное центрифугирование при 300 и 700 g значимо не снижает качество тромбоцитов и не вызывает их необратимой активации в составе выделенной БТП. При этом секретируемые тромбоцитами факторы присутствуют не только в лиза-те препаратов с исходно высокой концентрацией клеток, но также в лизате БеднТП. Уровень VEGF и TGFa в БеднТП выше, чем в БТП и заметно выше, чем в сыворотке крови. Уже известно, что наряду с БТП репаративный эффект может оказывать плазма, необогащенная тромбоцитами (ПассПЛ), а также бедная тромбоцитами плазма [10, 11]. Это может быть во многом обусловлено частичным выходом гранул в процессе центрифугирования тромбоцитов при ускорении 700 g и выше [12]. Не исключено, что в БеднТП ростовые факторы попадают как в составе цельных гранул тромбоцитов, так и в растворенном виде, через открытую канальцевую систему тромбоцитов.
Необходимость наличия лейкоцитов в БТП до сих пор является дискутивной. С одной стороны, лизаты БТП ВСЛ содержат более высокий уровень репаративных цитокинов [3], в частности PDGF, что было подтверждено в нашем исследовании. С другой стороны, лейкоциты могут заметно повышать провоспалительный и проапоптотический эффект БТП [5, 6]. Мы установили, что по мере увеличения концентрации лейкоцитов в БТП возрастал уровень провоспалительных интерлейкинов. Кроме того, на примере образцов БТП ВСЛ и ПассПЛ можно видеть, что лейкоцитарный материал заметно снижает уровень VEGF в конечном лизате. В связи с этим использование лейкоцит-насыщенных БТП требует дальнейшего детального исследования, и может быть оправдано, там, где не требуется стимуляция ангиогенеза, например, при лечении дефектов роговицы.
В норме гранулы тромбоцитов содержат большое количество веществ, обладающих протеолитической активностью, которые в условиях плазмы крови могут вызывать быстрое расщепление факторов роста как при 37°C, так и при 20—22°C [13]. Кроме того, значительная часть ростовых факторов может быть сорбирована молекулами альбумина [14]. В связи с этим для повышения сохранности ростовых факторов представляется оправданным отмывать тромбоциты от плазмы до этапа криодеструкции. В лизатах отмытых тромбоцитов выявлена максимальная концентрация факторов роста из всех изученных препаратов на основе тромбоцитов человека. Вместе с тем, для оптимизации методик приготовления биопрепаратов с тромбоцитарными компонентами необходимо комплексное исследование биологического эффекта этих препаратов как in vitro, так и in vivo. Нужно признать, что содержание факторов роста и дифференцировки в лизате БТП может зависеть от многих параметров, в т.ч. — от режимов хранения и разморозки лизатов [15, 16]. Значительная часть
тромбоцитарных факторов является короткоживу-щими, поэтому любое изменение технологии подготовки лизата может влиять на их концентрацию. В результате концентрация одного и того же фактора в лизатах БТП может отличаться в 10 и более раз при сопоставимой общей концентрации тромбоцитов в исходных БТП.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Можно предположить, что биологический эффект компонентов БТП зависит не только от их объема, но и от соотношения разных факторов, а также
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Mehta S., Watson J.T. Platelet rich concentrate: basic science and current clinical applications. J Orthop Trauma. 2008; 22 (6): 432-8. DOI: 10.1097/ BOT.0b013e31817e793f.
2. Golebiewska E.M., Poole A.W. Secrets of platelet exocytosis - what do we really know about platelet secretion mechanisms? Br J Haematol. 2014; 165 (2): 204-16. DOI: 10.1111/bjh.12682.
3. Nurden A.T., Nurden P., Sanchez M., Andia I., Anitua E. Platelets and wound healing. Front Biosci. 2008; 13 (9): P. 3532-48.
4. Marx R.E. Platelet-rich plasma: evidence to support its use. J Oral Maxillofac Surg. 2004; 62 (4): 489-96. DOI: 10.1016/j. joms.2003.12.003.
5. Alsousou J., Thompson M., Hulley P., Noble A., Willett K. The biology of platelet-rich plasma and its application in trauma and orthopaedic surgery: a review of the literature. J Bone Joint Surg Br. 2009; 91 (8): 98796. DOI: 10.1302/0301-620X.91B8.22546.
6. Chellini F., Tani A., Zecchi-Orlandini S., Sassoli C. Influence of Platelet-Rich and Platelet-Poor Plasma on Endogenous Mechanisms of Skeletal Muscle Repair/Regeneration. Int J. Mol Sci. 2019; 20 (3): 683. DOI: 10.3390/ijms20030683.
7. Amable P.R., Carias R.B., Teixeira M.V., da Cruz Pacheco I., Correa do Amaral R.J., Granjeiro J.M., Borojevic R. Platelet-rich plasma preparation for regenerative medicine:optimization and quantification of cytokines and growth factors. Stem Cell Res Ther. 2013; 4 (3): 67. DOI: 10.1186/ scrt218.
8. Макаров М.С., Хватов В.Б., Высочин И.В., Кобзева Е.Н., Боровкова Н.В. Морфофункциональный анализ тромбоцитов человека с помощью витального окрашивания. Бюллетень
Для цитирования: Боровкова Н.В., Макаров М.С., Андреев Ю.В., Сторожева М.В., Пономарев И.Н. Оценка цитокинового состава сыворотки крови и препаратов на основе тромбоцитов человека. Молекулярная медицина. 2021; 19 (3): 51-57. hffps://doi. огд/10.29296/24999490-2021-03-08
от среды, в которой они находятся. Это указывает на необходимость стандартизации процедуры пробо-подготовки препаратов на основе тромбоцитов для клинического применения, а также необходимость
мониторинга качества исходных тромбоцитов.
* * *
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
Vestnik sluzby krovi Rossii. 2015; 1: 41-4 (in Russian)]
13. Melzer M. Lysosomes, growth factor activity, and carcinogenic implications. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 2012; 22 (4): 345-58. DOI: 10.1615/critreveukargeneexpr.v22. i4.70.
14. Kreuter J., Gelperina S. Use of nanoparti-cles for cerebral cancer. Tumori. 2008; 94: 271-7.
15. Сергеева Н.С., Шанский Я.Д., Свиридова И.К., Кирсанова В.А., Ахмедова С.А., Кувшинова Е.А., Мейснер И.С. Биологические эффекты тромбоцитарного лизата при добавлении в среду культивирования клеток человека. Гены и клетки. 2014; 9 (1): 77-85.
[Sergeeva N.S., Shanskiy Y.D., Sviridova I.K., Kirsanova V.A., Ahmedova S.A. Kuvshi-nova E.A., Meisner I.S. Biological effects of platelet lysate added to cultural medium of human cells. Gens and cells. 2014; 9 (1): 77-85 (in Russian)]
16. Шанский Я.Д., Сергеева Н.С., Свиридова И.К., Киракозов М.С., Кирсанова В.А., Ахмедова С.А., Антохин А.И., Чиссов В.И. Исследование лизата тромбоцитов человека как перспективной ростовой добавки
для культивирования стволовых и других типов клеток. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2013; 156 (1): 146-51 [Shanskii Y.D., Sergeeva N.S., Sviridova I.K., Kirakozov M.S., Kirsanova V.A., Akhmedo-va S.A., Antokhin A.I., Chissov V.I. Human platelet lysate as a promising growth-stimulating additive for culturing of stem cells and other cell types. Bull Exp Biol Med. 2013; 156 (1): 146-51. DOI: 10.1007/s10517-013-2298-7 (in Russian)]
Поступила 22 сентября 2020 г.
For citation: Borovkova N.V., Makarov M.S., Andreev Yu.V., Storozheva M.V., Ponomarev I.N. Сomparing of cytokine content in serum and platelet soluble preparations, produced in different ways. Mole-kulyarnaya meditsina. 2021; 19 (3): 51-57 (in Russian). hffps://doi. org/10.29296/24999490-2021-03-08
экспериментальной биологии и медицины. 2014; 156 (3): 409-12. [Makarov M.S., Kobzeva E.N., Vysochin I.V., Borovkova N.V., Khvatov V.B. Morphofunc-tional analysis of human platelets by vital staining. Bull Exp Biol Med. 2014; 156 (3): 409-12. DOI: 10.1007/s10517-014-2360 (in Russian)]
9. Kamykowski J., Carlton P., Sehgal S., Storrie B. Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet alpha-granules. Blood. 2011; 118 (5): 1370-3. DOI: 10.1182/ blood-2011-01-330910.
10. Shahidi M., Vatanmakanian M., Arami M.K., Sadeghi Shirazi F., Esmaeili N., Hydarporian S., Jafari S. A comparative study between platelet-rich plasma and platelet-poor plasma effects on angiogenesis. Med Mol Morphol. 2018; 51 (1): 21-31. DOI: 10.1007/ s00795-017-0168-5.
11. Конторщикова К.Н., Шахова К.А., Янченко О.С., Тихомирова Ю.Р., Булат В.В., Булат А.В. Определение тромбоцитарных факторов роста в необогащенной тромбоцитами плазме. Медицинский альманах. 2018; 53 (2): 41-4. [Kontorschikova K.N., Shakhova K.A., Yanchenko O.S., Tikhomirova Y.R., Bulat V.V., Bulat A.V. Determination of platelet-derived growth factors in platelet unenriched plasma. Medical Almanac. 2018; 53 (2): 41-4 (in Russian)]
12. Макаров М.С., Боровкова Н.В., Хватов В.Б., Кобзева Е.Н. Влияние центрифугирования на биологическую полноценность тромбоцитов человека. Вестник службы крови России. 2015; 1: 41-4.
[Makarov M.S., Borovkova N.V., Khvatov V.B., Kobzeva E.N. Effect of centrifugation on the biological value of human platelets.
